Abstract
Retina görsel sisteme kapıdır. Görsel sinyal işleme mekanizmaları anlamak için, biz retina sinir ağı işlevlerini araştırmak. Ağda Retinal nöronlar çok sayıda alt-tiplerinin içermektedir. Bipolar hücreler, ganglion hücrelerinin ve amacrine hücrelerinin fazla 10 alt tipi morfolojik çalışmalarla tespit edilmiştir. Retina nöronlarının birden fazla alt tipleri, hareket ve renk, görsel sinyal belirgin özellikler, kodlayan ve birden çok sinir yolları oluşturmak üzere düşünülmektedir. Bununla birlikte, görsel sinyal işleme her bir nöronun fonksiyonel rolleri tam olarak anlaşılmış değildir. yama kelepçe yöntemi bu temel soruyu ele almak yararlıdır. Burada, bir protokol sağlanır koyu adapte koşullarda yama kelepçe kayıtları kullanarak fare retina nöronlar ışık uyarılmış sinaptik yanıtları kaydetmek için. Fare gözler O / N koyu adapte olup, retina dilim hazırlıkları kızılötesi aydınlatma ve izleyiciler kullanarak karanlık bir odada disseke edilir. Kızılötesi ışık yokFare fotoreseptörleri etkinleştirmek ve böylece ışık yanıt korur. Patch kelepçe retina nöronlar ışık uyarılmış yanıtları kaydetmek için kullanılır. Bir floresan boya nöronal morfolojik alt tipleri karakterize etmek kayıtları sırasında enjekte edilir. Bu prosedür, fare retinanın her nöronun fizyolojik fonksiyonlarını belirlemek için bize sağlar.
Protocol
Etik Beyanı: Hayvan denekleri Prosedürleri Wayne State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
Deneysel Çözüm 1. Hazırlık
- Gerçek deneyden önce diseksiyon çözeltisini 1 gün hafta 1 hazırlayın. Çünkü düşük sıcaklıklarda 16 de güçlü tamponlama yeteneği retina diseksiyon için bir HEPES tampon solüsyonu kullanın. (MM olarak) aşağıdaki gibi kimyasalları karıştırın: 115 NaCl, 2.5 KCl, 2.5 CaCl2, 1.0 MgCl2, 10 HEPES, 28 glikoz ihtiva eder. NaOH ile 7.4'e pH ayarlayın. 1 hafta buzdolabı yukarı çözümü tutun.
- kayıt solüsyonu retina preparasyonlar 17 için tasarlanmış yapay beyin omurilik sıvısı (CSF) 'dir Ames aracı. Deney günü olarak, bir tüp içinde Ames tozu (500 ml çözelti için 4.4 g) tartılır. Ayrıca, NaHCO 3 (500 ml çözelti için 0.95 g) tartmak ve A ile karıştırınMES'in toz.
- Deney günü ile yama kelepçe kayıtları için hücre içi pipet çözüm hazırlayın. (MM olarak) aşağıdaki gibi kimyasalları karıştırma: 111, K-glukonat, 1.0 CaCl2, 10 HEPES, 1.1 EGTA, 10 NaCl, 1.0 MgCl2, 5 ATP, Mg ve 1,0 GTP Na. KOH ile pH'ı 7.2'ye ayarlayın. Geleneksel şırınga filtresi ile pipet çözüm Filtre. ~ 500 ul hacimde yapın ve bir dondurucu veya derin dondurucuda saklayabilirsiniz.
Deney Günü 2. Hazırlık
- O / N karanlık adaptasyonu için karanlık bir alanda - (erkek, 8 haftalık 4, C57BL / 6J veya benzeri bir arka plan) gece deneyden önce, bir kafes içinde bir fare koyun.
- Diseksiyon için hazırlık:
- En az 10 dakika süreyle oksijen ile, bir cam beher içinde - (200 mi, 100), buz üzerine yerleştirin ve kabarcık çözeltisi kesme doldurun.
