パッチクランプ技術を用いたダーク適応、マウス網膜スライス標本におけるニューロンにおける記録光誘発シナプス後応答

Abstract

網膜は視覚系へのゲートウェイである。視覚信号処理メカニズムを理解するために、網膜の神経回路網の機能を調査する。ネットワーク内の網膜神経細胞は、多数のサブタイプが含まれる。双極細胞、神経節細胞、およびアマクリン細胞の10以上のサブタイプは、形態学的研究によって確認されている。網膜ニューロンの複数のサブタイプは、そのような動きや色などの視覚的シグナルの明確な特徴をコードする、複数の神経経路を形成すると考えられる。しかし、視覚的な信号処理における各ニューロンの機能的役割は十分に理解されていない。パッチクランプ法は、この根本的な問題に対処するのに便利です。ここでは、暗順応状態でパッチクランプ記録を用いて、マウスの網膜神経細胞の光誘発性シナプス応答を記録するためのプロトコルが提供される。マウスの眼には、O / N暗順応であり、網膜スライス標本は、赤外線照明と視聴者を使用して、暗い部屋で解剖されている。赤外光にはありませんマウスの光受容体を活性化し、したがって、それらの光反応性を保持します。パッチクランプは、網膜神経細胞の光誘発性の応答を記録するために使用される。蛍光色素は、ニューロンの形態学的サブタイプを特徴付けるための録音中に注入される。この手順では、マウスの網膜に各ニューロンの生理的機能を決定することが可能になります。

Protocol

倫理声明：動物を対象とする手順は、ウェイン州立大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認された。

実験ソリューションの調製

1. 実際の実験の前に1週間に解剖ソリューション1日を準備します。なぜなら、より低い温度¹⁶でのその強力な緩衝能の網膜解剖のためのHEPES緩衝液を使用してください。 115のNaCl、2.5のKCl、2.5のCaCl _2、1.0のMgCl _2、10 HEPES、28グルコース：（mm）を次のようにすべての化学物質を混ぜる。 NaOHでpHを7.4に調整します。 1週間に冷蔵庫までに解決してください。
2. 記録液は、網膜の準備¹⁷用に設計された人工脳脊髄液（aCSFの）であるエイムズ」媒体である。実験の日では、チューブ内のエイムズ「粉末（500ミリリットルソリューションの4.4グラム）を秤量。また、 _炭酸水素ナトリウム（500ミリリットルソリューションの0.95グラム）を秤量し、Aと混合MES」粉末。
3. 実験日によってパッチクランプ記録のための細胞内ピペット溶液を準備します。 111 K-グルコン酸、1.0のCaCl _2、10 HEPES、1.1 EGTA、10のNaCl、1.0のMgCl _2、5 ATP-Mgおよび1.0 GTP-のNaを：（mm）を次のようにすべての化学物質を混ぜる。 KOHでpHを7.2に調整します。従来のシリンジフィルター付きピペット溶液を濾過する。 〜500μlのアリコートを作成し、冷凍庫またはディープフリーザーに保管してください。

実験の日のために2。準備

1. O / N暗順応のために暗い空間に - （雄、8週齢4 C57BL / 6Jまたは類似の背景、）実験前の夜は、ケージにマウスを置く。
2. 解剖のための準備：
   1. 少なくとも10分間、酸素を、ガラスビーカー中 - （200mlの100）の氷の上に置き、気泡液解剖埋める。
   2. 網膜の準備ストレージ用暗箱の酸素化を開始します。
   3. 再用グリースレールとプラスチックのカバースリップを準備tinalスライス標本を35mmプラスチックディッシュにそれらの各々を置き。
   4. チョッパー（組織スライサー）に新しいカミソリの刃を取り付けます。
   5. 半分にフィルター膜をカット。これは、網膜スライス用です。
   6. 解剖顕微鏡の近くに解剖ツールと転送ピペットを合わせます。各ツールは簡単に​​暗闇の中でアクセスできるように作業領域がよく組織されなければならない。
3. パッチクランプ記録のための準備：
   1. エイムズ'粉末および蒸留水中のNaHCO _3（エイムス4.4グラムおよびNaHCO ₃ 0.95グラム/ 500ミリリットルのddH ₂ O）に溶解する。バブル少なくとも30分間混合酸素（95％O ₂および5％CO _2）エイムス「媒体記録温度レベルまで加熱しながら（〜35℃）。まだ吹き込みながらNaHCO ₃でpHを7.4に調整します。
   2. 解剖時の内部ピペット溶液を解凍する。それが解凍された後、細胞内染色のための0.01％のローダミンBを追加します。

