Abstract
Хорионалантоисной мембрана (CAM) начинает развиваться на 7 день после оплодотворения и созревает день 12. САМ естественно иммунодефицитом и высокой васкуляризации, что делает его идеальной системой для имплантации опухоли. Кроме того, CAM содержит белки внеклеточного матрикса, таких как фибронектин, ламинин, коллаген, интегринового альфа (v) Beta3 и ММР-2, что делает его привлекательным модель для изучения опухолевой инвазии и метастазированию. Ученые давно воспользовались физиологии CAM, используя его в качестве модели ангиогенеза. Совсем недавно, САМ-анализ был изменен, чтобы работать, как в естественных условиях ксенотрансплантанта модельной системы для различных видов рака, что устраняет разрыв между основной работой в пробирке и более сложных моделях рака животное. Анализе САМ позволяет для изучения роста опухоли, противоопухолевых терапий, и про-опухолевых молекулярных путей в биологически соответствующей системы, которая одновременно экономически и время эффективным. Здесь мы опишем развитие CAM Xenograft модель гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) с эмбриональными выживаемости до 93% и надежной опухоли занимают ведущие к росту трехмерных, васкуляризированных опухолей.
Introduction
Гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) является 3-й ведущей причиной смертности от рака в мире 1. В настоящее время только 30% пациентов с ГЦК из имеют право на потенциально лечебных хирургических методов лечения 2 и системная химиотерапия не эффективна 3. Таким образом, существует настоятельная неудовлетворенная клиническая необходимость в новых ГЦК терапии, и развитие модельных систем, пригодных для эффективного тестирования новых агентов. Хорионалантоисной мембрана (CAM) анализ обеспечивает воспроизводимое, экономически эффективной, и быстрый метод средней пропускной тестирования потенциальных лекарств против опухолевых в естественных условиях.
САМ тест широко используется для изучения ангиогенеза 4. Это также успешно превратилась в модели ксенотрансплантата опухоли раковых заболеваний, в том числе глиобластомы 5, рак поджелудочной железы, меланомы 6 7-9 и 10-11 остеосаркомы. И в яйце 12 и экс ово13 методы были использованы в литературе, с деталями из различных протокола для протокола. Одна из основных задач в модели CAM ксенотрансплантанта является относительно высокий уровень эмбриональной смерти после манипуляций с яйцом, с опубликованным тарифам куриных эмбрионов смертности, начиная от 25 - 50 процентов 11-14.
В этой статье мы опишем разработку ин ово модели ксенотрансплантата ГЦК, которые надежно производит рост трехмерных, васкуляризированных опухолей, которые гистологически напоминают недифференцированные HCC. Мы адаптировали протокол, впервые описанного Ossowski соавт. 14 и добились куриных эмбриональных выживаемости до 93% с чрезвычайно высокой приживления опухоли.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Яйцо Инкубационный
- Получить 8 день старые конкретного патогена яиц с эмбрионами.
- Поместите яйца в яйца лоток вращения, штампованные концы вверх, и поместите поднос вращающийся внутри яичной инкубатора. Выдержите яйца в течение 48 ч при 36 ° С и 50% влажности.
2. Падение CAM и открытие яйца
- Соберите яйца из инкубатора. Место яйца в яйца стойки, штамп стороной вверх, и довести до ламинарный.
- Выключите в комнате и капот фары.
- Держите штамп конец яйца слегка яйца Кандлер подвергать сосудистой САМ, а также воздушный мешок.
ПРИМЕЧАНИЕ: яйцо Кандлер является источником света для визуализации развивающийся эмбрион и связанного воздушный мешок и сосудистую. - Поставьте карандашом отметку в между двумя крупными кровеносными сосудами.
- Включите свет и использовать стерильные толчок булавку, чтобы сделать одно отверстие на кончике над воздушный мешок (отметка конца) яйца и одно отверстие в реncil знак. Не нажимайте нажимной штифт весь путь через; отверстие около 3 мм глубиной, как правило, достаточно.
