Abstract
La rétine est la porte d'entrée du système visuel. Pour comprendre les mécanismes de traitement des signaux visuels, nous étudions les fonctions de réseau de neurones de la rétine. Neurones rétiniens dans le réseau comprennent de nombreux sous-types. Plus de 10 sous-types de cellules bipolaires, les cellules ganglionnaires, les cellules amacrines et ont été identifiés par des études morphologiques. Sous-types multiples de neurones rétiniens sont pensés pour coder des caractéristiques distinctes de signalisation visuelle, telles que le mouvement et la couleur, et de former de multiples voies neurales. Cependant, les rôles fonctionnels de chaque neurone en traitement du signal visuel sont pas pleinement compris. La méthode patch clamp est utile de répondre à cette question fondamentale. Ici, un protocole d'enregistrer les réponses synaptiques lumière évoqués dans les neurones de la rétine de souris en utilisant des enregistrements de patch clamp dans des conditions sombres adapté est fourni. Les yeux de souris sont adaptés à l'obscurité O / N, et les préparations de tranche de la rétine sont disséqués dans une pièce sombre en utilisant un éclairage infrarouge et les téléspectateurs. La lumière infrarouge ne est pasactiver photorécepteurs de la souris et préserve ainsi leur réactivité de lumière. Patch clamp est utilisé pour enregistrer les réponses de lumière évoquée dans les neurones de la rétine. Un colorant fluorescent est injecté pendant les enregistrements pour caractériser les sous-types morphologiques neuronales. Cette procédure permet de déterminer les fonctions physiologiques de chaque neurone dans la rétine de souris.
Protocol
Déclaration éthique: procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection des animaux et l'utilisation (IACUC) à l'Université Wayne State.
1. Préparation de la solution expérimentale
- Préparer la solution de dissection 1 jour à 1 semaine avant l'expérience réelle. Utilisez une solution tampon HEPES pour la dissection de la rétine raison de sa capacité tampon forte à des températures inférieures 16. Mélanger tous les produits chimiques comme suit (en mM): 115 NaCl, KCl 2,5, 2,5 CaCl2, 1,0 MgCl2, 10 HEPES, 28 glucose. Ajuster le pH à 7,4 avec NaOH. Conserver la solution dans un réfrigérateur jusqu'à 1 semaine.
- La solution d'enregistrement est un milieu d'Ames, qui est un liquide céphalo-rachidien artificiel (aCSF) conçu pour des préparations 17 de la rétine. Le jour de l'expérience, peser la poudre de Ames (4,4 g pour 500 ml de solution) dans un tube. En outre, peser NaHCO 3 (0,95 g pour 500 ml de solution) et mélanger avec le Ala poudre de mes.
- Préparer la solution de la pipette intracellulaire pour les enregistrements de patch-clamp par le jour de l'expérience. Mélanger tous les produits chimiques comme suit (en mm): 111 K-gluconate, 1,0 CaCl2, 10 HEPES, 1,1 EGTA, 10 NaCl, 1,0 MgCl 2, 5 ATP-Mg et 1,0 GTP-Na. Ajuster le pH à 7,2 avec KOH. On filtre la solution de la pipette avec un filtre à seringue classique. Assurez ~ 500 aliquotes et les stocker dans un congélateur ou un congélateur.
2. Préparation pour la Journée de l'expérience
- La nuit avant l'expérience, placer une souris dans une cage (C57BL / 6J ou des antécédents similaires, 4-8 semaines, mâle) dans un espace sombre pour O / N adaptation à l'obscurité.
- Préparation pour la dissection:
- Remplissez dissection solution (de 100 à 200 ml) dans un récipient en verre, placez-le sur la glace, et la bulle d'oxygène pendant au moins 10 min.
- Lancer l'oxygénation de la boîte noire pour le stockage de la préparation de la rétine.
- Préparer des lamelles de plastique avec des rails de graisse pour repréparations de tranche intestinaux et placez chacun d'eux dans un plat en plastique de 35 mm.
- Fixez une nouvelle lame de rasoir à un chopper (trancheuse de tissu).
- Couper une membrane de filtre en deux moitiés. Il se agit pour le tranchage de la rétine.
- Alignez les outils de dissection et pipettes de transfert près de la loupe binoculaire. La zone de travail doit être bien organisé de sorte que chaque outil peut être facilement accessible dans l'obscurité.