3.網膜解剖

1. 暗い部屋では、二酸化炭素との二国間気胸を使用して、マウスを安楽死させる。 2の後 - 二酸化炭素を使用しての3分、マウスは意識を失うことになる。
2. マウスは、もは​​やテールピンチに応答しない場合には、すぐに目を脱核、プラスチック皿中の冷たい解剖ソリューションに配置します。動物の死を確実にするために二国間気胸を実行します。すばやく暗箱中皿に目を保​​管。暗闇の中で手続きを行うために赤外線ビューアを使用してください。
   注：あるいは、イソフルラン、断頭、または頸椎脱臼は安楽死のために使用することができます。安楽死の方法は、国立衛生研究所（NIH）および/または施設の動物実験委員会のガイドラインに従ってください。
3. 暗い部屋では、解剖顕微鏡と赤外線照明を調整します。顕微鏡下で、10cmのプラスチックシャーレWにその皿から目を移す冷却された解剖ソリューション番目。プラスチック皿の底に置かれ、チューブを介して連続的に気泡酸素。それが低すぎないように流量を調節し、それは解剖を乱すのに十分高くないことを確認してください。
4. 角膜および水晶体除去：
   1. マイクロメスで角膜の上に切開を行います。眼球のもう一方の端にある視神経を保持することは動くから目を防ぐことができます。外科ハサミを使ってカットを拡張します。その周りにいくつかの強膜で角膜を切り取る。
   2. 細かい鉗子でレンズをつかみ、ゆっくりとレンズを引き出します。硝子レンズを外しすぎて粘着性である場合は、ハサミで硝子体をカット。
   3. アイカップが行われると、そっと小さなトランスファーピペットとアイカップに冷たい、酸素解剖ソリューションを注ぐ。
      注：切開が角膜に行われた後、眼球を素早く収縮。これは、プロ中の目を変形として、眼の形状を維持することが重要であるcedureは、網膜を損傷し、網膜剥離の原因になります。
5. 網膜の背側と腹側の識別：
   注：緑、紫外線（UV）の不均一な分布は、特定の網膜の領域を識別し^、18が円錐ので光応答記録のために重要である。
   1. 視神経乳頭近傍を通過網膜アイカップ全体に行くの行を特定します。この行は、主に視神経の腹側を通過する。他の¹⁹の腹側であるが、視神経を含む側面は、背側である。赤外線視聴者の下で明確にこのランドマークを参照してください。
   2. 実験の目的に応じて、不要な側のカットを作る。これは、アイカップから網膜を単離した後に有用であろう。
6. 硝子体除去：
   1. 必要に応じて、15分間、ヒアルロニダーゼ（0.5mg / ml）を有するアイカップをインキュベートする。
   2. 極細ピンセットで硝子体を除去します。硝子体は主であるボトムと目をカップの外縁に取り付ける。そっと触れたり、網膜を突っついせずにそれを削除します。硝子体がしっかりアイカップに添付さかもしれませんが、アイカップから網膜剥離を避けるために、静かに取り除く。全く緊張が感じられなくなるまで引っ張って続けます。
      注：この手順は、マウスの網膜を切開するために特に重要である。しかしながら、そのようなラットまたはサンショウウオなどの他の種の網膜は問題ではない。
7. アイカップから網膜を分離します。強膜をつかみ、静かに鉗子の裏側を使用して網膜をはがす。
   注：ホールマウント網膜の準備が孤立した網膜から作ることができる。縁で三から四カットを作成し、網膜を平らに、またはいくつかの部分に網膜をカット。
8. 網膜トリムと網膜（ ステップ3.5）の不必要な半分を捨てる。同じプラスチック皿の中で、二つに残りの網膜をカット。網膜の各部分については、作るために縁を断つ網膜のスラブ、および折りたたみエッジをトリム。
9. 大ホールピペット（〜2ミリリットル）を使用して、ガラス板上に網膜のスラブを転送します。小さなピペットで過剰の溶液を吸い取り、スラブを平らに濾紙を使用し、迅速に組織の上にフィルター膜の断片を置き。
   1. 小さなトランスファーピペットを使用して、フィルター膜上に溶液を解剖の低下を置く。液が膜に広がるまで〜15秒待ってください。この時間の間に、網膜組織は、フィルター膜に付着するであろう。
   2. フィルターの下や周りに、より冷たい解剖ソリューションを注ぐ。フィルター膜と網膜組織がフロートします。鉗子でフィルター膜をつかみ、スライシング室に配置します。組織上の解剖ソリューションを注ぎ、そして暗箱で準備を格納する。
      注：ここで説明する手順は非常に重要です。これは、網膜組織は、フィルタMEMにこだわっていることを確認するために迅速にこれらのステップを実行することが重要ですブレーンと乾燥しない。
10. チョッパーを用いて、スライスに網膜組織を切断する。約200μmの厚さは、パッチクランプ研究のために可能である。
11. スライスチャンバ内のグリースレールにプラスチック製のカバースリップを置きます。プラスチックカバースリップ上グリースレールの上に網膜スライスを転送します。横断面が見えるようにスライスを90°回転させます。押し下げてカバースリップ上にフィルタ膜が、その後、グリースをろ紙の側面を覆う。
    1. スライスはプラスチック製カバースリップ上に固定化された後、カバースリップをつかみ、35ミリメートルのプラスチックの皿に移す。網膜の準備に冷たい解剖ソリューションを注ぎ、準備を水没。継続的に酸素化されるべきである暗箱で各皿を、保管してください。
       注：すべての手順は、フィルター膜が変形しないように慎重に行う必要がある。そうでない場合は、網膜のスライスが簡単にフィルター膜から離れる。

