o<em> In Ovo</em> Chick Corioalantóide membrana (CAM) como um Ensaio Xenoenxerto modelo eficiente de carcinoma hepatocelular
Summary
The chick chorioallantoic membrane (CAM) is immunodeficient and highly vascularized, making it a natural in vivo model of tumor growth and angiogenesis. In this protocol, we describe a reliable method of growing three-dimensional, vascularized hepatocellular carcinoma (HCC) tumors using the CAM assay.
Abstract
A membrana corioalant�ca pinto (CAM) começa a se desenvolver no dia 7 após a fertilização e amadurece a dia 12. O CAM é naturalmente imunodeficientes e altamente vascularizado, tornando-se um sistema ideal para a implantação do tumor. Além disso, a CAM contém proteínas da matriz extracelular, tais como fibronectina, laminina, colagénio, integrina alfa (V) beta3, e MMP-2, tornando-se um modelo atractivo para estudar a invasão tumoral e metástases. Os cientistas têm tomado longo vantagem da fisiologia da CAM usando-o como um modelo de angiogénese. Mais recentemente, o ensaio CAM foi modificado para funcionar como um sistema modelo in vivo de xenotransplante para vários tipos de câncer que preenche a lacuna entre o trabalho de base in vitro e modelos mais complexos de cancro animal. O ensaio CAM permite o estudo do crescimento do tumor, as terapias anti-tumorais, e vias moleculares pró-tumorais num sistema que é biologicamente importante tanto em termos de custos e tempo eficaz. Aqui, descrevemos o desenvolvimento da CAM xenograft modelo de carcinoma hepatocelular (HCC), com taxas de sobrevivência de embriões de até 93% e tumor confiável tomar levando a um crescimento de tridimensionais, tumores vascularizados.
Introduction
O carcinoma hepatocelular (HCC) é a 3ª maior causa de mortalidade por câncer no mundo 1. Atualmente, apenas 30% dos pacientes com CHC são elegíveis para os tratamentos cirúrgicos potencialmente curativas 2, e quimioterapia sistêmica não é eficaz 3. Portanto, existe uma necessidade premente para clínica não satisfeita terapias HCC novos, e o desenvolvimento de sistemas modelo adequados para o teste eficiente de novos agentes. O corioalant�ca membrana (CAM) ensaio pintainho fornece um método reprodutível, de custo-eficaz, rápido e de médio rendimento de testar potenciais fármacos anti-tumorais in vivo.
O ensaio CAM tem sido amplamente utilizado para estudar angiogénese 4. Também foi desenvolvido com sucesso num modelo de xenoenxerto de tumor de cancros, incluindo o glioblastoma 5, 6 cancro pancreático, melanoma 7-9, 10-11 e osteossarcoma. Ambos in ovo 12 e ex ovo13 técnicas têm sido utilizadas na literatura, com detalhes que variam de protocolo para protocolo. Um grande desafio para o modelo CAM xenotransplante é a incidência relativamente elevada de morte embrionária após a manipulação do ovo, com taxas de mortalidade de embriões de pintainho publicados que variam 25-50 por cento 11-14.
Neste artigo, descrevemos o desenvolvimento de um modelo in ovo de xenotransplante de HCC que produz de forma confiável crescimento de tridimensionais, tumores vascularizados que histologicamente se assemelham HCC indiferenciado. Temos adaptado um protocolo inicialmente descrito por Ossowski et ai. 14 e ter atingido pintainho embrionário taxas de sobrevivência de até 93% com o enxerto do tumor extremamente alta.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vários passos principais neste protocolo mais provavelmente representam a sobrevivência embrionária melhorada bem como uma maior fiabilidade do crescimento do tumor. Soltando o CAM para longe do reservatório através da aplicação de sucção para o saco de ar é menos invasiva do que os outros métodos existentes (utilizando uma agulha para remover a albumina do ovo, dissecção cega, etc.). Usando um alfinete estéril para criar os dois pequenos furos necessários para este método é a parte mais desafiadora do …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A.S. was partially supported by grants from the National Institutes of Health (NIH) National Institute of Dental and Craniofacial Research (5R03DE021741-02) and the National Cancer Institute (1K08CA154963-01A1).
The Howard Hughes Medical Institute provided funding for M.L. through the HHMI Medical Research Fellows Program.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Premium incubated eggs | Charles River | N/A | http://www.criver.com/files/pdfs/avian/av_c_spf_egg_price_list.aspx |
| Egg incubators | GQF | Hova-Bator 2362N | |
| Rotating egg trays | GQF | 1611 Automatic Egg Turner | |
| Egg candler | Lyon | Hi-Power 950-070 | |
| Dremel 100 rotary tool with 15/16 cut-off wheel | Dremel | 100-N/7 | |
| Sterile forceps, push pin, dissection scissors, Scotch tape | |||
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Cryogenic vials, external thread with silicone washer | Corning | 430659 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C9891 |
References
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