- Préparation pour les enregistrements de patch-clamp:
- Dissoudre la poudre de Ames et NaHCO 3 dans l'eau distillée (Ames 4,4 g et 0,95 g / NaHCO 3 500 ml ddH 2 O). Le milieu de la bulle Ames mélangé avec de l'oxygène (95% O 2 et 5% CO 2) pendant au moins 30 minutes tout en chauffant à un niveau de température d'enregistrement (~ 35 ° C). Ajuster le pH à 7,4 avec NaHCO 3 tout en bouillonnant.
- Décongeler la solution de pipette interne lors de la dissection. Après il est décongelé, ajouter 0,01% sulforhodamine B pour la coloration intracellulaire.
3. rétine Dissection
- Dans une pièce sombre, euthanasier la souris en utilisant du dioxyde de carbone et de pneumothorax bilatéral. Après 2 à 3 min d'utiliser le dioxyde de carbone, la souris se perdre conscience.
- Lorsque la souris ne répond plus à un pincement de la queue, énucléer rapidement les yeux et les placer dans une solution froide de dissection dans un plat en plastique. Effectuer pneumothorax bilatéral pour assurer la mort de l'animal. Stocker rapidement l'œil dans le plat dans la boîte noire. Utilisez une visionneuse infrarouge pour mener la procédure dans l'obscurité.
REMARQUE: Sinon, l'isoflurane, la décapitation ou la dislocation cervicale peuvent être utilisés pour l'euthanasie. La méthode d'euthanasie doit suivre les directives de l'Institut national de la santé (NIH) et / ou du Comité de protection des animaux et l'utilisation institutionnelle. - Dans une pièce sombre, régler le microscope de dissection et l'éclairage infrarouge. Sous le microscope, transférer un œil de son plat dans un plat en plastique de 10 cm wvec la solution dissection refroidi. En continu l'oxygène bulle à travers le tubage placée sur le fond de la cuvette en plastique. Réglez le volume d'écoulement de sorte qu'il ne est pas trop faible, mais assurez-vous qu'il ne est pas suffisamment élevée pour perturber la dissection.
- Cornée et le cristallin retrait:
- Faire une découpe sur le dessus de la cornée avec une lame de micro-chirurgical. En tenant le nerf optique à l'autre extrémité du globe oculaire de l'œil empêche de se déplacer. Prolonger la coupe à l'aide d'une paire de ciseaux chirurgicaux. Découpez la cornée avec un certain sclérotique autour d'elle.
- Prenez l'objectif avec une pince fine et tirer lentement sur la lentille. Si le corps vitré est trop collante pour retirer le cristallin, le vitré couper avec une paire de ciseaux.
- Une fois l'œilleton est fait, verser doucement solution froide, oxygénée dissection dans l'œilleton avec une petite pipette de transfert.
REMARQUE: le globe oculaire se dégonfle rapidement après une incision est faite dans la cornée. Il est important de maintenir la forme de l'oeil que l'œil se déformer au cours de cette proprocédure peut endommager la rétine et provoquer un décollement de la rétine.
- Identifier les dorsales et ventrales côtés de la rétine:
NOTE: En raison de la répartition inégale du vert et de l'ultraviolet (UV) cônes 18, indiquant une zone spécifique de la rétine est important pour les enregistrements de réponse à la lumière.- Identifier la ligne traversant la coupe de la rétine passant près de la tête du nerf optique. Cette ligne passe la plupart du temps à travers la face ventrale du nerf optique; le côté comprenant le nerf optique est le côté dorsal, tandis que l'autre est 19 ventral. Voir ce monument clairement sous téléspectateurs infrarouges.
- Selon le but de l'expérience, faire une coupe sur le côté inutile. Cela sera utile après avoir isolé la rétine de l'œilleton.
- Élimination vitreuse:
- Eventuellement, incuber la œilleton avec la hyaluronidase (0,5 mg / ml) pendant 15 min.
- Retirer le corps vitré avec une pince extra-fines. Le corps vitré est principalementfixée sur le fond et le bord externe de l'œil-tasse. Retirez délicatement sans toucher ou piquer la rétine. Comme le corps vitré peut être étroitement attaché à l'œilleton, retirez délicatement pour éviter décollement de la rétine de l'œil-tasse. Continuez à tirer jusqu'à ce qu'aucune tension se fait sentir.
NOTE: Cette étape est particulièrement importante pour disséquer la rétine de souris; cependant, ce ne est pas un problème pour les rétines d'autres espèces telles que le rat ou salamandre.
- Isoler la rétine de l'œil-tasse. Prenez la sclérotique et retirez délicatement la rétine en utilisant l'arrière de forceps.