- Retina hazırlık depolama için karanlık kutu oksijenasyonu başlatın.
- Yeniden gres için raylar ile plastik lamelleri hazırlayınintestinal dilim preparasyonlar 35 mm plastik tabak, her biri koyun.
- Bir helikopter (doku dilimleme makinesi) yeni bir jilet takın.
- Iki eşit parçaya, bir filtre membranı kesin. Bu retina dilimleme içindir.
- Mikroskop yakın diseksiyon araçları ve transfer pipet hizalayın. Her aracı kolayca karanlıkta erişilebilir, böylece çalışma alanı iyi organize edilmelidir.
- Yama kelepçe kayıtları için hazırlık:
- Ames tozu ve damıtılmış su içinde NaHCO 3 (Ames 4.4 g NaHCO 3 0.95 g / 500 mi GKD 2 O) içinde çözülür. Karışık oksijen ile kabarcık Ames ortamı (% 95 O2 ve% 5 CO2), en azından 30 dakika için ise bir kayıt sıcaklık seviyesine ısıtma (~ 35 ° C). Hala köpüren ise NaHCO3 ile 7.4 pH ayarlayın.
- Diseksiyon sırasında iç pipet çözüm çözülme. Çözündürüldükten sonra, hücre içi boyama için,% 0.01 sülforhodamin B ekleyin.
3. Retina Diseksiyon
- Karanlık bir odada, karbon dioksit ve bilateral pnömotoraks kullanarak fare euthanize. 2 Sonra - karbondioksit kullanarak 3 dakika, fare bilincini kaybeder.
- Fare artık kuyruk-çimdiği yanıt zaman hızlı bir şekilde gözler enükleasyonu ve bir plastik tabak soğuk kesme çözeltisi içine yerleştirin. Hayvanın ölümü sağlamak için ikili pnömotoraks gerçekleştirin. Hızla karanlık kutuya çanak göz saklayın. Karanlıkta prosedürü yürütmek için bir kızılötesi görüntüleyicisi kullanın.
Not: Alternatif olarak, izofluran, dekapitasyon veya servikal dislokasyon ötenazi için kullanılabilir. ötenazi yöntemi Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH) ve / veya Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu kurallara uymalıdır. - Karanlık bir odada, diseksiyon mikroskobu ve kızılötesi aydınlatma ayarlayın. Mikroskop altında, 10 cm plastik tabak w içine çanak göz aktarınsoğutulmuş kesme solüsyon i. Sürekli boru içinden kabarcık oksijen plastik tabak altına yerleştirdi. Çok düşük değil yani akış sesini ayarlayın, ancak diseksiyon rahatsız kadar yüksek olmadığından emin olun.
- Kornea ve lens temizleme:
- Bir mikro-cerrahi bıçakla kornea üstünde bir kesi yapmak. Göz küresinin diğer ucunda optik sinir tutarak hareket gözü engeller. Cerrahi bir makas kullanarak kesim uzatın. Etrafında bazı sklera ile kornea kesin.
- Ince forseps ile objektif tut ve yavaşça lensi çekin. Vitreus lens çıkarmak için çok yapışkan ise, bir makas ile vitreus kesti.
- Göz-fincan yapıldıktan sonra, yavaşça küçük bir transfer pipet ile Göz yuvası içine soğuk, oksijenli kesme çözümü dökün.
NOT: Bir kesi korneada yapıldıktan sonra gözün çabuk söner. Bu pro sırasında göz deforme gibi göz şeklini korumak için önemlidirketencik retinaya zarar ve retina dekolmanı neden olacaktır.
- Retinanın dorsal ve ventral tarafı belirlenmesi:
Not: yeşil ve morötesi (UV) düzensiz bir dağılım özel retina alanı belirleme 18 koniler için hafif tepki kayıtlar için önemlidir.- Optik sinir başı yakınında geçen retina göz fincan karşısına gidiyor çizgi belirleyin. Bu hat, çoğunlukla optik sinirin ventral tarafında boyunca geçer; Diğer 19 ventral ise optik sinir dahil yan, sırt tarafı. Kızılötesi izleyiciler altında açıkça bu dönüm bakın.
