Abstract
병아리 융모 막 (CAM)는 CAM이 종양 이식을위한 이상적인 시스템을 만들고, 자연 면역 결핍 높은 혈관입니다 수정 후 7 일째에 의해 개발을 시작하여 하루 (12)에 의해 성숙. 또한, CAM은 그것을 종양 침윤과 전이를 연구하는 매력적인 모델을 만드는 등 피브로넥틴, 라미닌, 콜라겐, 인테그린 알파 (V) 베타 3, 및 MMP-2와 같은 세포 외 기질 단백질을 포함하고 있습니다. 과학자들은 긴 혈관 신생의 모델로서 사용하여 CAM의 생리 학적 장점을 가지고있다. 최근 CAM 검정 기본 체외 일 더 복잡한 동물 암 모델을 절충 각종 암 이종 이식 생체 내 모델 시스템으로 동작하도록 변형되었다. CAM 분석은 비용과 시간이 효과적이다 중요한 생물학적 시스템에서 종양 성장, 항 종양 치료 및 종양 친 분자 경로의 연구 허용한다. 여기서, 우리는 CAM의 젠의 개발을 기술최대 93 %의 배아 생존율하고 신뢰할 수있는 종양과 간세포 암 (HCC)의 ograft 모델은 세 가지 차원, 혈관 종양의 성장을 선도 걸릴.
Introduction
간세포 암종 (HCC)은 세계에서 1 암 사망률 제 3 주요 원인이다. 현재 간암 환자의 30 %가 잠재적으로 치료 수술 치료 (2)을받을 수 있으며, 전신 항암 화학 요법은 3 효과가 없습니다. 따라서, 새로운 간암 치료 용 임상 가압 충족해야하고, 새로운 에이전트의 효율적인 시험에 적합한 모델 시스템의 개발이있다. 병아리 융모 막 (CAM) 시험은 생체 내에서 잠재적 인 항암 약물을 시험의 재현성, 비용 효율적이고 빠른 중간 처리 방법을 제공한다.
CAM 혈관 형성 검정은 4를 연구하기 위해 광범위하게 사용되고있다. 또한 성공적 5 아교 모세포종, 췌장암 6 흑색 7-9, 10-11 및 골육종을 포함한 암의 종양 이종 이식 모델로 개발되었다. 모두 비켜 (12)과 전 비켜에서13 기술은 프로토콜과 프로토콜에 다양한 세부 사항, 문헌에 이용되어왔다. 50 % 11 ~ 14 - 캠 이종 이식 모델에 하나의 주요 과제는 25에 이르기까지 출판 된 병아리 배아 사망률, 계란의 조작 후 배아 사망의 상대적으로 높은 발병률이다.
이 글에서, 우리는 확실하게 조직 학적 분화 간세포 암과 유사한 입체, 혈관 종양의 성장을 생산 간세포 암의 이종 이식 모델 비켜에서의 개발을 설명합니다. 우리는 먼저 Ossowski 등. (14)에 의해 기술 된 프로토콜을 적용하고 매우 높은 종양 생착으로 최대 93 %의 병아리 배아 생존율을 달성했다.
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Protocol
1. 계란 부화
- 팔일 된 무균 유정란을 얻습니다.
- 계란 트레이, 위쪽으로 향하게 스탬프 끝을 회전에 알을 놓고 계란 인큐베이터 내부의 회전 트레이를 배치합니다. 36 ° C에서 48 시간 50 %의 습도 알을 품어.
2. CAM을 삭제하고 계란 열기
- 인큐베이터에서 계란을 수집합니다. 달걀 랙에 넣어 달걀, 최대 측면을 각인하고, 층류 후드에 가져다.
- 룸과 후드 등을 끕니다.
- CAM의 혈관뿐만 아니라 공기 주머니를 노출 계란 캔 들러 가볍게 계란의 스탬프 끝을 잡고.
참고 : 계란 캔 들러가 개발 배아 및 관련 공기 주머니와 혈관을 시각화하는 데 사용되는 광원이다. - 두 개의 주요 혈관 사이에 연필 표시를합니다.
- 불을 켜고 PE에서 공기 주머니 (스탬프 끝) 위의 계란의 팁과 하나의 구멍에 하나의 구멍을 만들기 위해 멸균 고정 핀을 사용ncil 마크. 푸시 핀을 통해 모든 방법을 밀어하지 마십시오 3mm 주위에 구멍이 깊은 일반적으로 충분합니다.
- 불을 끄십시오. 공기 주머니 위의 구멍에 꽉 열린 끝을 눌러 안전 전구를 짠다. CAM은 연필 마크에서 멀리 쉘에서 드롭하는 원인, 연필 마크의 구멍으로 공기를 끌어 흡입을 적용합니다.
