Abstract
La retina es la puerta de entrada al sistema visual. Para entender los mecanismos de procesamiento de señales visuales, investigamos las funciones de redes neuronales de la retina. Neuronas de la retina en la red forman parte de numerosos subtipos. Más de 10 subtipos de células bipolares, células ganglionares, células amacrinas y han sido identificados por los estudios morfológicos. Múltiples subtipos de neuronas de la retina se cree que codificar distintas características de señalización visual, tales como el movimiento y el color, y formar múltiples vías neurales. Sin embargo, los papeles funcionales de cada neurona en el procesamiento de señal visual no se entienden completamente. El método de patch clamp es útil para abordar esta cuestión fundamental. Aquí, un protocolo para registrar las respuestas sinápticas luz evocadas en las neuronas de la retina de ratón utilizando grabaciones de patch clamp en condiciones adaptadas a la oscuridad se proporciona. Los ojos del ratón son adaptado a la oscuridad O / N, y el tramo preparativos de la retina son disecados en un cuarto oscuro utilizando iluminación infrarroja y los espectadores. La luz infrarroja noactivar fotorreceptores de ratón y así preserva su capacidad de respuesta luz. Patch clamp se utiliza para registrar las respuestas de luz evocadas en las neuronas de la retina. Se inyecta un tinte fluorescente durante las grabaciones para caracterizar los subtipos morfológicos neuronales. Este procedimiento nos permite determinar las funciones fisiológicas de cada neurona en la retina del ratón.
Protocol
Declaración de Ética: Los procedimientos que implican sujetos animales fueron aprobados por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) de la Universidad Estatal de Wayne.
1. Preparación de la solución Experimental
- Prepare la solución de disección 1 día a 1 semana antes del experimento real. Use una solución tampón HEPES para la disección de la retina debido a su gran capacidad de amortiguación a temperaturas más bajas 16. Mezclar todos los productos químicos de la siguiente manera (en mM): 115 NaCl, 2,5 KCl, CaCl2 2,5, 1,0 MgCl2, 10 HEPES, 28 glucosa. Ajustar el pH a 7,4 con NaOH. Conservar la solución en el refrigerador hasta por 1 semana.
- La solución de registro es medio de Ames, que es un líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa) diseñado para preparaciones de la retina 17. Por el día del experimento, pesar polvo Ames '(4,4 g por 500 ml de solución) en un tubo. Además, pesar NaHCO3 (0,95 g por 500 ml de solución) y mezclar con la Apolvo mes.
- Prepare la solución de la pipeta intracelular para las grabaciones de patch clamp por el día del experimento. Mezclar todos los productos químicos de la siguiente manera (en mM): 111 K-gluconato, 1,0 CaCl2, 10 HEPES, 1,1 EGTA, 10 de NaCl, 1,0 MgCl 2, 5 ATP-Mg y 1,0 GTP-Na. Ajustar el pH a 7,2 con KOH. Se filtra la solución de la pipeta con un filtro de jeringa convencional. Haga ~ 500 ml de alícuotas y almacenarlos en un congelador o un congelador.
2. Preparación para el Día del Experimento
- La noche antes del experimento, coloca un ratón en una jaula (C57BL / 6J o antecedentes similares, 4-8 semanas de edad, macho) en un espacio oscuro de O / N adaptación a la oscuridad.
- Preparación para la disección:
- Rellene disección solución (100 - 200 ml) en un vaso de vidrio, colóquelo sobre hielo, y la burbuja de oxígeno durante al menos 10 min.
- Iniciar la oxigenación de la caja oscura para el almacenamiento de preparación de la retina.
- Preparar cubreobjetos de plástico con rieles de engrase para rerebanada preparativos intes- y colocar cada uno de ellos en un plato de plástico de 35 mm.
- Adjunte una nueva hoja de afeitar para un helicóptero (máquina de cortar el tejido).
- Cortar una membrana de filtro en dos mitades. Esto es para el corte en lonchas de la retina.
- Alinear las herramientas de disección y pipetas de transferencia cerca del microscopio de disección. El área de trabajo debe estar bien organizado para que cada herramienta se puede acceder fácilmente en la oscuridad.
- Preparación para las grabaciones de patch clamp:
- Disuelva el polvo de Ames y NaHCO3 en agua destilada (4,4 g Ames y NaHCO 3 0,95 g / 500 ml ddH 2 O). Medio de la burbuja el Ames 'con oxígeno mixta (95% O 2 y 5% de CO 2) durante al menos 30 min mientras se calienta a un nivel de temperatura de grabación (~ 35 ° C). Ajustar el pH a 7,4 con NaHCO 3 mientras que todavía burbujeante.
