Abstract
Nethinden er porten til det visuelle system. For at forstå visuelle signalbehandling mekanismer, undersøger vi retinale neurale netværksfunktioner. Retinale neuroner i netværket består af talrige undertyper. Mere end 10 undertyper af bipolære celler, ganglieceller og amacrine celler er blevet identificeret ved morfologiske studier. Flere undertyper af retinale neuroner menes at kode forskellige funktioner i visuel signalering, såsom bevægelse og farve, og danne flere nervebaner. Imidlertid er de funktionelle roller hver neuron i visuel signalbehandling ikke fuldt forstået. Den patch clamp-metoden er nyttigt at behandle dette grundlæggende spørgsmål. Her til en protokol registrere lys-fremkaldte synaptiske responser i mus retinale neuroner ved hjælp af patch clamp optagelser i mørke-tilpassede betingelser er tilvejebragt. Musen øjne er mørke-tilpassede O / N, og retinale skive præparater dissekeres i et mørkt rum ved hjælp af infrarød belysning og seere. Infrarødt lys ikkeaktivere mus fotoreceptorer og dermed bevarer deres lys lydhørhed. Patch klemme anvendes til at optage lys-fremkaldte reaktioner i retinale neuroner. Et fluorescerende farvestof indsprøjtes under optagelser til at karakterisere neuronale morfologiske undertyper. Denne procedure gør det muligt at bestemme de fysiologiske funktioner af hver neuron i mus nethinden.
Protocol
Etiske retningslinjer: procedurer, der involverer dyr forsøgspersoner blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) ved Wayne State University.
1. Fremstilling af Eksperimentel Solution
- Forbered dissekere opløsning 1 dag til 1 uge før selve forsøget. Brug en HEPES bufferopløsning for retinal dissektion grund af sin stærke buffering evne ved lavere temperaturer 16. Bland alle kemikalier som følger (i mM): 115 NaCl, 2,5 KCI, 2,5 CaCl2, 1,0 MgCl2, 10 HEPES, 28 glukose. Juster pH til 7,4 med NaOH. Opløsningen opbevares i køleskab op til 1 uge.
- Optagelsen løsning er Ames 'medium, der er en kunstig cerebral spinalvæske (aCSF) designet til retinale præparater 17. Ved dagen for eksperimentet, afvejes Ames 'pulver (4,4 g i 500 ml opløsning) i et rør. Også afvejes NaHCO3 (0,95 g i 500 ml opløsning) og blandes med Ames 'pulver.
- Forbered den intracellulære pipette løsning til patch clamp optagelser dag for dag af forsøget. Bland alle kemikalier som følger (i mM): 111 K-gluconat, 1,0 CaCl2, 10 HEPES, 1,1 EGTA, 10 NaCl, 1,0 MgCl2, 5 ATP-Mg, og 1,0 GTP-Na. Juster pH til 7,2 med KOH. Filtreres pipette løsning med et konventionelt filter sprøjte. Gør ~ 500 pi prøver og gemme dem i en fryser eller en fryser.
2. Forberedelse af Day of Experiment
- Natten før forsøget, anbringes en mus i et bur (C57BL / 6J eller lignende baggrund, 4-8 uger gammel, han) i et mørkt rum for O / N mørk tilpasning.
- Forberedelse til dissektion:
- Fyld dissekere opløsning (100 - 200 ml) i et glas bægerglas, placere den på is, og boble med ilt i mindst 10 min.
- Start iltning af mørk boks for retinal forberedelse opbevaring.
- Forbered plastik dækglas med fedt skinner til retinal slice præparater og placere hver af dem i et 35 mm plastik skål.
- Vedhæft en ny barberblad til en chopper (væv pålægsmaskine).
- Skær en filtermembran i to halvdele. Dette er for retinal udskæring.
- Flugt dissekere værktøjer og overførselspipetter nær dissektionsmikroskop. Arbejdsområdet skal være godt organiseret, så hvert værktøj er nemt tilgængelige i mørke.
- Forberedelse til patch clamp optagelser:
- Opløs Ames 'pulver og NaHCO3 i destilleret vand (Ames 4,4 g og NaHCO 3 0,95 g / 500 ml Hedeselskabet 2 O). Bubble Ames 'medium med blandet oxygen (95% O2 og 5% CO2) i mindst 30 minutter under opvarmning til en optagelse temperaturniveau (~ 35 ° C). PH justeres til 7,4 med NaHCO3 samtidig boblende.
