Abstract
Kyllingechorioallantoinmembranen (CAM) begynder at udvikle på dag 7 efter befrugtningen og modnes ved dag 12. CAM er naturligvis immundefekte og meget vaskulariseret, hvilket gør det til et ideelt system til tumorimplantation. Endvidere CAM indeholder ekstracellulære matrixproteiner, såsom fibronectin, laminin, collagen, alpha integrin (v) beta3 og MMP-2, hvilket gør det til en attraktiv model til at studere tumor invasion og metastase. Forskere har længe benyttet sig af fysiologi CAM ved at bruge det som en model af angiogenese. For nylig er CAM-assayet er modificeret til at fungere som en in vivo xenograft model for forskellige kræftformer, der bygger bro mellem grundforskning in vitro arbejde og mere komplekse dyrecancermodeller. CAM-assayet giver mulighed for undersøgelse af tumorvækst, antitumorbehandlinger, og pro-tumor molekylære veje i et biologisk relevant system, der er både omkostnings- og tidseffektiv. Her beskriver vi udviklingen af CAM Xenograft model af hepatocellulært carcinom (HCC) med embryonale overlevelsesrater på op til 93% og pålidelig tumor tage fører til vækst af tre-dimensionelle, vaskulariserede tumorer.
Introduction
Hepatocellulært carcinom (HCC) er den 3. hyppigste årsag til kræft dødsfald i verden 1. I øjeblikket kun 30% af HCC patienter er berettiget til potentielt helbredende kirurgiske behandlinger 2, og systemisk kemoterapi ikke er effektiv 3. Derfor er der et presserende udækket behandlingsbehov for nye HCC terapier, og udvikling af modelsystemer er egnet til effektiv afprøvning af nye midler. Kyllingechorioallantoinmembranen (CAM) assay tilvejebringer en reproducerbar, omkostningseffektiv og hurtig medium-throughput metode til afprøvning af potentielle anti-tumor lægemidler in vivo.
CAM-assayet er blevet anvendt i vid udstrækning til at studere angiogenese 4. Det er også blevet udviklet med succes i en tumor xenograft model af cancere, herunder glioblastom 5, pancreascancer 6, melanom 7-9 og osteosarkom 10-11. Både in ovo 12 og ex ovo13 teknikker er blevet anvendt i litteraturen, med detaljer varierende fra protokol til protokol. En væsentlig udfordring for CAM xenograftmodel er den relativt høje forekomst af embryonale død efter manipulation af ægget, med offentliggjorte chick dødelighed embryo spænder fra 25 til 50 procent 11-14.
I denne artikel beskriver vi udviklingen af en in ovo xenograft model af HCC, som pålideligt producerer vækst på tre-dimensionelle, vaskulariserede tumorer, der histologisk ligner udifferentieret HCC. Vi har tilpasset en protokol først beskrevet af Ossowski et al. 14 og har opnået chick embryonale overlevelsesrater på op til 93% med ekstremt høj tumor transplantation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Æg Inkubation
- Opnå 8 dage gamle specifikke patogenfrie befrugtede æg.
- Placer æg i roterende æggebakke, stemplet ender opad, og placer den roterende bakke inde et æg inkubator. Inkuber æg i 48 timer ved 36 ° C og 50% fugtighed.
2. Dropper CAM og Åbning af æg
- Indsamle æg fra inkubatoren. Placer æg i æg rack, stemplet opad, og bringe til laminar flow hætte.
- Sluk roomservice og hætte lys.
- Hold stemplet ende af ægget let til ægget Candler at blotlægge vaskulaturen af CAM samt luftsækken.
BEMÆRK: æg Candler er en lyskilde der anvendes til at visualisere udviklende embryo og tilhørende luft sac og kar. - Placer en blyant mærke i mellem to store blodkar.
- Tænde lys og bruge en steril skubbe pin at gøre et hul i spidsen af ægget over luftsækken (stemplet ende) og et hul på pencil mærket. Skub ikke skubbe pin hele vejen igennem; et hul omkring 3 mm dybe sædvanligvis være tilstrækkelig.