REMARQUE: l'ensemble du montage des préparations de la rétine peut être fabriqué à partir de la rétine isolée. Faire trois à quatre coupes sur les bords et aplatir la rétine, ou couper la rétine en plusieurs morceaux. - Coupez la rétine et jeter le moitié inutile de la rétine (étape 3.5). Dans le même plat en plastique, couper la rétine restante en deux morceaux. Pour chaque morceau de la rétine, couper les bords pour faire undalle rétinienne, et couper les bords de pliage.
- Transfert d'une dalle de la rétine sur une plaque de verre en utilisant une pipette de transfert à grande (~ 2 ml). Aspirer la solution en excès avec une petite pipette, utiliser un morceau de papier filtre pour aplatir la dalle, puis placer rapidement un morceau de la membrane du filtre sur le dessus du tissu.
- En utilisant une petite pipette de transfert, déposer une goutte de solution sur la membrane filtrante de dissection. Attendez ~ 15 sec jusqu'à ce que la solution se répand sur la membrane. Pendant ce temps, le tissu rétinien se en tiendra à la membrane filtrante.
- Verser la solution de dissection plus froid sous et autour du filtre. Le tissu de la rétine avec la membrane filtrante peut flotter. Saisir la membrane de filtre avec une pince et le placer dans la chambre de coupe. Verser la solution de dissection sur le tissu, et de stocker la préparation dans la boîte noire.
NOTE: La procédure décrite ici est critique. Il est important d'effectuer ces étapes rapidement pour se assurer que les bâtons de tissus de la rétine aux mem de filtreBrane et ne se dessèche pas.
- L'utilisation d'un hachoir, couper le tissu rétinien en tranches. Autour de 200 um d'épaisseur est faisable pour les études de patch-clamp.
- Déposer une lamelle couvre-objet en plastique avec des rails de graisse dans la chambre de coupe. Transférer une tranche de la rétine au-dessus des rails de graisse sur une lamelle en plastique. Faire tourner la tranche 90 ° de sorte que la section transversale est visible. Appuyez sur la membrane du filtre vers le bas sur la lamelle, puis, recouvrez les côtés du papier filtre avec de la graisse.
- Après la tranche est immobilisé sur une lamelle de plastique, saisir la lamelle et le transférer sur un plat en plastique de 35 mm. Verser la solution de dissection froide sur la préparation de la rétine et plonger la préparation. Stocker chaque plat dans la boîte noire, qui devrait être continuellement oxygéné.
NOTE: L'ensemble de la procédure qui doit être fait avec soin afin que la membrane du filtre ne est pas déformée. Dans le cas contraire, la tranche de la rétine se sépare facilement de la membrane filtrante.
- Après la tranche est immobilisé sur une lamelle de plastique, saisir la lamelle et le transférer sur un plat en plastique de 35 mm. Verser la solution de dissection froide sur la préparation de la rétine et plonger la préparation. Stocker chaque plat dans la boîte noire, qui devrait être continuellement oxygéné.
- Enregistrement de la préparation:
- Prime les tubes de perfusion avec le milieu de Ames. Autoriser toutes les bulles de passer à travers lors du remplissage du tube.
- Assurez-pipettes d'enregistrement patch clamp avec un extracteur. Pour remplir une pipette avec la solution de la pipette, plongeon dans l'arrière d'une pipette pendant 1 min jusqu'à ce que la pointe de la pipette est remblayé. Ensuite, remplissez ~ 1/3 de la pipette en utilisant une charge micro-pipette. Stocker chaque pipette dans une boîte de pipette humide.
- Tournez sur l'équipement pour les enregistrements de patch-clamp; y compris l'ordinateur, un amplificateur, caméra CCD, et microscope.
- Éteignez la lumière ambiante. Placez une préparation de tranches de la rétine sur la chambre de platine de microscope en utilisant une visionneuse infrarouge. Après il est immobilisé, commencez perfusion continue. Réglez la température de perfusion à 33-37 ° C.
- Voir la surface de tranche avec la caméra CCD. Concentrez-vous sur l'emplacement cible où le CE ciblell types résident. Sélectionnez une cellule saine pour le patch clamp (ie, il devrait avoir une surface lisse d'aspect et une forme bonne cellulaire).
- Placer une pipette d'enregistrement dans un support de pipette. Avancer la pipette à la préparation de la tranche. Quand il est proche de la préparation de tranche (~ 2 mm au-dessus), trouver la pointe de la pipette avec le microscope. Une fois la pointe de pipette est visible sous le microscope, déplacer la pointe vers le bas vers la cellule cible.