1. 録音の準備：
   1. 首相エイムズ」媒体との灌流チューブが。チューブを充填するとき、すべての気泡が通過できるように。
   2. プラーでパッチクランプ記録ピペットを作る。ピペットチップが埋め戻されるまで1分間ピペットの裏側でピペット溶液、ディップピペットを充填する。次に、マイクロピペットフィラーを使用してピペットの〜1月3日を記入してください。湿ったピペットボックスの各ピペットを保管してください。
   3. パッチクランプ記録のための機器の電源を入れ、コンピュータ、増幅器、CCDカメラ、顕微鏡を含む。
2. 室内光を遮断してください。赤外線ビューアを使用して顕微鏡ステージ室への網膜スライス標本を置きます。それが固定化された後、連続灌流を開始する。 33から37℃での灌流温度を設定します。
3. CCDカメラでスライス面を表示します。ターゲットCEターゲットの場所に焦点を当てるLLタイプが存在する。 （ すなわち、それは滑らかに見える表面と良好な細胞形状を持つべき）記録パッチクランプのための健康そうなセルを選択します。
4. ピペットホルダーに記録ピペットを置きます。スライス標本にピペットを進める。それはスライス標本（上〜2ミリメートル）に近い場合、顕微鏡でピペットの先端を見つける。ピペットチップは、顕微鏡下で可視になると、標的細胞に向かって下に先端を移動させる。
5. アンプを設定します。 0 MV / 0 PA（ゼロ）でピペットを調整し、〜10Hzで〜5 mVのの連続電気パルスを開始します。ピペット抵抗をチェックします。理想的な抵抗はほとんどの網膜神経細胞のために、5〜10MΩです。
6. 先端から吹き出す開始します。マウスピースを使用するか、またはピペットは、浴溶液に浸漬する際に正圧を適用するために、注射器を使用しています。先端は、標的細胞の表面上にあるまで、連続的に内部液を吹き飛ばす。
   1. 正圧が目の上の小さなディンプルを行うとE細胞表面、少し先端を進め、吹き出し停止。増加するはずであるピペット抵抗を、確認してください。それが継続的に増加している場合、それを残して、それが> 1GΩ（ギガシール）に達するまで抵抗を監視します。抵抗が自然に増加しない場合は、ギガシールになるまで、穏やかに負圧を加える。
7. ギガシールが達成された後、mVのを-70する保持電位を変更する。その後、断続的に、ピペットチップの内部に膜を破裂する負圧を適用する。全細胞構成が行われると、ピペット抵抗は500MΩと1GΩ、容量性電流が見られるの間とすることができる。時々自発性シナプス後電流を観察することができる。
8. -80から+ 40mVまでのIV関係を記録。電位依存性チャネルの異なる種類の細胞型に依存して活性化される。
9. レコード·光誘発シナプス電流または電圧。

