プロテオリポソームベースの流出アッセイのClの単一分子特性を決定する<sup> -</sup>チャネルとトランスポーター
Summary
Proteoliposomes are used to study purified channels and transporters reconstituted in a well-defined biochemical environment. An experimental procedure to measure efflux mediated by these proteins is illustrated. The steps to prepare proteoliposomes, perform the recordings, and analyze data to quantitatively determine the functional properties of the reconstituted protein are described.
Abstract
The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as from eukaryotes. This increase has been largely driven by the successful push to obtain structural information on membrane proteins. However, the ability to functionally interrogate these proteins has not advanced at the same rate and is often limited to qualitative assays of limited quantitative value, thereby limiting the mechanistic insights that they can provide. An assay to quantitatively investigate the transport activity of reconstituted Cl– channels or transporters is described. The assay is based on the measure of the efflux rate of Cl– from proteoliposomes following the addition of the K+ ionophore valinomycin to shunt the membrane potential. An ion sensitive electrode is used to follow the time-course of ion efflux from proteoliposomes reconstituted with the desired protein. The method is highly suited for mechanistic studies, as it allows for the quantitative determination of key properties of the reconstituted protein, such as its unitary transport rate, the fraction of active protein and the molecular mass of the functional unit. The assay can also be utilized to determine the effect of small molecule compounds that directly inhibit/activate the reconstituted protein, as well as to test the modulatory effects of the membrane composition or lipid-modifying reagents. Where possible, direct comparison between results obtained using this method were found to be in good agreement with those obtained using electrophysiological approaches. The technique is illustrated using CLC-ec1, a CLC-type H+/Cl– exchanger, as a model system. The efflux assay can be utilized to study any Cl– conducting channel/transporter and, with minimal changes, can be adapted to study any ion-transporting protein.
Introduction
最後の二つの過剰発現および膜輸送タンパク質を精製する能力が劇的に増加している数十年：イオンチャネル、プライマリとセカンダリのトランスポーターは、現在日常的に異種発現系、ならびに天然の供給源から精製される。これらのタンパク質の安定性を、発現をモニタリング改善し、抽出を容易にし、強化するための新しいアプローチが常に1-5開発されている。これらの技術革新は、順番に、その機能の構造的な拠点の我々の理解を高め、膜タンパク質上の原子レベルの構造情報の爆発をトリガーに尽力している。対照的に、我々の能力は、いくつかの場合において、高分解能の構造情報をこのように定量的構造に基づいた予測をテストする我々の能力を制限する、定性機能的データが付随するように、同じ割合で増加しなかった精製されたタンパク質の機能的特性をプローブする。したがって、developmen定量的および一般化機能アッセイのtは膜タンパク質機能のメカニズムの基盤の解明に向けた重要なステップである。
チャネルおよびトランスポーター–ここでは、定量的に精製され、再構成されたCl -の主要な機能的特性を決定するために用いることができる流出アッセイを記載する。アッセイの基礎となる原理は、輸送システムの様々な、ならびに非イオン輸送タンパク質に一般化することができる。チャネル/大型のClの存在下でのトランス– –リポソームは、精製されたClで再構成する勾配（ 図1A、B）。のCl –の流出は、我々の場合K +イオノフォアバリノマイシンに、対イオン流束を可能にするために、イオノフォアを添加することによって開始のClによって確立された電圧をシャントれている–勾配及びKの平衡電位に初期の膜電位を設定する+ 6,7。トンなしそれは膜電位の発生により阻止されるように流出が発生し、 –彼は有意な正味のClをイオノフォアん。 –流出、およびf 0、活性タンパク質を含有しないリポソームの割合τ、Cl -の時定数：データは、定量的に2測定可能なパラメータ（ 図1C）によって記載されている。 τおよびf 0から一体のCl –輸送速度、活性タンパク質の画分と活性複合体の分子量は8導出することができる。既知の構造および機能の交換–技術はCLC-EC1、よく特徴付けCLC型H + / Clで再構成されたプロテオリポソームを用いて、ここに示されている。このアッセイは、容易に又は活性電圧および/またはリガンドの存在に依存して異なるイオン選択性チャネルまたは輸送体に一般化される。さらに、このアッセイは、小分子は、直接再構成タンパク質に影響を与えるかどうかを決定するために用いることができるこれらの化合物の効果を定量する方法、および膜組成物又は脂質修飾試薬は、再構成されたチャネルおよび輸送体の機能に影響を与える。
Protocol
Representative Results
Discussion
精製された陰イオン選択的チャネルまたはリポソーム中に再構成トランスポーターによって媒介輸送–私たちは、詳細はClを測定するためのプロトコルを記載している。交換CLC-EC1 –使用例は、原核生物のH + / CLだった。検討中のイオンに適したものでAgCl電極ただし、方法論は、容易にリガンド12,13,15、電圧11,12、またはAgを交換することによって、異なる…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grant GM085232 and an Irma T. Hirschl/ Monique Weill-Caulier Scholar Award (to A.A.).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Liposomicator, Avanti Polar Lipids Inc. | Avanti Polar Lipids Inc. | 610200 | |
| IEC Centra CL2 Benchtop | Thermo Scientific | ||
| Orion Research Model 701A Digital pH-mV meter | These can be found on Ebay. | ||
| Non-functional pH probe | Any pH meter probe with silver wires will work. The glass/plastic coating needs to be removed and the wires cleaned. | ||
| DI-710 Data Logger | DATAQ instruments | ||
| WinDAQ acquisition software | DATAQ instruments | ||
| Pierce Disposable Plastic Columns, Gravity-flow, 2ml | Pierce (Thermo Scientific) | 29922 | |
| KIMAX Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass | Kimble Chase | 73500-13100 | |
| Extruder Set With Holder/Heating Block | Avanti Polar Lipids Inc. | 610000 | |
| Computer |
References
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