- Descongelar la solución de la pipeta interna durante la disección. Después de que se haya descongelado, añadir 0,01% sulforodamina B para la tinción intracelular.
3. Disección de retina
- En un cuarto oscuro, la eutanasia con el ratón utilizando dióxido de carbono y el neumotórax bilateral. Al cabo de 2 - 3 minutos de usar el dióxido de carbono, el ratón perder el conocimiento.
- Cuando el ratón ya no responde a una pizca de cola, enuclear rápidamente los ojos y colocarlos en una solución de disección fría en un plato de plástico. Realice el neumotórax bilateral para asegurar la muerte del animal. Almacenar rápidamente el ojo en el plato en la caja oscura. Utilice un visor de infrarrojos para llevar a cabo el procedimiento en la oscuridad.
NOTA: Como alternativa, isoflurano, la decapitación o dislocación cervical se pueden utilizar para la eutanasia. El método de la eutanasia debe seguir las directrices del Instituto Nacional de Salud (NIH) y / o el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional. - En una habitación oscura, ajuste el microscopio de disección y la iluminación infrarroja. Bajo el microscopio, transferir un ojo de su plato en un plato de plástico de 10 cm wITH la solución de disección enfriado. Continuamente burbuja de oxígeno a través de la tubería colocada en la parte inferior del plato de plástico. Ajustar el volumen de flujo por lo que no es demasiado baja, pero asegurarse de que no es lo suficientemente alta como para perturbar la disección.
- Córnea y el cristalino eliminación:
- Hacer una incisión en la parte superior de la córnea con un cuchillo micro-quirúrgica. Sosteniendo el nervio óptico en el otro extremo del globo ocular evita que el ojo se mueva. Extienda el corte con un par de tijeras quirúrgicas. Recorta la córnea con algunos esclerótica alrededor.
- Coge la lente con una pinza fina y tire lentamente el objetivo. Si el vítreo es demasiado pegajosa para quitar la lente, cortar el vítreo con un par de tijeras.
- Una vez que se hace el ojo-taza, vierta suavemente solución de disección fría y oxigenada en el ocular con una pequeña pipeta de transferencia.
NOTA: El globo ocular se desinfla rápidamente después se hace una incisión en la córnea. Es importante para mantener la forma del ojo como deformar el ojo durante este proprocedimiento daña la retina y causar desprendimiento de retina.
- La identificación de las partes dorsal y ventral de la retina:
NOTA: Debido a la desigual distribución de la verde y la luz ultravioleta (UV) conos 18, la identificación de un área específica de la retina que es importante para las grabaciones de respuesta de luz.- Identificar la línea que va a través del ocular de la retina que pasa cerca de la cabeza del nervio óptico. Esta línea pasa sobre todo a través de la parte ventral del nervio óptico; el lado incluyendo el nervio óptico es el lado dorsal, mientras que el otro es ventral 19. Ver este hito claramente bajo espectadores infrarrojos.
- Dependiendo del propósito del experimento, hacer un corte en el lado innecesario. Esto será útil después de aislar la retina de la copa para el ojo.
- Eliminación Vítreo:
- Opcionalmente, se incuba el ojo-taza con hialuronidasa (0,5 mg / ml) durante 15 min.
- Retire el vítreo con pinzas extra-finas. El humor vítreo es principalmenteunido a la parte inferior y el borde exterior del ojo-cup. Retire con cuidado sin tocar o meter la retina. Como el vítreo podría estar estrechamente unida a la ojera, retire con cuidado para evitar el desprendimiento de retina del ojo taza. Continúe tirando hasta que no sienta la tensión.
NOTA: Este paso es especialmente importante para la disección de la retina del ratón; Sin embargo, no es un problema para las retinas de otras especies, tales como la rata o salamandra.
- Aislar la retina del ojo taza. Coge la esclerótica y pelar suavemente de la retina utilizando la parte trasera de fórceps.
NOTA: Todo el montaje preparativos de la retina se puede hacer de la retina aislada. Hacer tres y cincuenta y siete cortes en los bordes y aplanar la retina, o cortar la retina en varios pedazos. - Recortar la retina y deseche el medio innecesario de la retina (paso 3.5). En el mismo plato de plástico, cortar la retina restante en dos piezas. Por cada pieza de la retina, cortar los bordes para hacer unalosa de la retina, y recortar los bordes plegables.
- Transferir una losa de la retina en una placa de vidrio usando una pipeta de transferencia de gran tamaño (~ 2 ml). Aspirar el exceso de solución con una pequeña pipeta, usar un trozo de papel de filtro para aplanar la losa, y luego colocar rápidamente una pieza de la membrana de filtro en la parte superior del tejido.