- Slukke lyset. Klem sikkerhed pære, trykke på den åbne ende fast mod hullet over luft sac. Sugning til at trække luft ind i hullet i blyantsmærke, hvilket CAM til at falde væk fra skallen på blyant mærket.
- Kontroller, at luften sac er flyttet fra den stemplede ende af æg til den blyant-mærket hul ved hjælp af Candler. Hvis det ikke har, kan du bruge push pin til at gøre begge huller lidt dybere og derefter re-sugning ved hjælp af sikkerheden pære.
- Tænd lyset. Holder ægget i den ene hånd, tænde for dremel roterende værktøj med en 15/16 tommer skæreskive vedhæftet og gøre to tværgående snit lige dybt nok til at skære igennem skallen, men ikke dybt nok til at skære hele vejen ned til den deprimerede CAM. Foretag de nedskæringer omkring 2 cm i længden og 1 cm fra hinanden. Gør snittene bred nok til, at en silikone ring 1 cm i diameter kan passere gennemmen tyndere end bredden af standard tape.
- Dernæst skal 1 langsgående snit mellem og ved enderne af de to tværgående snit ved let berøring af skæreskive til skallen.
- Skub steril pincet under svøbstykke og parallelt med skallen. Grab skallen stykke med pincet og fjerne hele stykket rent.
- Placer scotch tape over den nyåbnede vindue, og sørg for at folde den ene ende over på sig selv for at lette fjernelse.
- Placer æg tilbage i kuvøse i æggebakke (IKKE medtaget i de roterende æg stativer), indtil tidspunktet for podning.
3. Inokulation
- Hold kælderen membranprotein blanding, såsom matrigel, på is (for at forhindre polymerisering) og sted i hætte.
- Brug 2 mM EDTA at løsrive celler (4 - 5 ml pr T75 kolbe) og sted kolber i vævsdyrkningsinkubator i 5 min.
- Resuspender de løsrevne celler i medier og tælle ved hjælp af et hæmocytometer og trypanblå. Brug mellem 500.000 to 2.000.000 celler til podning på CAM, afhængigt af cellelinjen. Optimer korrekte antal i indledende forsøg.
- Mål nødvendige mængde for passende celleantal og der centrifugeres ved 500 xg i 5 min.
- Supernatanten kasseres, og derefter resuspenderes cellepellet i 40 μ l PBS ++ og 20 μ l basalmembran blanding.
BEMÆRK: På dette tidspunkt, celler kan behandles med lægemidler eller andre testmidler som er nødvendig for eksperimenter ved resuspendering i cellen / basalmembran blandingen suspension. Alternativt kan midler blive pipetteret på celle / basalmembran blandingen suspension efter podning. - Hent æg rack med æg fra inkubatoren og plads i laminar flow hætte.
- Skræl tapen ud af vinduet, hente en 1 mm silikone ring fra hætten af en kryogen hætteglas hjælp steriliserede pincet, og slip ringen gennem vinduet.
- Pipetter 60 μ l celle opløsning af PBS ++ og basalmembran mixture direkte ind i midten af silikone ring hviler på CAM.
- Re-tape vinduet og flytte æg rack tilbage til inkubatoren. På dette punkt, forsigtig, når du flytter æggene som ringen og cellesuspensionen kan let blive fordrevet.
- Tillad tumorer at vokse i 5 til 7 dage.
4. Høst tumorer
- Placer under-pad i hætte. Forbered 35 x 10 mm plader og paraformaldehyd beholdere som er nødvendig for histologi. Sæt 1 ml PBS ++ i hvert 35 x 10 mm plade.
- Placer biohazard taske i hætte. Tag sterile dissektion saks og indsæt den spidse ende ind i ægget ved hul nær stemplet ende.
- Skær rundt om hele ægget på langs.