- Réglez l'amplificateur. Régler la pipette à 0 mV / 0 pA (réduction à zéro) et de commencer une impulsion électrique continu de ~ 5 mV à ~ 10 Hz. Vérifier la résistance de la pipette; la résistance idéale se situe entre 5 et 10 MQ pour la plupart des neurones rétiniens.
- Lancer souffler de la pointe. Utilisation d'un embout buccal, ou utiliser une seringue pour appliquer une pression positive lorsque la pipette plongeant dans la solution de bain. Souffler en continu la solution interne jusqu'à la pointe est à la surface de la cellule cible.
- Lorsque la pression positive fait une petite fossette sur esurface de la cellule e, avancer la pointe légèrement et arrêter de souffler. Vérifier la résistance de la pipette, ce qui devrait augmenter. Se il ne cesse d'augmenter, le quitter et surveiller la résistance jusqu'à ce qu'il atteigne> 1 GQ (gigaseal). Si la résistance ne augmente pas spontanément, appliquer doucement pression négative jusqu'à ce qu'il devienne un gigaseal.
- Après la gigaseal est atteint, changer le potentiel de maintien de -70 mV. Ensuite, appliquer par intermittence pression négative pour rompre la membrane à l'intérieur de la pointe de la pipette. Lorsque la configuration de cellule entière est faite, la résistance de la pipette peut être comprise entre 500 et 1 GQ MQ, et le courant capacitif est considérée. Parfois courants postsynaptiques spontanées peuvent être observées.
- Enregistrez la relation IV -80 à 40 mV. Différents types de canaux voltage-dépendants sont activés en fonction du type de cellule.
- Enregistrez lumière évoqué courants ou tensions synaptiques.
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Representative Results
Une préparation représentative de tranche est représenté sur la Figure 1. La préparation de la tranche se trouve dans une position droite, montrant photorécepteurs aux cellules ganglionnaires dans une surface plane, et aucun détachement du papier filtre. Si une tranche est incliné, seule une partie de la préparation est au point, ce qui rend difficile d'identifier une cellule appropriée pour le patch serrage. Pour les enregistrements, il est important de choisir un bon soma, qui a généralement une surface brillante, une forme même tour, et aucun plaques sombres visibles. Une fois la configuration de cellule entière a été faite, la tranche a été exposé à la lumière de fond et ensuite à une étape de lumière (figure 2). Potentiels post-synaptiques excitateurs lumière évoqué (L-epsps) ont été évoqués en réponse à une étape-lumière (calendrier se affiche en jaune). L'amplitude du pic et le temps de chute varie en fonction du type de cellules et sous-type. Une cellule de ganglion généré potentiels d'action en réponse à des stimuli lumineux (figure 2 D & E). Le celType de l et son sous-type morphologique ont été révélés par l'étiquetage sulforhodamine après enregistrements physiologiques (figure 2, à droite).
Figure 1. Les préparations de tranche de la rétine. (A) Une préparation de tranche rétinienne vu avec un objectif 10X. Une préparation de tranches de la rétine (en haut) a été fixé à un morceau de papier filtre (en bas). (B) Une compilation quatre images montrant une préparation de tranches rétinienne vu avec un objectif 60X. Chaque couche de cellules est clairement observé (ONL: couche externe nucléaire, OPL: couche plexiforme externe, INL: couche nucléaire interne, IPL: couche plexiforme intérieure, GCL: couche de cellules ganglionnaires) Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. potentiels post-synaptiques excitateurs légères évoqués (L-epsps) de neurones rétiniens. Étape lumière évoqué L-epsps (à gauche). L'intensité lumineuse est de 30 à 60% Weber contraste. niveau de l'adaptation de la lumière de fond était de 4 x 10 4 photons / um 2 / sec. Sulforhodamine B a été injecté pendant patch clamp enregistrement pour visualiser les neurones enregistrés (à droite). Une pipette d'enregistrement était encore attaché au soma (A) L-EPSPS et sulforhodamine coloration d'une cellule bipolaire sur le cône. (B) OFF Cône bipolaire. (C) cellules amacrines. (D) ON cellules ganglionnaires. (E) OFF cellules ganglionnaires. La barre d'échelle indique 2 ou 5 mV comme indiqué. Stimulation lumineuse a été appliquée pendant 1 sec. Se il vous plaît cliquez icipour voir une version plus grande de cette figure.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice (28-60 days old, male) | Jackson laboratory | C57BL/6J strain | |
