Un Proteoliposoma Basada Eflujo Ensayo para determinar una sola molécula Propiedades de Cl<sup> -</sup> Canales y Transportadores
Summary
Proteoliposomes are used to study purified channels and transporters reconstituted in a well-defined biochemical environment. An experimental procedure to measure efflux mediated by these proteins is illustrated. The steps to prepare proteoliposomes, perform the recordings, and analyze data to quantitatively determine the functional properties of the reconstituted protein are described.
Abstract
The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as from eukaryotes. This increase has been largely driven by the successful push to obtain structural information on membrane proteins. However, the ability to functionally interrogate these proteins has not advanced at the same rate and is often limited to qualitative assays of limited quantitative value, thereby limiting the mechanistic insights that they can provide. An assay to quantitatively investigate the transport activity of reconstituted Cl– channels or transporters is described. The assay is based on the measure of the efflux rate of Cl– from proteoliposomes following the addition of the K+ ionophore valinomycin to shunt the membrane potential. An ion sensitive electrode is used to follow the time-course of ion efflux from proteoliposomes reconstituted with the desired protein. The method is highly suited for mechanistic studies, as it allows for the quantitative determination of key properties of the reconstituted protein, such as its unitary transport rate, the fraction of active protein and the molecular mass of the functional unit. The assay can also be utilized to determine the effect of small molecule compounds that directly inhibit/activate the reconstituted protein, as well as to test the modulatory effects of the membrane composition or lipid-modifying reagents. Where possible, direct comparison between results obtained using this method were found to be in good agreement with those obtained using electrophysiological approaches. The technique is illustrated using CLC-ec1, a CLC-type H+/Cl– exchanger, as a model system. The efflux assay can be utilized to study any Cl– conducting channel/transporter and, with minimal changes, can be adapted to study any ion-transporting protein.
Introduction
En las últimas dos décadas la capacidad para sobreexpresar y purificar las proteínas de transporte de membrana ha aumentado dramáticamente: canales iónicos, transportadores primario y secundario están ahora purificaron rutinariamente a partir de sistemas de expresión heterólogos, así como de fuentes naturales. Constantemente se están desarrollando nuevos enfoques para controlar la expresión, mejorar y facilitar la extracción y mejorar la estabilidad de estas proteínas 1-5. Estos avances tecnológicos han sido fundamentales en el desencadenamiento de la explosión de la información estructural a nivel atómico en las proteínas de membrana que, a su vez, mejorado nuestra comprensión de las bases estructurales de su función. En contraste, nuestra capacidad para investigar las propiedades funcionales de las proteínas purificadas no aumentó en la misma proporción, de modo que en algunos casos alta resolución información estructural está acompañada por datos funcionales cualitativos, lo que limita nuestra capacidad para probar cuantitativamente predicciones basadas en la estructura. Por lo tanto, la development de ensayos funcionales cuantitativos y generalizables es un paso clave hacia la elucidación de las bases mecanicistas de la función de las proteínas de membrana.
Aquí se describe un ensayo de flujo de salida que se puede utilizar para determinar cuantitativamente propiedades funcionales clave de purificado y reconstituido Cl – canales y transportadores. Los principios subyacentes del ensayo se pueden generalizar a una variedad de sistemas de transporte, así como a las proteínas no-iónicos transporte. Los liposomas se reconstituyen con purificados Cl – canal / transportadores en la presencia de un gran Cl – gradiente (Figura 1A, B). Cl – flujo de salida se inicia mediante la adición de un ionóforo para permitir flujo de contra-ión, en nuestro caso el K + valinomicina ionóforo, que la tensión de derivación establecido por el Cl – y establecer el gradiente de potencial inicial membrana para el potencial de equilibrio de K + 6,7. Sin tque ionóforo no significativa Cl neta – flujo de salida se produce, ya que se evita mediante la generación de un potencial transmembrana. Los datos se describe cuantitativamente por dos parámetros medibles (Figura 1C): τ, la constante de tiempo de eflujo de Cl -, y f 0, la fracción de liposomas que no contienen una proteína activa. De τ f 0 y el unitaria Cl – velocidad de transporte, la fracción de proteínas activas y la masa molecular del complejo activo se pueden derivar 8. La técnica se ilustra aquí usando proteoliposomas reconstituidos con CLC-EC1, un bien caracterizado de tipo CLC H + / Cl – intercambiador de la estructura y función conocida. Este ensayo se generaliza fácilmente a los canales o transportadores con diferente selectividad iónica o cuya actividad depende de la presencia de voltaje y / o ligandos. Además, este ensayo se puede usar para determinar si las moléculas pequeñas afectan directamente a la proteína reconstituida,para cuantificar los efectos de estos compuestos y cómo composición de la membrana o de los reactivos modificadores de lípidos afectan a la función de los canales y transportadores reconstituidas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos descrito un protocolo detallado para medir la Cl – transporte mediado por canales o transportadores reconstituidas en liposomas aniones selectiva purificados. El ejemplo utilizado fue el procariota H + / Cl – Intercambiador CLC-ec1. Sin embargo, la metodología se puede adaptar fácilmente para estudiar canales cerrados por ligandos 12,13,15, 11,12 tensión, o deportivo selectividad diferente aniónico 15,16 sustituyendo el Ag: electrodo AgCl con uno adecuado …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grant GM085232 and an Irma T. Hirschl/ Monique Weill-Caulier Scholar Award (to A.A.).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Liposomicator, Avanti Polar Lipids Inc. | Avanti Polar Lipids Inc. | 610200 | |
| IEC Centra CL2 Benchtop | Thermo Scientific | ||
| Orion Research Model 701A Digital pH-mV meter | These can be found on Ebay. | ||
| Non-functional pH probe | Any pH meter probe with silver wires will work. The glass/plastic coating needs to be removed and the wires cleaned. | ||
| DI-710 Data Logger | DATAQ instruments | ||
| WinDAQ acquisition software | DATAQ instruments | ||
| Pierce Disposable Plastic Columns, Gravity-flow, 2ml | Pierce (Thermo Scientific) | 29922 | |
| KIMAX Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass | Kimble Chase | 73500-13100 | |
| Extruder Set With Holder/Heating Block | Avanti Polar Lipids Inc. | 610000 | |
| Computer |
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