- Выключите свет. Сожмите безопасности лампы, нажав открытый конец плотно к отверстию над воздушным мешком. Применить всасывания тянуть воздух в отверстие на карандаш марки, в результате чего САМ отказаться от оболочки на карандаш марки.
- Убедитесь, что воздушный мешок переехала из штампованной конце яйца в карандашом отмечены отверстие с помощью Candler. Если это не так, используйте толчок штифт, чтобы оба отверстия чуть глубже, а затем повторно применить всасывание с помощью безопасности лампу.
- Включить свет. Проведение яйцо в одной руке, включите Dremel вращающегося инструмента с 15/16 дюйма светотеневой колесо, прикрепленное и сделать два поперечных разрезов только достаточно глубоко, чтобы прорезать оболочку, но не достаточно глубоко, чтобы сократить весь путь вниз к депрессии CAM. Сделать разрезы около 2 см в длину и 1 см друг от друга. Сделайте разрезы достаточно широк, так что силиконовые кольца на 1 см в диаметре может пройти черезно тоньше, чем ширина стандартной скотча.
- Далее, чтобы сократить 1 между продольной и на концах двух поперечных разрезов, слегка касаясь отрезной круг к оболочке.
- Slide стерильного пинцета под оболочки элемента и параллельно к корпусу. Возьмите кусок раковины с пинцетом и удалить весь кусок чисто.
- Поместите скотч на вновь открытом окне, убедившись, что складывать один конец более на себе для простоты удаления.
- Место яйца в инкубаторе назад в яичном лотке (а не в вращающихся стоек яиц) до времени прививки.
3. Прививка
- Держите базальную мембрану белка смесь, например, матригеле, на льду (для предотвращения полимеризации) и место в шкафу.
- Использование 2 мМ ЭДТА, чтобы отделить клетки (4 - 5 мл на колбу Т75) и поместите в колбах культуры тканей инкубаторе в течение 5 мин.
- Ресуспендируют отдельные клетки в средствах массовой информации и рассчитывать с использованием гемоцитометра и трипановым синим. Используйте между 500000 тO 2000000 клеток для прививки на САМ, в зависимости от клеточной линии. Оптимизация нужное количество в предварительных экспериментах.
- Измерьте объем требуется для соответствующего числа клеток и центрифуге при 500g в течение 5 мин.
- Удалите супернатант и затем ресуспендируют осадок клеток в 40 μ л PBS ++ и 20 μ л базальной мембраны смеси.
Примечание: В этот момент клетки могут лечить с помощью препаратов или других агентов испытаний при необходимости для экспериментов путем ресуспендирования клеток в / базальной мембраны смеси суспензии. Кроме того, агенты могут быть пипеткой на сотовый / базальной мембраны смеси суспензии после прививки. - Получить яйцо стойку с яйцами из инкубатора и место в капюшоне ламинарного потока.
- Пил ленты от окна, получить 1 мм силиконовой кольцо с крышки криогенного флаконе с использованием стерилизованных пинцетом, и падение кольцо через окно.
- Внесите 60 μ л раствора ячейка PBS ++ и базальной мембраны Mixturе непосредственно в центре кольца силиконовой покоится на САМ.
- Re-лента окно и перейти яйцо стойку обратно в инкубатор. В этот момент, соблюдайте осторожность при перемещении яйца, как кольца и клеточной суспензии может легко стать перемещенными лицами.
- Разрешить опухоли расти в течение 5 до 7 дней.
4. Сбор Опухоли
- Место под-площадку в капот. Подготовка 35 х 10 мм пластин и ПАРАФОРМАЛЬДЕГИДОМ контейнеры по мере необходимости для гистологического исследования. Положите 1 мл PBS ++ в каждом 35 х 10 мм пластины.
- Поместите биологически опасных сумку в капот. Возьмите ножницы рассечение стерильные и вставьте заостренный конец в яйце в отверстие рядом с печатью конца.
- Сокращение вокруг всей яйца в продольном направлении.