Representative Results

代表的なスライス標本は、スライス標本が平坦面に神経節細胞の光受容体を示す、真っ直ぐな位置にある。 図1に示されず、濾紙からの剥離される。スライスが傾いている場合、製剤の唯一の部分は、それが困難なパッチクランプのための適切な細胞を同定することを可能にする焦点である。記録のために、それは通常、光沢のある表面を有して良い相馬、さえ丸い形状、目に見える暗いプラークを選択することが重要である。細胞全体の構成が行われた後、スライス工程光（ 図2）に、バックグラウンド光で露光した。光誘発性興奮性シナプス後電位（L-のEPSP）が（タイミングは黄色で示されている）、ステップ光に応答して誘発した。ピーク振幅および減衰時間は、細胞型およびサブタイプに依存して変化した。神経節細胞は、明るい刺激（ 図2のD＆E）に応答して活動電位を生成した。セルLタイプとその形態学的サブタイプは、生理的な録音（ 図2、右）の後にローダミン標識により明らかにされた。

図1.網膜スライス標本。（A）10倍の対物レンズを使用して表示網膜スライス標本。網膜スライス標本（上）は、ろ紙（下）のピースに取り付けた。 （B）60Xの目的で表示網膜スライス標本を示す4-画像コンピレーション。各細胞層が明確に（ONL：外顆粒層、OPL：外網状層、INL：内顆粒層、IPL：内網状層、GCL：神経節細胞層）が観察され、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

網膜神経細胞から、図2の光誘発興奮性シナプス後電位（L-のEPSP）。ステップ·ライト（左）L-のEPSPを誘発。 60％ウェーバーコントラスト - 光強度は30だった。背景光順応レベルは4×10 ⁴光子^/μm2で/秒であった。スルホローダミンB（右）を記録ニューロンを可視化するために記録するパッチクランプの間に注入した。記録ピペットが依然としてオン錐体双極細胞から細胞体（A）L-EPSPをスルホローダミン染色に取り付けた。 （B）OFF錐体双極細胞。 （C）アマクリン細胞。神経節細胞ON（D）。神経節細胞OFF（E）。スケールバーは述べたように2または5 mVのを示している。光刺激を1秒間印加した。 こちらをクリックしてくださいこの図の拡大版を表示します。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice (28-60 days old, male)	Jackson laboratory	C57BL/6J strain
Ames' medium powder	Sigma	A1420	excellent
Stereo microscope	Nikon	SMZ745	excellent
Dissecting tool: forceps	Dumont	#4, #5, #55	excellent
Dissecting tool: scissors	Roboz	RS-5605	excellent
Dissecting tool: surgery knife	Surgistar	7514	excellent
Razor blade (for chopper)	EMS	71970	excellent
Chopper	handmade
Infrared viewer	Night Owl Optics	NOBG1	It shows bright view. Focusing small objects is an issue.
Puller	Sutter	P-1000	excellent; makes consistent size pipettes.
Dark box	Pelican	dark box	excellent
Patch clamp system	Scientifica	slice scope 2000	Excellent setup. Most key components are included in one package. Micromanipulators are excellent.
Amplifier	Molecular Devices	multiclamp 700B	Excellent and easy control.
Acquiring software	Molecular Devices	pClamp software	Excellent and easy control.
Light source (LED)	Cool LED	pE-2 4 channel system	Excellent
CCD camera	Q-imaging	Retiga 2000	Excellent
Faraday cage	handmade