| Ames' medium powder | Sigma | A1420 | excellent |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ745 | excellent |
| Dissecting tool: forceps | Dumont | #4, #5, #55 | excellent |
| Dissecting tool: scissors | Roboz | RS-5605 | excellent |
| Dissecting tool: surgery knife | Surgistar | 7514 | excellent |
| Razor blade (for chopper) | EMS | 71970 | excellent |
| Chopper | handmade | ||
| Infrared viewer | Night Owl Optics | NOBG1 | It shows bright view. Focusing small objects is an issue. |
| Puller | Sutter | P-1000 | excellent; makes consistent size pipettes. |
| Dark box | Pelican | dark box | excellent |
| Patch clamp system | Scientifica | slice scope 2000 | Excellent setup. Most key components are included in one package. Micromanipulators are excellent. |
| Amplifier | Molecular Devices | multiclamp 700B | Excellent and easy control. |
| Acquiring software | Molecular Devices | pClamp software | Excellent and easy control. |
| Light source (LED) | Cool LED | pE-2 4 channel system | Excellent |
| CCD camera | Q-imaging | Retiga 2000 | Excellent |
| Faraday cage | handmade |
References
- Werblin, F. S., Dowling, J. E. Organization of the retina of the mudpuppy, Necturus maculosus II. Intracellular recording. J Neurophysiol. 32 (3), 339-355 (1969).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
- Lukasiewicz, P., Werblin, F. A slowly inactivating potassium current truncates spike activity in ganglion cells of the tiger salamander retina. J Neurosci. 8 (12), 4470-4481 (1988).
- Kaneko, A., Tachibana, M. Effects of L-glutamate on the anomalous rectifier potassium current in horizontal cells of Carassius auratus retina. J Physiol. 358, 169-182 (1985).
- Kamermans, M., Werblin, F. GABA-mediated positive autofeedback loop controls horizontal cell kinetics in tiger salamander retina. J Neurosci. 12 (7), 2451-2463 (1992).
- Cook, P. B., McReynolds, J. S. Lateral inhibition in the inner retina is important for spatial tuning of ganglion cells. Nat Neurosci. 1 (8), 714-719 (1998).
- Pang, J. J., Gao, F., Wu , J. S. Light-evoked current responses in rod bipolar cells, cone depolarizing bipolar cells and AII amacrine cells in dark-adapted mouse retina. J Physiol. 558 (Pt. 558 (Pt 3), 897-912 (2004).
- Euler, T., Masland , R. H. Light-evoked responses of bipolar cells in a mammalian retina). J Neurophysiol. 83 (4), 1817-1829 (2000).
- Berntson, A., Taylor , W. R. Response characteristics and receptive field widths of on-bipolar cells in the mouse retina. J Physiol. 524 Pt. 524 (Pt 3), 879-889 (2000).
- Sterling, P., Smith, R. G. Design for a binary synapse. Neuron. 41 (3), 313-315 (2004).
- Borghuis, B. G., Marvin, J. S., Looger, L. L., Demb, J. B. Two-photon imaging of nonlinear glutamate release dynamics at bipolar cell synapses in the mouse retina. J Neurosci. 33 (27), 10972-10985 (2013).
- Dowling, J. E., Sidman, R. L.
- Eggers, E. D., Lukasiewicz, P. D. GABA(A), GABA(C) and glycine receptor-mediated inhibition differentially affects light-evoked signalling from mouse retinal rod bipolar cells. J Physiol. 572 (Pt 1), 215-225 (2006).
- Ichinose, T., Lukasiewicz, P. D. The mode of retinal presynaptic inhibition switches with light intensity). J Neurosci. 32 (13), 4360-4371 (2012).
- Ichinose, T., Fyk-Kolodziej, B., Cohn, J. Roles of ON cone bipolar cell subtypes in temporal coding in the mouse retina. J Neurosci. 34 (26), 8761-8771 (2014).
- Baicu, S. C., Taylor, M. J. Acid-base buffering in organ preservation solutions as a function of temperature: new parameters for comparing buffer capacity and efficiency. Cryobiology. 45 (1), 33-48 (2002).
- Ames, A. 3rd, Nesbett, F. B. In vitro retina as an experimental model of the central nervous system. J Neurochem. 37 (4), 867-877 (1981).
- Haverkamp, S., et al. The primordial, blue-cone color system of the mouse retina. J Neurosci. 25 (22), 5438-5445 (2005).
- Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina. Nat Protoc. 5 (7), 1347-1352 (2010).
- Farre, C. G., M Bruggemann, A., Fertig, N. Ion channel screening - automated patch clamp on the rise. Drug discovery today. Technologies. 5 (1), e1-e34 (2008).