- Optø den interne pipette opløsningen under dissektion. Når det er optøet, tilsættes 0,01% sulforhodamin B til intracellulær farvning.
3. Retinal Dissektion
- I et mørkt rum, aflive musen ved hjælp af kuldioxid og bilateral pneumothorax. Efter 2-3 min for at anvende kuldioxid, vil musen mister bevidstheden.
- Når musen ikke længere reagerer på en hale knibe, hurtigt enucleate øjnene og placere dem i en kold dissekere opløsning i en plastik skål. Udfør den bilaterale pneumothorax at sikre dyrets død. Hurtigt gemme øjet i skålen i mørke kassen. Brug en infrarød seeren til at gennemføre proceduren i mørke.
BEMÆRK: Alternativt isofluran, halshugning eller cervikal dislokation kan anvendes til eutanasi. Metoden til eutanasi bør følge retningslinjerne i National Institute of Health (NIH), og / eller Institutional Animal Care og brug Udvalg. - I et mørkt rum, justere dissektionsmikroskop og infrarød belysning. Under mikroskopet, overføre et øje fra dens skålen i en 10 cm plastskål wed den afkølede dissekere opløsning. Kontinuerligt boble oxygen gennem rør anbragt på bunden af plast skålen. Juster volumenstrømmen, så det ikke er for lav, men sikre, at det ikke er høj nok til at forstyrre dissektion.
- Hornhinden og linsen fjernelse:
- Lave et snit på toppen af hornhinden med en mikro-kirurgisk kniv. Holding synsnerven ved den anden ende af øjeæblet forhindrer øjet bevæge sig. Forlæng snittet ved hjælp af et par kirurgiske sakse. Klip hornhinden med nogle sclera omkring det.
- Grib linsen med en fin pincet og træk langsomt linsen ud. Hvis glaslegemet er for klistret til at fjerne linsen, skæres glaslegemet med en saks.
- Når øjet-cup er lavet, forsigtigt hælde koldt, iltet dissekere løsning i øjestykket med en lille overførsel pipette.
BEMÆRK: øjeæblet hurtigt tømmes efter et snit er lavet i hornhinden. Det er vigtigt at bibeholde formen af øjet deformere øje under dette proprocedure vil beskadige nethinden og forårsage nethindeløsning.
- Identifikation af dorsale og ventrale side af nethinden:
BEMÆRK: På grund af ulige fordeling af den grønne og den ultraviolette (UV) kegler 18, identificere et bestemt retinal område er vigtig for lette respons optagelser.- Identificer den linje går på tværs af retinal øjenkoppen passerer nær synsnervehovedet. Denne linje passerer hovedsagelig hele den ventrale side af den optiske nerve; den side herunder synsnerven er den dorsale side, mens den anden er ventral 19. Se denne skelsættende klart under infrarøde seere.
- Afhængigt af formålet med eksperimentet, lave et snit på unødvendig side. Det vil være nyttigt efter isolering nethinden fra øjet cup.
- Corpus fjernelse:
- Eventuelt inkuberes øjet-kop med hyaluronidase (0,5 mg / ml) i 15 min.
- Tag glaslegemet med ekstra fine pincet. Glaslegemet er hovedsageligfastgjort til bunden og den ydre kant af øjet-cup. Fjerne det forsigtigt uden at røre eller stikke nethinden. Da glaslegemet kan være tæt knyttet til øjestykket, fjern forsigtigt for at undgå nethindeløsning fra øjet-cup. Fortsæt med at trække, indtil der ikke spænding mærkes.
BEMÆRK: Dette trin er særlig vigtigt for dissekering muse nethinden; men det er ikke et problem for de nethinder af andre arter, såsom rotter eller salamander.
- Isoler nethinden fra øjet-cup. Tag sclera og forsigtigt skrælle nethinden ved hjælp af bagsiden af pincet.