- Utilizando una pequeña pipeta de transferencia, colocar una gota de solución en la disección de la membrana de filtro. Espere ~ 15 seg hasta que la solución se extiende sobre la membrana. Durante este tiempo, el tejido de la retina se adhieren a la membrana de filtro.
- Verter solución de disección más fría debajo y alrededor del filtro. El tejido de la retina con la membrana de filtro flotará. Coge la membrana de filtro con una pinza y colocarla en la cámara de corte. Vierta la disección de solución sobre el tejido, y almacenar la preparación en la caja oscura.
NOTA: El procedimiento descrito aquí es fundamental. Es importante para llevar a cabo estos pasos con rapidez para garantizar que los palos tejido de la retina a los filtros de membrana y no se seque.
- El uso de un interruptor, cortar el tejido de la retina en rodajas. Alrededor de 200 micras de espesor es factible para los estudios de patch clamp.
- Coloque un cubreobjetos de plástico con rieles de grasa en la cámara de corte. Transferir una rebanada de la retina en la parte superior de los carriles de grasa en un cubreobjetos de plástico. Girar la rebanada 90 ° de modo que la sección transversal es visible. Presione la membrana de filtro hacia abajo sobre el cubreobjetos, a continuación, cubrir los lados del papel de filtro con grasa.
- Después de la rebanada se inmoviliza sobre un cubreobjetos de plástico, agarrar el cubreobjetos y la transfiere a un plato de plástico de 35 mm. Vierta la solución de disección fría en la preparación de la retina y sumergir la preparación. Almacenar cada plato en la caja oscura, que debe ser oxigenada continuamente.
NOTA: Todo el procedimiento que se debe hacer con cuidado para que la membrana de filtro no se deforma. De lo contrario, la rebanada de la retina se separa fácilmente de la membrana de filtro.
- Después de la rebanada se inmoviliza sobre un cubreobjetos de plástico, agarrar el cubreobjetos y la transfiere a un plato de plástico de 35 mm. Vierta la solución de disección fría en la preparación de la retina y sumergir la preparación. Almacenar cada plato en la caja oscura, que debe ser oxigenada continuamente.
- Grabación de preparación:
- Prime los tubos de perfusión con medio de Ames. Permitir todas las burbujas que atraviesan al llenar el tubo.
- Haga pipetas de registro patch clamp con un extractor. Para llenar una pipeta con la solución de la pipeta, baño en la parte trasera de una pipeta de 1 min hasta que se rellena la punta de la pipeta. A continuación, llenar ~ 1/3 de la pipeta usando una carga micro-pipeta. Guarde cada pipeta en una caja pipeta húmedo.
- Encienda el equipo para patch clamp grabaciones; incluyendo la computadora, un amplificador, cámara CCD, y el microscopio.
- Apague la luz de la habitación. Coloque una rebanada preparación de la retina en la cámara de platina del microscopio utilizando un visor de infrarrojos. Después de que se inmoviliza, comenzar la perfusión continua. Ajuste la temperatura de perfusión a 33 a 37 ° C.
- Ver la superficie rebanada con la cámara CCD. Centrarse en la ubicación de destino donde el objetivo cetipos ll residen. Seleccione una celda de aspecto saludable para la grabación de patch clamp (es decir, debe tener la superficie de aspecto suave y una buena forma de la célula).
- Coloque una pipeta de grabación en un soporte de pipetas. Avanzar en la pipeta para la preparación rebanada. Cuando se está cerca de la rebanada preparación (~ 2 mm por encima), encontrar la punta de la pipeta con el microscopio. Una vez que la punta de la pipeta es visible bajo el microscopio, mover la punta hacia abajo, hacia la célula diana.
- Ajuste el amplificador. Ajustar la pipeta a 0 mV / 0 pA (puesta a cero) y comenzar un pulso eléctrico continuo de ~ 5 mV a ~ 10 Hz. Compruebe la resistencia de la pipeta; resistencia ideal está entre 5 y 10 MΩ para la mayoría de las neuronas de la retina.
- Comience soplando desde la punta. Utilice una boquilla, o utilizar una jeringa, para aplicar presión positiva cuando la pipeta se sumerge en la solución del baño. Continuamente soplar la solución interna hasta que la punta está en la superficie de la célula diana.
- Cuando la presión positiva hace un pequeño hoyuelo en el thsuperficie celular e, avanzar en la punta ligeramente y dejar de soplar. Compruebe la resistencia de la pipeta, que debería aumentar. Si está aumentando continuamente, déjelo y vigilar la resistencia hasta que llegue> 1 GΩ (gigaseal). Si la resistencia no aumenta de forma espontánea, aplicar suavemente presión negativa hasta que se convierte en un gigaseal.