ПРИМЕЧАНИЕ: САМ, и опухоль с кольцом должны придерживаться верхней половине корпуса с окном. - Использование рассечение ножницами и щипцами, рассекать опухоль от CAM и поместите опухоль в мм пластины 35 х 10. Измерьте и весят опухоли. Исправлены опухоли в paraformaldehyде, а затем парафин-вставлять их для использования в гистологии и иммуногистохимии экспериментов.
5. (Необязательно): опухоль сотовый Диссоциация
- Используйте рассечение ножницами, чтобы фарш опухоль в мм пластины 35 х 10. Налейте измельченным опухоль в 15 мл центрифужную пробирку и удалить столько PBS ++, как это возможно через пипетки.
- Добавляют 2 мл коллагеназы (1 мг / мл в PBS ++), повернуть трубку несколько раз, и инкубируют трубку при 37 ° С в течение не менее 30 мин (до нескольких часов).
- Добавьте 5 мл средства массовой информации в каждую пробирку и ресуспендируют тщательно с помощью пипетки вверх и вниз 20 - 40х. Тщательное пипетки является критическим для полной диссоциации клеток.
- Разрешить оседать, и передавать супернатант в новую пробирку. Центрифуга при 500 мкг в течение 5 мин. Удалить супернатант, оставляя позади диссоциированного гранул клеток.
Примечание: В этот момент, клеточные осадки могут быть использованы для различных экспериментов (проточной цитометрии, лизиса для использования в вестерн-блоттинга, выделения РНК, и т.д.), Общее количество опухолевых клеток может быть также получено с помощью гемоцитометра и окрашивания трипановым синим. Следует отметить, что мелкие, овальные клетки клетки кур от CAM и не должны считаться опухолевых клеток. Там должно быть минимальное количество загрязняющих неопухолевые (САМ) клетки, если опухоль отсечен от CAM тщательно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представительства фотографии основных этапов в протоколе приведены здесь. 1А демонстрирует использование Кандлер визуализации развивающийся эмбрион, воздушный мешок, и сосудистую САМ. 1В-1С показывают процесс падения CAM путем два отверстия, а затем применяя отрицательное давление с помощью предохранительного лампы, а на рис 1D показывает успешно упала CAM с большим пузырем воздуха под карандаш отмечены отверстия. Рис 1E и рис 1F демонстрации использования в Dremel вращающегося инструмента, чтобы сделать необходимое сокращение выше пузырька и открывшемся окне в оболочке с открытой васкуляризированной CAM в оболочке.
Трехмерные, васкуляризированных опухоли успешно выращивают с использованием клеточных линий человека ГЦК HuH7 (2А-2В) и ПЛК / PRF / 5 (рис 2С-2D). Опухоли, выращенные из HuH7 и PLC / PRF / 5 клеток приветstologically напоминают недифференцированные HCC (рис 2E-2F), а также напоминают HuH7 и ПЛК / PRF / 5 опухолей, выращенных в моделях мыши ксенотрансплантатных 15,16. Кроме того, использование веса опухоли была подтверждена как измерение размера опухоли, продемонстрировав, что масса опухоли была сильно коррелирует с общего количества опухолевых клеток, полученной после полной диссоциации с использованием коллагеназы опухолей (рисунок 3).
Используя этот протокол, эмбриональные выживаемость до 93% были достигнуты (таблица 1). Таблица 1 показывает, сводные данные из трех отдельных экспериментах ГЦК в модели ксенотрансплантата САМ. Из в общей сложности 33 яиц, что были успешно привиты 500000 опухолевых клеток (HuH7 или ПЛК / PRF5), только 3 яйца привело куриного эмбриона смерти, общий уровень выживаемости 90,9%. Кроме того, опухоли очень надежно выращивают через 5 дней, а 100% (30/30) яиц с эмбрионами выживших были успешно образование опухоли.