BEMÆRK: Whole-mount retinale præparater kan fremstilles ud fra den isolerede nethinde. Gør 3-4 snit i kanterne og tromle nethinden, eller klippe nethinden i flere stykker. - Trim nethinden og kassér unødvendig halvdel af nethinden (trin 3.5). I samme plast skålen, klippe den resterende retina i to stykker. For hvert stykke af nethinden, afbrød kanterne at foretage enretinal plade, og trim foldekanterne.
- Overfør en retinal plade på en glasplade ved anvendelse af en stor transfer pipette (~ 2 ml). Opsuge overskydende opløsning med en lille pipette bruge et stykke filtrerpapir at flade plade, og derefter hurtigt at placere et stykke af filtermembranen på toppen af vævet.
- Ved hjælp af en lille overførsel pipette, placere en dråbe dissekere løsning på filteret membran. Vent ~ 15 sek, indtil opløsningen breder sig over membranen. I løbet af denne tid vil den retinale væv klæbe til filtermembranen.
- Hæld mere kold dissekere opløsning under og omkring filteret. Retinavæv med filtermembran vil flyde. Grab filtermembranen med en pincet og placer den i udskæring kammer. Hæld dissekere opløsning over vævet, og opbevar præparatet i mørke kassen.
BEMÆRK: Den her beskrevne procedure er kritisk. Det er vigtigt at udføre disse trin hurtigt for at sikre, at de retinale væv sticks til filteret membran og tørrer ikke ud.
- Ved hjælp af en chopper, sender retinavæv i skiver. Omkring 200 um tykkelse er muligt for patch clamp-forsøg.
- Placer en plastik dækglas med fedt skinner i udskæring kammer. Overfør en retinal skive på toppen af fedt skinner på en plastik dækglas. Drej skive 90 °, således at den tværgående del er synlig. Tryk filtermembranen ned på dækglasset, så dækker siderne af filtrerpapir med fedt.
- Efter at skive er immobiliseret på en plastik dækglas, tag fat i dækglasset og overføre det til en 35 mm plastik skål. Hæld kold dissekere løsning på nethinden forberedelse og nedsænke præparatet. Opbevar hver skål i mørke boks, som til stadighed iltet.
BEMÆRK: Hele proceduren skal gøres omhyggeligt, så filtermembranen ikke deformeres. Ellers retinal skive let adskilles fra filtermembranen.
- Efter at skive er immobiliseret på en plastik dækglas, tag fat i dækglasset og overføre det til en 35 mm plastik skål. Hæld kold dissekere løsning på nethinden forberedelse og nedsænke præparatet. Opbevar hver skål i mørke boks, som til stadighed iltet.
- Klargøring:
- Prime perfusionen rør med Ames 'medium. Lad alle boblerne til at passere igennem, når slangen påfyldning.
- Gør patch clamp optagelse pipetter med en aftrækker. For at fylde en pipette med pipette opløsning dip i bagsiden af en pipette i 1 min, indtil pipettespidsen er tilbagefyldt. Dernæst fylde ~ 1/3 af pipetten ved hjælp af en mikro-pipette fyldstof. Opbevar hver pipette i en fugtig pipette kassen.
- Tænd udstyr til patch clamp optagelser; herunder computer, forstærker, CCD-kamera, og mikroskop.
- Luk for rumbelysning. Placer en retinal forberedelse skive på mikroskopbordet kammer ved hjælp af en infrarød fremviser. Når det er immobiliseret, begynder kontinuerlig perfusion. Indstil perfusion temperaturen ved 33 til 37 ° C.
- Se skive overflade med CCD-kameraet. Fokus på målet sted, hvor target cell typer bor. Vælg et sundt udseende celle til patch clamp optagelse (dvs. det bør have glat udseende overflade og en god celleform).
- Placer en optagelse pipette i en pipette holder. Advance pipetten til forberedelsen skive. Når det er tæt på fremstillingen skive (~ 2 mm ovenfor) finde spidsen af pipetten med mikroskopet. Når pipettespidsen er synlig under mikroskop bevæge spidsen ned mod målcellen.
- Indstil forstærkeren. Juster pipette ved 0 mV / 0 pA (nulstilling) og starte en kontinuerlig elektrisk puls på ~ 5 mV ved ~ 10 Hz. Kontroller pipette modstand; ideel modstand er mellem 5 og 10 MOhm for de fleste retinale neuroner.