BEMÆRK: CAM og tumoren med ringen bør holde sig til den øverste halvdel af skallen med vinduet. - Brug af dissektion saks og pincet, dissekere tumoren væk fra CAM og placere tumor i 35 x 10 mm plade. Måle og veje tumorer. Faste tumorer i paraformaldehyde og derefter paraffin-indlejre dem til brug i histologi og immunhistokemi eksperimenter.
5. (Valgfrit): Tumor Cell Dissociation
- Brug dissektion saks til at hakke tumoren i 35 x 10 mm plade. Hæld hakket tumor i et 15 ml centrifugerør og fjerne så meget PBS ++ muligt ved pipettering.
- Tilsæt 2 ml collagenase (1 mg / ml i PBS ++), vende røret over flere gange, og inkuber rør ved 37 ° C i mindst 30 minutter (op til flere timer).
- Der tilsættes 5 ml medium til hvert rør og resuspender grundigt ved pipettering op og ned 20 - 40x. Grundig pipettering er afgørende for fuldstændig celledissociering.
- Tillad sediment at bilægge, og overføre supernatanten til et nyt rør. Centrifuger ved 500 x g i 5 min. Fjern supernatanten og efterlod dissocierede cellepellet.
BEMÆRK: På dette tidspunkt kan cellepellets anvendes til forskellige eksperimenter (flowcytometri, lysis til anvendelse i Western blotting, RNA-isolering, etc.). Total tumor celletal kan også opnås ved anvendelse af et hæmocytometer og trypanblåt-farvning. Bemærk, at mindre, ovale celler er kylling celler fra CAM og bør ikke medregnes som tumorceller. Der bør være et minimalt antal af kontaminerende non-tumor (CAM) celler, hvis tumoren dissekeres væk fra CAM omhyggeligt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Repræsentative billeder af de vigtigste trin i protokollen er vist her. Figur 1A demonstrerer brugen af Candler at visualisere udviklende embryo, luftsækken og vaskulaturen af CAM. Figur 1B-1C viser processen med at tabe CAM ved at gøre de to huller og derefter anvende undertryk ved hjælp af sikkerheden pære, og figur 1D viser en succes droppet CAM med en stor luftboble under blyant-mærket hul. Figur 1E og figur 1 F demonstrerer brugen af dremel roterende værktøj til at foretage de nødvendige nedskæringer i skallen over luftboblen og åbnede vinduet i skallen med den udsatte vaskulariserede CAM inden.
Tredimensionale, vaskulariserede tumorer blev dyrket med succes ved hjælp af de humane HCC-cellelinier HUH7 (figur 2A-2B) og PLC / PRF / 5 (figur 2C-2D). Tumorer dyrket fra Huh7 og PLC / PRF / 5 celler histologically ligne udifferentieret HCC (Figur 2E-2F) og også ligne Huh7 og PLC / PRF / 5 tumorer dyrket i mus xenograftmodeller 15,16. Endvidere blev brugen af tumorvægt valideret som en måling af tumorstørrelse ved at påvise, tumorvægt var stærkt korreleret med total tumor celletal opnået efter fuldstændig dissociation af tumorer under anvendelse af collagenase (figur 3).
Ved hjælp af denne protokol blev embryonale overlevelsesrater på op til 93% opnået (tabel 1). Tabel 1 viser aggregerede data fra tre separate HCC eksperimenter i CAM xenograft model. Ud af i alt 33 æg, der lykkedes podet med 500.000 tumorceller (HUH7 eller PLC / PRF5), kun 3 æg resulterede i kyllingeembryo død, en samlet overlevelse på 90,9%. Endvidere blev tumorer meget pålideligt dyrkes efter 5 dage, som 100% (30/30) af æg med overlevende embryoner held havde tumordannelse.
