En Proteoliposome-Based utstrømning analysen fastslår Single-molekyl Egenskaper til Cl^- Kanaler og Vogner

Summary

Proteoliposomes are used to study purified channels and transporters reconstituted in a well-defined biochemical environment. An experimental procedure to measure efflux mediated by these proteins is illustrated. The steps to prepare proteoliposomes, perform the recordings, and analyze data to quantitatively determine the functional properties of the reconstituted protein are described.

Abstract

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as from eukaryotes. This increase has been largely driven by the successful push to obtain structural information on membrane proteins. However, the ability to functionally interrogate these proteins has not advanced at the same rate and is often limited to qualitative assays of limited quantitative value, thereby limiting the mechanistic insights that they can provide. An assay to quantitatively investigate the transport activity of reconstituted Cl^– channels or transporters is described. The assay is based on the measure of the efflux rate of Cl^– from proteoliposomes following the addition of the K⁺ ionophore valinomycin to shunt the membrane potential. An ion sensitive electrode is used to follow the time-course of ion efflux from proteoliposomes reconstituted with the desired protein. The method is highly suited for mechanistic studies, as it allows for the quantitative determination of key properties of the reconstituted protein, such as its unitary transport rate, the fraction of active protein and the molecular mass of the functional unit. The assay can also be utilized to determine the effect of small molecule compounds that directly inhibit/activate the reconstituted protein, as well as to test the modulatory effects of the membrane composition or lipid-modifying reagents. Where possible, direct comparison between results obtained using this method were found to be in good agreement with those obtained using electrophysiological approaches. The technique is illustrated using CLC-ec1, a CLC-type H⁺/Cl^– exchanger, as a model system. The efflux assay can be utilized to study any Cl^– conducting channel/transporter and, with minimal changes, can be adapted to study any ion-transporting protein.

Introduction

I de to siste tiårene har evnen til å overuttrykker og rense membrantransportproteiner har dramatisk økt: ionekanaler, grunnskoler og videregående transportører er nå rutinemessig renset fra heterologe ekspresjonssystemer samt naturlige kilder. Nye metoder for å overvåke uttrykk, forbedre og legge til rette for utvinning og forbedre stabiliteten av disse proteinene utvikles stadig ^1-5. Disse teknologiske gjennombrudd har vært medvirkende i å utløse eksplosjonen av atom-nivå strukturell informasjon på membran proteiner som i sin tur, forbedret vår forståelse av de strukturelle grunnlaget for deres funksjon. I motsetning til vår evne undersøke de funksjonelle egenskaper av de rensede proteiner ikke øke i samme takt, slik at i noen tilfeller med høy oppløsning strukturell informasjon er ledsaget av kvalitative funksjonelle data, og dermed begrense vår evne til kvantitativt å teste strukturbaserte prediksjoner. Derav, development av kvantitative og generaliseres funksjonelle analyser er et viktig skritt mot klarlegging av de mekanistiske fundamentet for membran protein funksjon.

Her beskriver vi en utstrømning assay som kan brukes til å kvantitativt bestemme viktige funksjonelle egenskaper av renset og rekonstituert Cl ^– kanalene og transportører. Prinsippene som ligger til grunn for analysen kan generaliseres til en rekke transportsystemene, så vel som til ikke-ion-transport av proteiner. Liposomer blir rekonstituert med rensede Cl ^– kanal / transportører i nærvær av et stort Cl ^– gradient (figur 1A, B). Cl ^– utstrømning blir initiert ved tilsetning av en ionofor for å tillate motion fluks, i vårt tilfelle er K ⁺ ionofor valinomycin, som shunt spenningen etablert av Cl ^– gradient og sette den første membranpotensialet til likevektspotensialet i K ^{+ 6,7.} Uten tHan ionofor ingen vesentlig netto Cl ^– utstrømning oppstår, da det er hindret ved generering av et transmembranpotensialet. Dataene er kvantitativt beskrevet av to målbare parametere (Figur 1c): τ, er tidskonstanten av Cl ^– dyseutstrømningen, og f _0, en fraksjon av liposomer som ikke inneholder et aktivt protein. Fra τ og f ₀ den enhetlige Cl ^– ransporthastighet, kan fraksjonen av aktive proteiner, og den molekylære massen av den aktive komplekse utledes ^8. Den teknikk som er illustrert her ved hjelp av proteoliposomes rekonstituert med CLC-EC1, et godt karakterisert CLC-type H ⁺ / Cl ^– varmeveksler av kjent oppbygning og funksjon. Denne analysen er lett generaliseres til kanaler eller transportører med forskjellige ioniske selektivitet eller hvis virksomhet er avhengig av nærvær av spenning og / eller ligander. Videre kan denne analysen anvendes for å bestemme om små molekyler direkte påvirke den rekonstituerte protein,for å kvantifisere effekten av disse forbindelsene og hvordan membran sammensetning eller lipid modifiser reagenser påvirke funksjonen av de rekonstituerte kanaler og transportører.

Protocol

1. Lipid Forberedelse Delmengde ønsket mengde lipider i et klart glass tube. Bruk E. coli polar lipidekstrakt, men de fleste lipid-blandinger kan anvendes. Hvis lipidene er i pulverform, resuspendere dem i kloroform til en konsentrasjon på 20 mg / ml. Tørk lipidene ved RT under N2 gass inntil alt løsningsmidlet er fordampet. Resuspender lipidene i pentan og tørker det igjen en jevn strøm av gass N2 for å fjerne restene spor av kloroform. Tørke til alle løsemid…

Representative Results

Vi beskriver en detaljert og robust protokoll for å måle Cl – transport mediert av renset CLC-EC1, en ​​prokaryote CLC-type H + / Cl – leren, rekonstruert i liposomer. En skjematisk fremstilling av forsøket er vist i figur 3 Proteoliposomes rekonstituert med renset CLC-EC1 og inneholder høy intern Cl -. Er nedsenket i et bad oppløsning inneholdende lav Cl -. Under disse betingelser net Cl – utstrømning hindres ved oppbygging av …

Discussion

Vi har beskrevet en detaljert protokoll for å måle Cl ^– transport mediert av rensede anion-selektiv kanaler eller transportører rekonstituert i liposomer. Eksempelet som ble brukt var prokaryote H ⁺ / Cl ^– veksler CLC-EC1. Imidlertid kan metoden lett tilpasses for å studere kanaler styrt av ligander ^{12,13,15, 11,12} spenning, eller sports forskjellige anioniske selektivitet ^15,16 ved å erstatte Ag: AgCl-elektrode med en egnet for det ion som betraktes. Elektrode…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Liposomicator, Avanti Polar Lipids Inc.	Avanti Polar Lipids Inc.	610200
IEC Centra CL2 Benchtop	Thermo Scientific
Orion Research Model 701A Digital pH-mV meter			These can be found on Ebay.
Non-functional pH probe			Any pH meter probe with silver wires will work. The glass/plastic coating needs to be removed and the wires cleaned.
DI-710 Data Logger	DATAQ instruments
WinDAQ acquisition software	DATAQ instruments
Pierce Disposable Plastic Columns, Gravity-flow, 2ml	Pierce (Thermo Scientific)	29922
KIMAX Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass	Kimble Chase	73500-13100
Extruder Set With Holder/Heating Block	Avanti Polar Lipids Inc.	610000
Computer