- Begynd blæser ud fra spidsen. Brug et mundstykke eller bruge en sprøjte til at anvende positivt tryk, når pipetten dypper i badopløsningen. Løbende blæse indre opløsning, indtil spidsen er på overfladen af målcellen.
- Når det positive tryk laver en lille fordybning på the celleoverfladen, fremføre spidsen lidt og stoppe blæser ud. Kontroller pipette modstand, som skal øges. Hvis det er konstant stigende, forlade det og overvåge modstanden, indtil den når> 1 GQ (gigaseal). Hvis modstanden ikke spontant øges forsigtigt anvende negativt tryk, indtil det bliver en gigaseal.
- Efter gigaseal opnås, ændre bedrift potentiale til -70 mV. Derefter intermitterende anvendelse undertryk til at briste membranen inde i pipettespidsen. Når hele celler konfigurationen er foretaget, kan pipetten modstand være mellem 500 MQ og 1 GQ, og ses den kapacitive strøm. Sommetider spontane postsynaptiske strømme kan observeres.
- Optag IV forhold fra -80 til +40 mV. Forskellige typer af spændingsstyrede kanaler aktiveres afhængigt af celletype.
- Record lys fremkaldte synaptiske strømme eller spændinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et repræsentativt udsnit præparat er vist i figur 1. Fremstillingen skive er i en lige stilling, viser fotoreceptorer til ganglieceller i en flad overflade, og ingen adskillelse fra filtrerpapir. Hvis en skive vippes, kun en del af præparatet er i fokus, hvilket gør det vanskeligt at identificere en egnet celle til patch fastspænding. For optagelser, er det vigtigt at vælge en god soma, som normalt har en skinnende overflade, en endnu rund form, og ingen synlige mørke plaques. Efter helcelle konfiguration blev foretaget, blev udsnittet udsat for baggrundslys og derefter til et trin-lys (figur 2). Light-fremkaldte excitatoriske postsynaptiske potentialer (L-EPSPS) blev fremkaldt som reaktion på en trin-lys (timing er vist med gult). Spidsamplituden og henfaldstid varieres afhængigt af celletypen og subtype. Et ganglion celle genereret aktionspotentialer i respons på lyse stimuli (Figur 2 D & E). Den cell type og dens morfologiske subtype blev afsløret af sulforhodamin mærkning efter fysiologiske optagelser (Figur 2, højre).
Figur 1. Retinale skive præparater. (A) en retinal skive forberedelse set med en 10X målsætning. En retinal præparat skive (øverst) blev fastgjort til et stykke filtrerpapir (nederst). (B) En fire-image udarbejdelse viser en retinal skive præparat ses med et 60X objektiv. Hver celle lag klart observeret (ONL: ydre nukleare lag, OPL: ydre netformige lag, INL: inderste nukleare lag, IPL: inderste plexiform lag, GCL: ganglion cellelag) Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2. Lette fremkaldte excitatoriske postsynaptiske potentialer (L-EPSPS) fra retinale neuroner. Trin-lys fremkaldt L-EPSP'er (til venstre). Lysintensiteten er 30 - 60% Weber kontrast. Baggrund lys tilpasning niveauet var 4 x 10 4 fotoner / um 2 / sek. Sulforhodamin B blev injiceret under patch clamp optagelse at visualisere optaget neuroner (højre). En optagelse pipette var stadig knyttet til soma (A) L-EPSP'er og sulforhodamin farvning fra en ON kegle bipolar celle. (B) OFF kegle bipolar celle. (C) amacrine celle. (D) ganglion celle. (E) OFF ganglion celle. Scale bar angiver 2 eller 5 mV som bemærket. Lys stimulation blev anvendt i 1 sek. Klik herfor at se en større udgave af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice (28-60 days old, male) | Jackson laboratory | C57BL/6J strain | |
| Ames' medium powder | Sigma | A1420 | excellent |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ745 | excellent |
| Dissecting tool: forceps | Dumont | #4, #5, #55 | excellent |
| Dissecting tool: scissors | Roboz | RS-5605 | excellent |
| Dissecting tool: surgery knife | Surgistar | 7514 | excellent |
| Razor blade (for chopper) | EMS | 71970 | excellent |
| Chopper | handmade | ||
| Infrared viewer | Night Owl Optics | NOBG1 | It shows bright view. Focusing small objects is an issue. |
| Puller | Sutter | P-1000 | excellent; makes consistent size pipettes. |
| Dark box | Pelican | dark box | excellent |
| Patch clamp system | Scientifica | slice scope 2000 | Excellent setup. Most key components are included in one package. Micromanipulators are excellent. |
| Amplifier | Molecular Devices | multiclamp 700B | Excellent and easy control. |
| Acquiring software | Molecular Devices | pClamp software | Excellent and easy control. |
| Light source (LED) | Cool LED | pE-2 4 channel system | Excellent |
| CCD camera | Q-imaging | Retiga 2000 | Excellent |
| Faraday cage | handmade |
References
- Werblin, F. S., Dowling, J. E. Organization of the retina of the mudpuppy, Necturus maculosus II. Intracellular recording. J Neurophysiol. 32 (3), 339-355 (1969).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
- Lukasiewicz, P., Werblin, F. A slowly inactivating potassium current truncates spike activity in ganglion cells of the tiger salamander retina. J Neurosci. 8 (12), 4470-4481 (1988).