Figur 1. Dropper CAM og åbne et vindue i Shell. (A) Identifikation af Embryo (blå pil) og kar (sort pil) ved hjælp af Candler, (B) lave et hul i Shell, (C) Anvendelse Suge til Hul i Naturligt forekommende Air Sac, (D) Visualisere luftboblen Viser Vellykket droppe af CAM væk fra Shell, (E - F). Åbning af et vindue i Shell hjælp Dremel Rotary Tool Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. CAM Understøtter Vækst af tre-dimensionelle, vaskulariserede tumorer der Histologisk ligne Udifferentieret HCC. (A - B) Tumor vækst efter 5 dage i CAM-modellen, HUH7-celler (500.000 celler podet) (skalapanelerne = 1 cm), (C - D) tumorvæksten efter 5 dage i CAM-modellen, PLC / PRF / 5 celler (500.000 celler podet) (skala barer = 1 cm), (E-F) Histologi af Huh7 og PLC / PRF / 5 tumorer henholdsvis (skala barer = 100 μ m) Klik her for at se en større version af dette tal .
Figur 3. Plot af Tumor Vægt vs celletal. Tumor vægt er stærkt korreleret med total tumor celletal efter collagenase dissociation.
| Samlet antal æg | Procent af æg med kyllingeembryo overlevelse | Sats for tumor tage i æg med overlevende embryoner | |
| Huh7 | 27 | 92,6% (25/27) | 100% (25/25) |
| PLC / PRF / 5 | 6 | 83,3% (5/6) | 100% (5/5) |
| Samlet | 33 | 90,9% (30/33) | 100% (30/30) |
Tabel 1. Embryonale Survival laveste priser af tumor Tag i CAM Model hjælp To Menneskelig HCC cellelinjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flere vigtige skridt i denne protokol sandsynligvis tegner sig for den forbedrede embryonale overlevelse samt øget pålidelighed af tumorvækst. Droppe CAM væk fra skallen ved at påføre sugning til luftsækken er mindre invasiv end andre eksisterende metoder (anvendelse af en nål til at fjerne albumin fra ægget, stump dissektion, etc.). Ved hjælp af en steril skub pin til at skabe de to små huller, der er nødvendige for denne metode er den mest udfordrende del af protokollen. Bruger for meget kraft kan resultere i skader på CAM og dens kar gennem over-penetration med push pin eller kan endda resultere i revnedannelse eller ødelægge ægget. Hands-on praksis ved hjælp af en push pin til lave små huller i ikke-befrugtede, købmand-købte æg kan minimere fejl begået i løbet af det første forsøg på at droppe CAM. Endvidere er anvendelsen af ethanol eller andre desinficerende opløsninger til rengøring skallen falder embryonale levedygtighed, og bør undgås. Endelig ved hjælp af den sterile silikone ring til &# 8220; Corral "tumorcellerne på ét bestemt sted efter podning hjælper med tumorvækst og bidrager til den høje tumoroptagelse ses i vores protokol.
Nogle optimering af kritiske trin i protokollen vil højst sandsynligt være nødvendigt, når man arbejder med forskellige cellelinier og / eller narkotika. Den foreslåede antal celler til podning er mellem 0,5 og 2 millioner, men nogle cellelinier kan kræve højere eller lavere seeding densiteter for at danne en nice, tredimensionalt tumor. Podning for få celler kan resultere i dårlig tumordannelse, mens podning for mange celler kan resultere i tumorovervækst hvor tumoren optager hele silikone ring, bliver fladere og mindre tredimensionale end ideel, og kan undslippe grænsen af ringen . Vi anbefaler at oprette et indledende forsøg for at bestemme den optimale celle podningstæthed for en bestemt cellelinje. Endvidere kan en vis justering til standard in vitro lægemiddelkoncentrationer der kræverd. Vi beregner lægemiddelkoncentrationer med henvisning til den samlede mængde, der er podet på CAM (60 pi), men undertiden "højere" medikamentkoncentrationer end dem, der anvendes i parallelle eksperimenter in vitro er nødvendige for at se virkningerne på tumorvækst, formodentlig på grund af absorption gennem CAM og spredning af lægemiddel til resten af ægget.