- Deney amacına bağlı olarak, gereksiz tarafında bir kesim yapmak. Bu göz fincan retina izole sonra yararlı olacaktır.
- Camsı kaldırma:
- İsteğe bağlı olarak, 15 dakika için hiyaluronidaz (0.5 mg / ml) ile göz fincan inkübe edilir.
- Ekstra ince forseps ile vitrözü çıkarın. vitreus esasalt ve göz bardağın dış kenarına eklenerek. Yavaşça dokunmadan veya retina alay etmeden çıkarın. Vitreus sıkıca Göz yuvası takılı olabilir gibi, göz fincan retina dekolmanı önlemek için yavaşça çıkarın. Hiçbir gerginlik hissedilir kadar çekmeye devam edin.
Not: Bu adım fare retinasına kesme için özellikle önemlidir; Bununla birlikte, bu tür sıçan veya salamanderin gibi diğer türlerin retinalarında için bir sorun değildir.
- Göz-fincan retina izole edin. Sklera tut ve yavaşça forseps ters kullanılarak retina soyulabilir.
NOT: retina hazırlıkları Tüm montaj izole retina yapılabilir. Kenarlarda 3-4 kesim yapmak ve retina düzleştirmek ya da birkaç parçaya kesilmiş retina. - Retina Trim ve retinanın gereksiz yarısını atın (3.5 adım). Aynı plastik tabak, iki parçaya kalan retina kesti. Retinanın her parça için, bir yapmak için kenarları kesilmişretina döşeme ve katlama kenarları kırpın.
- Büyük bir transfer pipeti (~ 2 mL) kullanılarak bir cam plaka üzerine bir retina levha aktarın. Küçük bir pipet ile aşırı çözümü Suck slab düzleştirmek için filtre kağıt parçası kullanın ve ardından hızla doku üstünde filtre membran bir parça koyun.
- Küçük bir transfer pipet kullanarak, filtre zarı üzerinde çözüm diseksiyon bir damla yerleştirin. Çözelti zarın yayılır kadar ~ 15 saniye bekleyin. Bu süre zarfında, retina dokusu filtre zarı sopa olacak.
- Altında ve filtre etrafında daha soğuk diseksiyon çözüm dökün. Filtre membran ile retina dokusu yüzer. Bir forseps ile filtre membran tut ve dilimleme odasına yerleştirin. Doku üzerinde çözüm diseksiyon dökün ve karanlık kutuya hazırlık saklayın.
NOT: Burada anlatılan prosedür önemlidir. Bu sağlamak için hızlı bir şekilde bu adımları gerçekleştirmek için önemli olduğunu filtre hafızasına retina dokusu sopabran ve kurumaz.
- Bir helikopter kullanarak, dilimler halinde retina dokusu kesti. Yaklaşık 200 mikron kalınlığında yama kelepçe çalışmaları için uygundur.
- Dilimleme odasında gres raylar ile bir plastik lamel yerleştirin. Plastik lamel gres rayların üstünde bir retina dilim aktarın. Enine bölüm görünür şekilde dilim 90 ° döndürün. Daha sonra, lamel üzerine aşağı filtre membranı basın yağ ile filtre kağıdı tarafı kapsamaktadır.
- Dilim plastik lamel üzerinde hareketsiz sonra, lamel kapmak ve 35 mm plastik tabak aktarmak. Retina hazırlık üzerine soğuk diseksiyon çözüm dökün ve hazırlık daldırın. Sürekli oksijenli gereken karanlık kutunun her yemeğin, saklayın.
NOT: Tüm prosedür filtre membran deforme etmeyecek şekilde dikkatli yapılması gerekiyor. Aksi takdirde, retina dilim kolayca filtre zarından ayrılır.