- 공기 주머니가 캔 들러를 사용하여 연필로 표시된 구멍에 계란의 스탬프 끝에서 이동 한 것을 확인합니다. 그렇지 않은 경우, 안전 전구를 사용하여 흡인을 다시 적용한 후 두 구멍 약간 깊게 만들어하는 푸시 핀을 사용한다.
- 불을 켜다. 부착 된 15/16 인치 컷 - 오프 휠 드레 멜 로터리 툴을 켜고 쉘을 통해 잘라 그냥 깊은만큼 두 가로 삭감을하지만 충분히 깊은하지가 우울에 이르기까지 모든 방법을 잘라, 한 손에 계란을 잡고 CAM. 서로 떨어져 길이 2cm과 1cm 주위의 상처를 확인합니다. 직경 1cm 실리콘 링을 통과 할 수 있도록 충분히 넓은 상처를 확인표준 스카치 테이프의 폭보다하지만 얇은.
- 다음, 가볍게 쉘 컷 - 오프 휠을 만져 사이에 두 가로 인하의 끝에서 1 종 컷을합니다.
- 쉘 쉘 조각 및 병렬에서 멸균 집게를 밀어 넣습니다. 집게로 껍질 조각을 잡고 깨끗하게 전체 조각을 제거합니다.
- 제거의 용이성을 위해 자체에 한쪽 끝을 통해 접어 확인하고, 새로 열린 창을 통해 스카치 테이프를 놓습니다.
- 다시 인큐베이터 (NOT 회전 달걀 랙에서) 계란 트레이에 접종 때까지 장소 달걀.
3. 예방 접종
- 이러한 매트 리겔과 같이, 지하 세포막 단백질 혼합물을 얼음에 보관 후드 (중합 반응을 방지하기 위해) 및 장소.
- 5 분 동안 조직 문화 인큐베이터에서 - (T75 플라스크 당 5 ㎖의 4) 장소 플라스크 세포를 분리하는 2 mM의 EDTA를 사용합니다.
- 미디어에서 분리 된 세포를 재현 탁하고 혈구와 트리 판 블루를 사용하여 계산합니다. 500,000t 사이에 사용캠에 접목 세포주에 따라 2,000,000 세포 오. 예비 실험에서 적절한 수를 최적화 할 수 있습니다.
- 5 분 동안 500 XG에 적절한 휴대폰 번호와 원심 분리기에 필요한 측정 볼륨.
- 뜨는을 취소하고 다음 PBS의 40 μ L ++ 및 기저막 혼합물의 20 μ L에서 세포 펠렛을 재현 탁.
참고 : 셀 / 기저막 혼합물 현탁액에 재현 탁하여 실험에 필요에 따라이 시점에서, 세포는 약물 또는 다른 테스트 제로 처리 될 수있다. 또한, 에이전트는 이식 후 세포 / 지하 막 혼합물 서스펜션에 분주 할 수 있습니다. - 층류 후드의 보육과 장소에서 계란 계란 랙을 검색합니다.
- 껍질 테이프 창 떨어져, 멸균 집게를 사용하여 극저온 유리 병의 뚜껑에서 1mm 실리콘 링을 검색하고, 창을 통해 반지를 놓습니다.
- 피펫 PBS의 60 μ L 셀 솔루션 ++ 및 기저막 mixtur직접 CAM에 휴식 실리콘 링의 중심으로 전자.
- 다시 테이프 창을하는 인큐베이터에 다시 계란 랙을 이동합니다. 쉽게 치환 될 수있는 링과 세포 현탁액으로 계란을 이동할 때이 시점에서주의하십시오.
- 종양이 5-7일에 대한 성장하도록 허용합니다.
4. 수확 종양
- 후드 아래에 패드를 놓습니다. 조직학에 필요한 35 X 10mm 판과 파라 포름 알데히드 용기를 준비합니다. 각 35 X 10mm 판에 1 ml의 PBS ++를 넣습니다.
- 후드에서 생물 학적 가방을 놓습니다. 멸균 해부 가위를 가지고 스탬프 끝 부분 구멍에 계란에 뾰족한 끝을 삽입합니다.
- 길이 방향 전체 계란 주위에 잘라.
참고 : 링과 캠과 종양이 창 쉘의 상단 절반에 충실해야한다. - 해부 가위와 집게를 사용하여, 멀리 CAM에서 종양을 해부하고, 35 X 10mm 판에서 종양을 배치합니다. 측정하고 종양의 무게. paraformaldehy에 고정 종양드 후 조직 학적 및 면역 조직 화학 실험에 사용할 수 있도록 파라핀-포함.
5. (선택 사항) : 종양 세포 해리
- 35 X 10mm 판에서 종양을 말하다 해부 가위를 사용합니다. 15 ㎖의 원심 분리기 튜브에 다진 종양을 붓고 피펫을 통해 가능한 ++ 많은 PBS를 제거합니다.