Efter vellykket optimering af protokollen for specifikke cellelinier og lægemidler, kan CAM xenograftmodel anvendes til at undersøge en bred vifte af tumor egenskaber og cellulære mekanismer. Tumorvækst kan vurderes gennem vægt og størrelse målinger samt totale tumor celletal. Tumorer kan fastgøres og underkastes Immunohistokemi at farve for tumormarkører eller specifikke proteiner af interesse. Angiogenese kan vurderes ved farvning for SNA1, som specifikt farver chick endotelceller 17. Tumor celler kan lyseres til forhør af molekylære veje. Som et foreløbigt skridt i at bygge bro ren in vitro arbejde med mere komplekse modeller for kræft såsom ortotopisk dyremodeller, CAM xenograft model er en omkostningseffektiv måde til hurtigt at få data i en indstilling, der er mere biologisk relevant end celler dyrket i kultur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Premium incubated eggs | Charles River | N/A | http://www.criver.com/files/pdfs/avian/av_c_spf_egg_price_list.aspx |
| Egg incubators | GQF | Hova-Bator 2362N | |
| Rotating egg trays | GQF | 1611 Automatic Egg Turner | |
| Egg candler | Lyon | Hi-Power 950-070 | |
| Dremel 100 rotary tool with 15/16 cut-off wheel | Dremel | 100-N/7 | |
| Sterile forceps, push pin, dissection scissors, Scotch tape | |||
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Cryogenic vials, external thread with silicone washer | Corning | 430659 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C9891 |
References
- Sangiovanni, A., et al. Increased survival of cirrhotic patients with a hepatocellular carcinoma detected during surveillance. Gastroenterology. 126 (4), 1005-1014 (2004).
- Lopez, P. M., Villanueva, A., Llovet, J. M. Systematic review: evidence-based management of hepatocellular carcinoma--an updated analysis of randomized controlled trials. Aliment Pharmacol Ther. 23 (11), 1535-1547 (2006).
- Llovet, J. M., Burroughs, A., Bruix, J.
- Folkman, J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent. J Natl Cancer Inst. 82, 4-6 (1990).
- Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1643-1648 (2005).
- Dumartin, L., et al. Netrin-1 mediates early events in pancreatic adenocarcinoma progression, acting on tumor and endothelial cells. Gastroenterology. 138 (4), 1595-1606 (2010).
- Aguirre-Ghiso, J. A., Estrada, Y., Liu, D., Ossowski, L. ERK(MAPK) activity as a determinant of tumor growth and dormancy; regulation by p38(SAPK). Cancer Res. 63 (7), 1684-1695 (2003).
- Baroni, T. E., et al. Ribonomic and short hairpin RNA gene silencing methods to explore functional gene programs associated with tumor growth arrest. Methods Mol Biol. 383, 227-244 (2007).
- Lopez-Rivera, E., et al. Inducible nitric oxide synthase drives mTOR pathway activation and proliferation of human melanoma by reversible nitrosylation of TSC2. Cancer Res. 74 (4), 1067-1078 (2014).
- Balke, M., et al. A short-term in vivo model for giant cell tumor of bone. BMC Cancer. 11, 241 (2011).
- Balke, M., et al. Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane. BMC Res Notes. 3, 58 (2010).
- Sys, G. M., et al. The in ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma. J Vis Exp. (77), e50522 (2013).
- Dohle, D. S., et al. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works. J Vis Exp. (33), (2009).
- Ossowski, L., Reich, E. Experimental model for quantitative study of metastasis. Cancer Res. 40 (7), 2300-2309 (1980).
- Ghanekar, A., Ahmed, S., Chen, K., Adeyi, O. Endothelial cells do not arise from tumor-initiating cells in human hepatocellular carcinoma. BMC Cancer. 13, 485 (2013).
- Ho, J. W., et al. Effects of a novel immunomodulating agent, FTY720, on tumor growth and angiogenesis in hepatocellular carcinoma. Mol Cancer Ther. 4 (9), 1430-1438 (2005).
- Hagedorn, M., et al. VEGF coordinates interaction of pericytes and endothelial cells during vasculogenesis and experimental angiogenesis. Dev Dyn. 230 (1), 23-33 (2004).