- Dilim plastik lamel üzerinde hareketsiz sonra, lamel kapmak ve 35 mm plastik tabak aktarmak. Retina hazırlık üzerine soğuk diseksiyon çözüm dökün ve hazırlık daldırın. Sürekli oksijenli gereken karanlık kutunun her yemeğin, saklayın.
- Hazırlık Kayıt:
- Ames 'orta ile Başbakan perfüzyon tüpleri. Boru doldururken tüm kabarcıklar geçmesine izin verin.
- Bir çektirmesi ile yama kelepçe kayıt pipetler olun. Pipet backfilled kadar 1 dakika boyunca bir pipet arka pipet çözeltisi, daldırma ile bir pipet doldurmak için. Sonraki, bir mikro-pipet dolgu kullanılarak pipet ~ 1/3 'doldurunuz. Nemli pipet kutusu, her pipet saklayın.
- Yama kelepçe kayıtları için ekipman açın; bilgisayar, amplifikatör, CCD kamera, mikroskop ve dahil.
- Oda ışığı kapatın. Kızılötesi görüntüleyici kullanarak mikroskop sahne odasının üzerine bir retina dilim hazırlık yerleştirin. Bu hareketsiz kılındıktan sonra, sürekli perfüzyon başlar. 33-37 ° C'de perfüzyon sıcaklığını ayarlayın.
- CCD kamera ile dilim yüzeyini görüntüleyin. Hedef yere odaklanın nerede hedef cell türleri bulunur. Yama kelepçe kayıt için sağlıklı görünümlü hücreyi seçin (örneğin, pürüzsüz görünümlü yüzey ve iyi bir hücre şekli olmalıdır).
- Bir pipet tutucu bir kayıt pipet yerleştirin. Dilim hazırlık pipet Advance. Bu dilim hazırlama (~ yukarıdaki 2 mm) yakın olduğunda, mikroskop ile pipet ucu bulabilirsiniz. Pipet ucu mikroskop altında görülebilir sonra, hedef hücreye doğru ucu aşağı hareket ettirin.
- Amplifikatör ayarlayın. (Sıfırlama) 0 mV / 0 pA de pipet ayarlayın ve 10 Hz ~ En ~ 5 mV sürekli elektrik darbe başlar. Pipet direnci kontrol edin; İdeal direnç çoğu retina nöronlar için 5 ila 10 MΩ olduğunu.
- Ucundan dışarı üfleme başlayın. Bir ağızlık kullanın, ya da pipet banyo çözeltisi içine dips zaman pozitif basınç uygulamak için, bir şırınga kullanın. Ucu hedef hücrenin yüzeyinde kadar sürekli iç çözüm darbe.
- Pozitif basınç th küçük bir çukur yaptığındae hücre yüzeyi, biraz ucu ilerlemek ve üfleme durdurun. Artmalıdır pipet direnci, kontrol edin. Sürekli artıyorsa, bırakın ve> 1 GΩ (gigaseal) ulaşıncaya kadar direnç izlemek. Direnç kendiliğinden artmaz ise bir gigaseal olana kadar, yavaşça negatif basınç uygulayın.
- Gigaseal gerçekleştirildikten sonra mV -70 için tutma potansiyeline değişir. Sonra, aralıklı pipet içindeki membran rüptürü negatif basınç uygulayın. Tam hücre konfigürasyonu yapıldığında, pipet direnci 500 MΩ ve 1 GΩ ve kapasitif akım görülmektedir arasında olabilir. Bazen spontan postsinaptik akımlar görülebilir.
- -80 Den +40 mV IV ilişkisini kaydedin. Voltaj kapılı kanallar farklı tipte hücre tipine bağlı olarak aktive edilir.