Рисунок 1. Падение CAM и открытие окна в доспехах. (А) Идентификация эмбриона (Голубая стрела) и сосудистой (черная стрелка) с помощью Candler, (б) сделать отверстие в оболочке, (C) Подача всасывания в отверстие в Естественно-происходящих воздушный мешок (D) Визуализация Пузырь воздуха Показаны Успех сбрасывание CAM от Shell (E - F). Открытие окна в доспехах, используя Dremel Rotary Tool Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. СМ. поддерживает рост трехмерных, васкуляризированных Опухоли, которые Гистологически Походите недифференцированных HCC. (A - B) Рост опухоли после 5 дней в модели CAM, клетки Huh7 (500000 клеток высевали) (масштабные линейки = 1 см), (C - D) Рост опухоли после 5 дней в модели CAM, PLC / PRF / 5 клетки (500000 клеток высевали) (масштабные линейки = 1 см), (Е-F) Гистология HuH7 и PLC / PRF / 5 опухолей, соответственно (масштабные линейки = 100 μ м) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры ,
Рисунок 3. Участок опухоли Вес против сотовый графа. Вес опухоли высоко коррелирует с общего количества опухолевых клеток после collagenasе диссоциации.
| Общее количество яиц | Процент выживания яиц с куриного эмбриона | Курсы опухоли взять в яйцах с эмбрионами выживших | |
| HuH7 | 27 | 92,6% (25/27) | 100% (25/25) |
| ПЛК / PRF / 5 | 6 | 83,3% (5/6) | 100% (5/5) |
| В общем и целом | 33 | 90,9% (30/33) | 100% (30/30) |
Таблица 1. Эмбриональные выживания ставок и опухолевых Возьмите в CAM модели, используя два человека клеток рака печени линии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Несколько ключевых шагов в этом протоколе, скорее всего, приходится улучшенной эмбрионального выживания, а также повышенной надежностью роста опухоли. Падение CAM от оболочки путем применения всасывания воздуха мешка менее агрессивна, чем другие существующие методы (с помощью иглы для удаления альбумина из яйца, тупым и т.д.). Используя стерильный толчок булавку, чтобы создать два маленьких отверстия, необходимые для этого метода является наиболее сложной частью протокола. Использование слишком много сил может привести к повреждению камеры и ее сосудистой через более-проникновения с канцелярской кнопки или даже привести к растрескиванию или уничтожение яйцеклетки. Руки-на практике, используя толчок булавку, чтобы сделать маленькие отверстия в не удобренных, продуктовых купил яйца могут свести к минимуму ошибки, допущенные во время первой попытки на падения CAM. Кроме того, использование этанола или других дезинфицирующих растворов для очистки оболочки уменьшает эмбриональную жизнеспособность, и его следует избегать. Наконец, с помощью стерильной силиконовой кольцо &# 8220; загон "опухолевые клетки в одном конкретном месте после посева помогает в росте опухоли и способствует высокой скорости опухоли берут увидеть в нашем протоколе.
Некоторые оптимизации важных шагов в протоколе, скорее всего, потребуется при работе с различных клеточных линий и / или наркотиков. Предложенная количество клеток для посева между 0,5 и 2 млн, но некоторые клеточные линии могут потребоваться более высокие или более низкие плотности посева, чтобы сформировать хороший трехмерный опухоль. Прививка слишком мало клеток может привести к плохому формированию опухоли, в то время как прививки слишком много клеток может привести к чрезмерно быстрый рост опухоли, в которых опухоль занимает весь силиконовое кольцо, становится более плоским и менее трехмерное, чем идеально, и может избежать границу кольца , Мы рекомендуем вам настроить предварительный эксперимент, чтобы определить оптимальную плотность посева клеток для какой-либо конкретной клеточной линии. Кроме того, некоторые настройки на уровне в пробирке концентрации препарата может быть потребуетсяд. Вычислим концентраций лекарственного средства со ссылкой на общего объема, что высевают на кулачок (60 мкл), а иногда и "высшие" концентрации препарата, чем те, которые используются в параллельных экспериментах в пробирке требуются для того, чтобы увидеть воздействие на рост опухоли, предположительно из-за Поглощение через кулачок и разгона препарата к остальной части яйца.