- (PBS에 1 ㎎ / ㎖ ++) 콜라게나 제 2 mL를 넣어 여러 번에 걸쳐 튜브를 켜고 (몇 시간까지) 적어도 30 분 동안 37 ° C에서 튜브를 품어.
- 각각의 튜브에 5 ml의 미디어를 추가하고 아래로 (20)로 pipetting에 의해 철저하게 재현 탁 - 40 배를. 철저한 피펫은 완전한 세포 분리 중요하다.
- 침전물이 정착 할 수 있도록 허용하고, 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다. 5 분 500 XG에 원심 분리기. 해리 세포 펠렛을 남겨두고, 상층 액을 제거합니다.
주 :이 시점에서, 세포 펠릿을 각종 실험에 사용될 수있다 (유동 세포 계측법, 웨스턴 블 롯팅, RNA 분리 등의 용도 용해). 전체 종양 세포 수는 혈구 및 트립 판 블루 염색을 이용하여 얻어 질 수있다. 작은 타원형 셀 닭 세포이며 CAM으로부터 종양 세포로 간주되어서는 안된다는 참고. 종양이 조심스럽게 CAM에서 멀리 해부 경우 비 종양 (CAM) 세포를 오염 최소한이 있어야한다.
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Representative Results
프로토콜의 주요 단계의 대표 사진이 여기에 표시됩니다. 그림 1A는 배아, 공기 주머니와 CAM의 혈관을 시각화하기 위해 캔 들러의 사용을 보여줍니다. 그림 1B-1c는 만들어 CAM을 삭제하는 과정을 보여 두 개의 구멍 후 안전 전구를 사용하여 부압을인가하고,도 1d는 성공적 연필 마크 구멍 하에서 큰 기포로 CAM 떨어 나타낸다.도 1E 및도 1F는 필요한 있도록 드레 멜 회전 공구의 사용을 보여 공기 거품과 내에서 노출 된 혈관 캠 셸에서 열린 창 위의 껍질에 상처.
입체, 종양 혈관 성공적 인간 간암 세포주 HUH7 (도 2A-2B)과 PLC / PRF / 5 (도 2C-2D)를 사용하여 배양 하였다. HUH7와 PLC / PRF / 5 세포에서 성장 종양 안녕하세요stologically 분화 간세포 암 (그림 2E-2F)를 닮은 또한 마우스 이종 이식 모델 (15, 16)에서 재배 HUH7와 PLC / PRF / 5 종양과 유사. 또한, 종양 중량의 사용은 종양 중량이 높은 콜라게나 제 (도 3)를 사용하여 종양의 완전한 분리 후의 총 종양 세포 수와 관련되었음을 증명하여 종양 크기의 측정으로 확인 하였다.
이 프로토콜을 이용하여 최대 93 %의 태아 생존율이 달성되었다 (표 1). 표 1은 CAM 이종 이식 모델에서 세 개의 분리 된 실험 HCC로부터 데이터를 집계. 성공적으로 500,000 종양 세포 (HUH7 또는 PLC / PRF5)로 이식되었다 (33) 계란의 개 가운데 단 3 달걀은 병아리 배아 죽음에 90.9 %의 생존율을 초래. 또한, 종양은 매우 안정적으로 생존 배아 계란의 100 % (30/30)로 성공적으로 종양 형성했다 5 일 후 성장했다.
그림 1. CAM을 삭제하고 셸에서 창을 엽니 다. (A) 배아 식별 (파란색 화살표)과 혈관 (검은 화살표) 셸에 구멍을 만드는 캔 들러, (B), (C) 자연 발생 공기 골목에서 홀에 적용 흡입하여, (D) 시각화 멀리 셸에서 CAM의 성공적인 떨어 뜨리 표시 기포는, (E - F). 드레 멜 로터리 도구를 사용하여 셸에서 창을 열고 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. C오전 3 차원의 성장, 혈관을 종양은 그 조직 학적 미분화 간세포 암과 유사 지원합니다. 카메라 모델, HUH7 세포 5 일 후에 - (B) 종양 성장 (500,000 셀 시드) (스케일 바 = 1cm), (C - D) 카메라 모델은 5 일 후 종양의 성장, PLC / PRF / 5 세포 (500,000 셀 시드) (스케일 바 = 1cm), HUH7와 PLC의 (E-F) 조직학 / PRF / 5 각각 종양 (스케일 바 = 100 μ M) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
세포 수. 종양 무게 대 종양 무게의 그림 3. 플롯은 매우 collagenas 후 전체 종양 세포 수와 상관 관계전자 해리.
| 계란의 총 수 | 병아리 배아의 생존과 계란의 비율 | 종양의 비율은 생존 배아와 계란에 걸릴 | |
| HUH7 | (27) | 92.6 % (27분의 25) | 100 % (25/25) |
| PLC / PRF / 5 | (6) | 83.3 % (5/6) | 100 % (5/5) |
| 전체 | (33) | 90.9 % (30/33) | 100 % (30/30) |
종양의 표 1. 배아 생존 요금과 요금은 두 사람의 간세포 암 세포주를 사용하여 카메라 모델에 가져 가라.