- Tutanak sinaptik akımları ya da gerilimleri ışık uyarılmış.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bir temsilci dilim dilim hazırlama hazırlama düz bir yüzeye ganglion hücrelerinin fotoreseptörleri gösteren, düz konumda. Şekil 1'de gösterildiği ve filtre kağıdı hiçbir dekolmanı olduğu. Bir dilim hareket ettirildiğinde ise, hazırlık sadece bir parçası zor yama sıkma için uygun bir hücreyi tanımlamak için yapar, odak olduğunu. Kayıtları için, genellikle parlak yüzeye sahip iyi bir soma, bir hatta yuvarlak şekil ve görünür hiçbir karanlık plaklar seçmek önemlidir. Bütün hücre konfigürasyonu yapılmış sonra, dilim adım hafif (Şekil 2), daha sonra arka plan ışığı maruz kalmış ve edilmiştir. Işık uyarılmış eksitatör postsinaptik potansiyeller (L-EPSP'ler) (zamanlama sarı gösterilir) bir adım ışık yanıt uyarılmış edildi. tepe genlik ve hücre tipine ve alt tipine bağlı olarak değişkenlik çürüme süresi. Bir ganglion hücre parlak uyaranlara (Şekil 2 D & E) yanıt olarak oluşturulan aksiyon potansiyelleri. cell tipi ve morfolojik alt tipi fizyolojik kayıtları (sağ Şekil 2) sonra sülforhodamin etiketleme ortaya çıkarılmıştır.
Şekil 1. Retina dilim hazırlıkları. (A) 10X amacı ile inceledi bir retina dilim hazırlama. Retinal dilim hazırlanması (üst) filtre kağıdı (alt) 'in bir parça bağlanmıştır. (B) 60X amacı ile inceledi retina dilim hazırlık gösteren dört görüntü derleme. Her hücre tabakası açıkça görülmektedir (: Dış nükleer tabaka, OPL: dış pleksiform tabakası, INL: iç nükleer tabaka, IPL: ONL iç pleksiform tabakası, GCL: ganglion hücre tabakası) Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil retina nöronlardan 2. Işık-uyarılmış eksitatör postsinaptik potansiyeller (L-EPSP'ler). Adım ışık L-EPSPS (solda) uyarılmış. 60% Weber kontrast - ışık yoğunluğu 30 oldu. Arka plan ışığı adaptasyon seviyesi 4 x 10 4 fotonlar / um 2 / sn idi. Sülforhodamin B (sağ) kaydedilen nöronlar görselleştirmek için kayıt yama kelepçe sırasında enjekte edildi. Bir kayıt pipet yine bir ON konik uçlu hücre soma (A) L-EPSPS ve sülforodamin boyama bağlanmıştır. (B) KAPALI koni bipolar hücre. (C) amacrine hücresi. Ganglion hücre AÇIK (D). Ganglion hücre KAPALI (E). Belirtildiği gibi Ölçek çubuğu 2 veya 5 mV gösterir. Işık uyarımı 1 saniye uygulandı. tıklayınızBu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice (28-60 days old, male) | Jackson laboratory | C57BL/6J strain | |
| Ames' medium powder | Sigma | A1420 | excellent |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ745 | excellent |
| Dissecting tool: forceps | Dumont | #4, #5, #55 | excellent |
| Dissecting tool: scissors | Roboz | RS-5605 | excellent |
| Dissecting tool: surgery knife | Surgistar | 7514 | excellent |
| Razor blade (for chopper) | EMS | 71970 | excellent |
| Chopper | handmade | ||
| Infrared viewer | Night Owl Optics | NOBG1 | It shows bright view. Focusing small objects is an issue. |
| Puller | Sutter | P-1000 | excellent; makes consistent size pipettes. |
| Dark box | Pelican | dark box | excellent |
| Patch clamp system | Scientifica | slice scope 2000 | Excellent setup. Most key components are included in one package. Micromanipulators are excellent. |
| Amplifier | Molecular Devices | multiclamp 700B | Excellent and easy control. |
| Acquiring software | Molecular Devices | pClamp software | Excellent and easy control. |
| Light source (LED) | Cool LED | pE-2 4 channel system | Excellent |
| CCD camera | Q-imaging | Retiga 2000 | Excellent |
| Faraday cage | handmade |
References
- Werblin, F. S., Dowling, J. E. Organization of the retina of the mudpuppy, Necturus maculosus II. Intracellular recording. J Neurophysiol. 32 (3), 339-355 (1969).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
- Lukasiewicz, P., Werblin, F. A slowly inactivating potassium current truncates spike activity in ganglion cells of the tiger salamander retina. J Neurosci. 8 (12), 4470-4481 (1988).