После успешной оптимизации протокола для конкретных клеточных линий и медикаментов, модель САМ ксенотрансплантата может быть использован для исследования широкого спектра свойств опухолевых и клеточных механизмов. Рост опухоли может быть оценена через веса и измерения размеров, а также общего счета опухолевых клеток. Опухоли могут быть зафиксированы и подвергали иммуногистохимии для окрашивания для опухолевых маркеров или специфических белков, представляющих интерес. Ангиогенез может быть оценена с помощью окрашивания для SNA1, которые специфически окрашивает куриных эндотелиальные клетки 17. Опухолевые клетки могут быть лизированы на допрос молекулярных путей, В качестве промежуточного шага в преодолении чисто в пробирке работы с более сложными моделями рака, таких как ортотопических животных моделях, то ксенотрансплантат модель CAM является экономически эффективным способом быстро получить данные в обстановке, которая биологически более актуальным, чем клетки, выращенные в культуре.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Premium incubated eggs | Charles River | N/A | http://www.criver.com/files/pdfs/avian/av_c_spf_egg_price_list.aspx |
| Egg incubators | GQF | Hova-Bator 2362N | |
| Rotating egg trays | GQF | 1611 Automatic Egg Turner | |
| Egg candler | Lyon | Hi-Power 950-070 | |
| Dremel 100 rotary tool with 15/16 cut-off wheel | Dremel | 100-N/7 | |
| Sterile forceps, push pin, dissection scissors, Scotch tape | |||
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Cryogenic vials, external thread with silicone washer | Corning | 430659 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C9891 |
References
- Sangiovanni, A., et al. Increased survival of cirrhotic patients with a hepatocellular carcinoma detected during surveillance. Gastroenterology. 126 (4), 1005-1014 (2004).
- Lopez, P. M., Villanueva, A., Llovet, J. M. Systematic review: evidence-based management of hepatocellular carcinoma--an updated analysis of randomized controlled trials. Aliment Pharmacol Ther. 23 (11), 1535-1547 (2006).
- Llovet, J. M., Burroughs, A., Bruix, J. Hepatocellular carcinoma. Lancet. 362 (9399), 1907-1917 (2003).
- Folkman, J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent. J Natl Cancer Inst. 82, 4-6 (1990).
- Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1643-1648 (2005).
- Dumartin, L., et al. Netrin-1 mediates early events in pancreatic adenocarcinoma progression, acting on tumor and endothelial cells. Gastroenterology. 138 (4), 1595-1606 (2010).
- Aguirre-Ghiso, J. A., Estrada, Y., Liu, D., Ossowski, L. ERK(MAPK) activity as a determinant of tumor growth and dormancy; regulation by p38(SAPK). Cancer Res. 63 (7), 1684-1695 (2003).
- Baroni, T. E., et al. Ribonomic and short hairpin RNA gene silencing methods to explore functional gene programs associated with tumor growth arrest. Methods Mol Biol. 383, 227-244 (2007).
- Lopez-Rivera, E., et al. Inducible nitric oxide synthase drives mTOR pathway activation and proliferation of human melanoma by reversible nitrosylation of TSC2. Cancer Res. 74 (4), 1067-1078 (2014).
- Balke, M., et al. A short-term in vivo model for giant cell tumor of bone. BMC Cancer. 11, 241 (2011).
- Balke, M., et al. Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane. BMC Res Notes. 3, 58 (2010).
- Sys, G. M., et al. The in ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma. J Vis Exp. (77), e50522 (2013).
- Dohle, D. S., et al. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works. J Vis Exp. (33), (2009).
- Ossowski, L., Reich, E. Experimental model for quantitative study of metastasis. Cancer Res. 40 (7), 2300-2309 (1980).
- Ghanekar, A., Ahmed, S., Chen, K., Adeyi, O. Endothelial cells do not arise from tumor-initiating cells in human hepatocellular carcinoma. BMC Cancer. 13, 485 (2013).
- Ho, J. W., et al. Effects of a novel immunomodulating agent, FTY720, on tumor growth and angiogenesis in hepatocellular carcinoma. Mol Cancer Ther. 4 (9), 1430-1438 (2005).
- Hagedorn, M., et al. VEGF coordinates interaction of pericytes and endothelial cells during vasculogenesis and experimental angiogenesis. Dev Dyn. 230 (1), 23-33 (2004).