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Discussion
이 프로토콜의 몇 가지 주요 단계는 대부분 개선 된 배아의 생존뿐만 아니라 종양 성장의 신뢰성 증가를 차지하고있다. 공기 주머니에 흡입을 적용하여 멀리 쉘에서 CAM을 삭제하면 (계란, 무딘 절개 등으로부터 알부민을 제거하기 위해 바늘을 사용) 기존의 방법보다 덜 침습적입니다. 이 방법에 필요한 두 개의 작은 구멍을 만들기 위해 멸균 푸시 핀을 사용하는 프로토콜의 가장 어려운 부분이다. 너무 많은 힘을 사용하면 푸시 핀 오버 침투를 통해 CAM과 혈관에 손상을 줄 수 있습니다 또는 균열 또는 계란을 파괴 될 수 있습니다. 체험 연습 푸시 핀을 사용하여 캠을 떨어 뜨리고에서 첫 번째 시도 중에 실수를 최소화 할 수 있습니다 비 수정 된, 식료품-구입 계란에 작은 구멍을 확인합니다. 또, 에탄올 또는 셸을 청소하는 다른 살균제 용액의 사용은 배아 생존율을 감소하고, 피해야한다. 마지막으로, 멸균 실리콘 링을 사용하면 ℃로# 8220; "가축 종양의 높은 비율로 종양의 성장에 도움을 파종하고 기여 후 하나의 특정 위치에 종양 세포는 우리의 프로토콜에서 볼 걸릴.
다른 세포주 및 / 또는 약물로 작업 할 때 프로토콜의 중요한 단계 중 일부 최적화는 대부분 필요합니다. 시드에 대한 세포의 수는 제안 된 0.5과 2,000,000 사이이지만, 일부 세포주 좋은 입체 종양을 형성하기 위해 더 높거나 더 낮은 시딩 밀도를 필요로 할 수있다. 너무 많은 세포를 이식하면 종양, 전체 실리콘 링을 차지 이상적인 것보다 더 평평한 적은 입체되고, 링의 경계를 피할 수있는 종양의 과증식을 초래할 수있는 반면 너무 적은 세포를 이식하면, 불량한 종양 형성 될 수 있습니다 . 우리는 특정 세포주에 대한 최적의 시딩 세포 밀도를 결정하는 예비 실험 설정을 권장합니다. 또한, 시험관 내에서의 약물 농도 기준 일부 조정이 필요할 수있다D. 우리는 CAM (60 μL)에 시딩 전량을 참조하여 약물 농도를 계산하지만, 시험관 내에서 평행 실험에서 사용되는 것보다 때로는 "높은"약물 농도는 아마도 인해, 종양 성장에 효과를보기 위해 필요한 계란의 나머지 CAM 및 약물의 분산을 통해 흡수.
특정 세포주 및 약물에 대한 프로토콜의 최적화에 성공 후, CAM 이종 이식 모델은 종양 세포의 특성 및 다양한 기법을 조사하는데 사용될 수있다. 종양 성장은 중량과 크기의 측정뿐만 아니라 합계 종양 세포 수를 통해 평가 될 수있다. 종양은 고정 및 종양 표지자 또는 관심의 특정 단백질 얼룩 면역 조직 화학 염색을 실시 할 수있다. 혈관 신생은 특히 병아리 내피 세포 (17) 얼룩 SNA1에 대한 염색하여 평가 될 수있다. 종양 세포는 분자 경로의 심문 용해 될 수있다. 이러한 소성을 동물 모델로서 암의 더 복잡한 모델 체외 작업 순수한 브리지에서의 중간 단계로서, CAM 이종 이식 모델은보다 빨리 생물학적 배양에서 배양 세포보다 관련 설정 데이터를 획득하는 비용 효율적인 방법이다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Premium incubated eggs | Charles River | N/A | http://www.criver.com/files/pdfs/avian/av_c_spf_egg_price_list.aspx |
| Egg incubators | GQF | Hova-Bator 2362N | |
| Rotating egg trays | GQF | 1611 Automatic Egg Turner | |
| Egg candler | Lyon | Hi-Power 950-070 | |
| Dremel 100 rotary tool with 15/16 cut-off wheel | Dremel | 100-N/7 | |
| Sterile forceps, push pin, dissection scissors, Scotch tape | |||
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Cryogenic vials, external thread with silicone washer | Corning | 430659 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C9891 |
References
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