- Kaneko, A., Tachibana, M. Effects of L-glutamate on the anomalous rectifier potassium current in horizontal cells of Carassius auratus retina. J Physiol. 358, 169-182 (1985).
- Kamermans, M., Werblin, F. GABA-mediated positive autofeedback loop controls horizontal cell kinetics in tiger salamander retina. J Neurosci. 12 (7), 2451-2463 (1992).
- Cook, P. B., McReynolds, J. S. Lateral inhibition in the inner retina is important for spatial tuning of ganglion cells. Nat Neurosci. 1 (8), 714-719 (1998).
- Pang, J. J., Gao, F., Wu , J. S. Light-evoked current responses in rod bipolar cells, cone depolarizing bipolar cells and AII amacrine cells in dark-adapted mouse retina. J Physiol. 558 (Pt. 558 (Pt 3), 897-912 (2004).
- Euler, T., Masland , R. H. Light-evoked responses of bipolar cells in a mammalian retina). J Neurophysiol. 83 (4), 1817-1829 (2000).
- Berntson, A., Taylor , W. R. Response characteristics and receptive field widths of on-bipolar cells in the mouse retina. J Physiol. 524 Pt. 524 (Pt 3), 879-889 (2000).
- Sterling, P., Smith, R. G. Design for a binary synapse. Neuron. 41 (3), 313-315 (2004).
- Borghuis, B. G., Marvin, J. S., Looger, L. L., Demb, J. B. Two-photon imaging of nonlinear glutamate release dynamics at bipolar cell synapses in the mouse retina. J Neurosci. 33 (27), 10972-10985 (2013).
- Dowling, J. E., Sidman, R. L.
- Eggers, E. D., Lukasiewicz, P. D. GABA(A), GABA(C) and glycine receptor-mediated inhibition differentially affects light-evoked signalling from mouse retinal rod bipolar cells. J Physiol. 572 (Pt 1), 215-225 (2006).
- Ichinose, T., Lukasiewicz, P. D. The mode of retinal presynaptic inhibition switches with light intensity). J Neurosci. 32 (13), 4360-4371 (2012).
- Ichinose, T., Fyk-Kolodziej, B., Cohn, J. Roles of ON cone bipolar cell subtypes in temporal coding in the mouse retina. J Neurosci. 34 (26), 8761-8771 (2014).
- Baicu, S. C., Taylor, M. J. Acid-base buffering in organ preservation solutions as a function of temperature: new parameters for comparing buffer capacity and efficiency. Cryobiology. 45 (1), 33-48 (2002).
- Ames, A. 3rd, Nesbett, F. B. In vitro retina as an experimental model of the central nervous system. J Neurochem. 37 (4), 867-877 (1981).
- Haverkamp, S., et al. The primordial, blue-cone color system of the mouse retina. J Neurosci. 25 (22), 5438-5445 (2005).
- Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina. Nat Protoc. 5 (7), 1347-1352 (2010).
- Farre, C. G., M Bruggemann, A., Fertig, N. Ion channel screening - automated patch clamp on the rise. Drug discovery today. Technologies. 5 (1), e1-e34 (2008).