- Kaneko, A., Tachibana, M. Effects of L-glutamate on the anomalous rectifier potassium current in horizontal cells of Carassius auratus retina. J Physiol. 358, 169-182 (1985).
- Kamermans, M., Werblin, F. GABA-mediated positive autofeedback loop controls horizontal cell kinetics in tiger salamander retina. J Neurosci. 12 (7), 2451-2463 (1992).
- Cook, P. B., McReynolds, J. S. Lateral inhibition in the inner retina is important for spatial tuning of ganglion cells. Nat Neurosci. 1 (8), 714-719 (1998).
- Pang, J. J., Gao, F., Wu , J. S. Light-evoked current responses in rod bipolar cells, cone depolarizing bipolar cells and AII amacrine cells in dark-adapted mouse retina. J Physiol. 558 (Pt. 558 (Pt 3), 897-912 (2004).
- Euler, T., Masland , R. H. Light-evoked responses of bipolar cells in a mammalian retina). J Neurophysiol. 83 (4), 1817-1829 (2000).
- Berntson, A., Taylor , W. R. Response characteristics and receptive field widths of on-bipolar cells in the mouse retina. J Physiol. 524 Pt. 524 (Pt 3), 879-889 (2000).
- Sterling, P., Smith, R. G. Design for a binary synapse. Neuron. 41 (3), 313-315 (2004).
- Borghuis, B. G., Marvin, J. S., Looger, L. L., Demb, J. B. Two-photon imaging of nonlinear glutamate release dynamics at bipolar cell synapses in the mouse retina. J Neurosci. 33 (27), 10972-10985 (2013).
- Dowling, J. E., Sidman, R. L. Inherited retinal dystrophy in the rat. J Cell Biol. 14, 73-109 (1962).
- Eggers, E. D., Lukasiewicz, P. D. GABA(A), GABA(C) and glycine receptor-mediated inhibition differentially affects light-evoked signalling from mouse retinal rod bipolar cells. J Physiol. 572 (Pt 1), 215-225 (2006).
- Ichinose, T., Lukasiewicz, P. D. The mode of retinal presynaptic inhibition switches with light intensity). J Neurosci. 32 (13), 4360-4371 (2012).
- Ichinose, T., Fyk-Kolodziej, B., Cohn, J. Roles of ON cone bipolar cell subtypes in temporal coding in the mouse retina. J Neurosci. 34 (26), 8761-8771 (2014).
- Baicu, S. C., Taylor, M. J. Acid-base buffering in organ preservation solutions as a function of temperature: new parameters for comparing buffer capacity and efficiency. Cryobiology. 45 (1), 33-48 (2002).
- Ames, A. 3rd, Nesbett, F. B. In vitro retina as an experimental model of the central nervous system. J Neurochem. 37 (4), 867-877 (1981).
- Haverkamp, S., et al. The primordial, blue-cone color system of the mouse retina. J Neurosci. 25 (22), 5438-5445 (2005).
- Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina. Nat Protoc. 5 (7), 1347-1352 (2010).
- Farre, C. G., M Bruggemann, A., Fertig, N. Ion channel screening - automated patch clamp on the rise. Drug discovery today. Technologies. 5 (1), e1-e34 (2008).