- Después de lograr la gigaseal, cambie el potencial de mantenimiento de -70 mV. A continuación, aplicar intermitentemente presión negativa para romper la membrana dentro de la punta de la pipeta. Cuando se realiza la configuración de célula completa, la resistencia de la pipeta puede estar entre 500 MΩ y 1 GΩ, y la corriente capacitiva se ve. A veces las corrientes postsinápticas espontáneas se pueden observar.
- Anote la relación IV -80-40 mV. Los diferentes tipos de canales dependientes de voltaje se activan dependiendo del tipo de célula.
- Evocó luz corrientes o tensiones sinápticas Record.
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Representative Results
Una rodaja de preparación representativo se muestra en la Figura 1. La preparación rebanada está en una posición recta, mostrando fotorreceptores a las células ganglionares en una superficie plana, y no hay desprendimiento del papel de filtro. Si se inclina una rebanada, sólo una parte de la preparación está en foco, lo que hace difícil identificar una célula apropiada para la sujeción del parche. Para las grabaciones, es importante seleccionar una buena soma, que generalmente tiene una superficie brillante, una forma incluso redonda, y no hay placas oscuros visibles. Después se hizo la configuración de célula completa, la rodaja se expone a la luz de fondo y luego a un paso de la luz (Figura 2). Potenciales postsinápticos excitatorios-Light evocado (L-EPSPS) fueron evocados en respuesta a una luz paso (sincronización se muestra en amarillo). La amplitud de pico y el tiempo de decaimiento variar dependiendo del tipo de célula y subtipo. Una de las células ganglionares genera potenciales de acción en respuesta a los estímulos luminosos (Figura 2 D & E). El cell tipo y su subtipo morfológico fueron revelados por medio del etiquetado sulforrodamina después de las grabaciones fisiológicas (Figura 2, derecha).
Figura 1. preparativos trozo de retina. (A) Una rodaja de preparación de la retina se ve con un objetivo de 10X. Una rodaja de preparación de la retina (parte superior) fue unido a un trozo de papel de filtro (la parte inferior). (B) Una compilación de cuatro imágenes que muestra una rebanada preparación de la retina se ve con un objetivo 60X. Cada capa de células se observa claramente (ONL: capa exterior nuclear, OPL: capa plexiforme externa, INL: la capa nuclear interna, IPL: capa plexiforme interna, GCL: capa de células ganglionares) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. potenciales postsinápticos excitatorios-Light evocado (L-EPSPS) de las neuronas de la retina. Paso a la luz evocaba L-EPSPS (izquierda). La intensidad de la luz fue 30 - 60% de contraste Weber. Antecedentes nivel adaptación a la luz fue de 4 x 10 4 fotones / micras 2 / seg. Sulforodamina B se inyectó durante patch clamp grabación para visualizar las neuronas registradas (derecha). Una pipeta de grabación estaba todavía unido a la soma (A) L-EPSP y tinción sulforrodamina de un cono de célula bipolar ON. (B) OFF célula bipolar cono. (C) de células amacrinas. (D) en las células ganglionares. (E) OFF de células ganglionares. La barra de escala indica 2 o 5 mV como se ha señalado. Estimulación de la luz se aplicó durante 1 seg. Por favor, haga clic aquípara ver una versión más grande de esta figura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice (28-60 days old, male) | Jackson laboratory | C57BL/6J strain | |
| Ames' medium powder | Sigma | A1420 | excellent |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ745 | excellent |
| Dissecting tool: forceps | Dumont | #4, #5, #55 | excellent |
| Dissecting tool: scissors | Roboz | RS-5605 | excellent |
| Dissecting tool: surgery knife | Surgistar | 7514 | excellent |
| Razor blade (for chopper) | EMS | 71970 | excellent |
| Chopper | handmade | ||
| Infrared viewer | Night Owl Optics | NOBG1 | It shows bright view. Focusing small objects is an issue. |
| Puller | Sutter | P-1000 | excellent; makes consistent size pipettes. |
| Dark box | Pelican | dark box | excellent |
| Patch clamp system | Scientifica | slice scope 2000 | Excellent setup. Most key components are included in one package. Micromanipulators are excellent. |
| Amplifier | Molecular Devices | multiclamp 700B | Excellent and easy control. |
| Acquiring software | Molecular Devices | pClamp software | Excellent and easy control. |
| Light source (LED) | Cool LED | pE-2 4 channel system | Excellent |
| CCD camera | Q-imaging | Retiga 2000 | Excellent |
| Faraday cage | handmade |
References
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