Introduction
腸溶性ウイルスはヒトの腸のシステムに感染し、糞口経路を介して送信されるウイルスの多様なグループです。これらのウイルスは、下水処理場や浄化槽排水、不適切に設計された、または壊れた浄化槽、壊れた下水道、合流式下水道のオーバーフロー、および他のポイントとの非点源1-4を介して表面と地面の水を入力してください。水性ウイルスからヒトへの感染および疾患は、汚染されたか、不十分な消毒した水の消費を介して、またはレクリエーションの水との接触を介して起こります。病気の症状が重度の胃腸炎に軽度伴ってもよいです。結膜炎;熱;上部呼吸窮迫。手足口病。心筋炎;無菌性髄膜炎;脳炎;麻痺;敗血症5-8、および死亡9,10。
USEPAメソッド1615は、環境や飲料水中の感染性腸内ウイルス粒子を測定するための手順を提供します。これらの水は含めることができます感染性および非感染性ウイルス粒子の混合物が、唯一の感染性粒子は、潜在的な健康被害をもたらします。感染性ウイルス粒子は、タンパク質カプシドの完全性の喪失、太陽光から起因するUV放射線への核酸の損傷、および11-13存在することができる任意の消毒剤による損傷から環境や飲料水の中で時間をかけて感染性を失います。メソッドで提供される総培養可能ウイルスの手順はバッファローミドリザル腎臓（BGM）細胞株における細胞変性効果（CPE）の生産に基づいています。この細胞株は、検出された感染性ウイルスの種類の範囲を特定のエンテロウイルス15に主に制限されていても、なぜなら環境ウイルス学の分野14,15におけるその広範な使用を選択しました。本稿の目的は、5インチの電気陽性カートリッジフィルターの溶出、二次濃度、および全培養可能なウイルスの測定のための方法1615の手順を記述することです。の評価全体的な方法はCashdollar ら 16に記載されています。
Protocol
注：定義のリストのための補足的な材料セクションS1を参照してください。 USEPAメソッド1615に関連したQA手順は補足材料セクションS2に記載されています。
1.フィルター溶出手順
- 最初の溶出
- バッファリング1.5％牛肉エキス、pHが9.0の500ミリリットルを置き、メスシリンダー中で室温まで温めました。フィルターカートリッジハウジングを開き、完全に電気陽性フィルターをカバーするために牛肉エキスの十分な量を追加します。フィルターハウジング蓋を交換し、滅菌したビーカーに残った牛肉エキスを注ぎます。
- 接触時間の1分後、その圧力容器または蠕動ポンプを使用して、ゆっくりとフィルターを通して滅菌ビーカーに残っているとともに、ハウジング内の牛肉抽出液を通過させます。 2Lのガラスビーカーに溶出液を収集します。
- 2回目の溶出
- バッファリング1.5％牛肉エキスの追加の500ミリリットルを使用して、手順1.1を繰り返しますしかし、15分にステップ1.1.2での接触時間を増加させます。
- 2回目の溶出からの最初の溶出からそれを含む2リットルのビーカーに牛肉エキスを追加します。ビーカーに滅菌攪拌棒を追加します。
2.有機凝集濃度の手順
- 少なくとも5分間、0.525％の次亜塩素酸ナトリウムとの組み合わせ型pH電極を滅菌します。無菌の dH 2 Oを有する電極をすすぎ、その後、0.05 Mチオ硫酸ナトリウムで脱塩素。 pHが4と7標準を使用してpH計を校正。
- 撹拌プレート上で溶出液を入れたビーカーを置きます。プレートをオンにして、渦が形成されるまで攪拌速度を上げます。
- 溶出液に1.2 M HClを滴下することにより、ゆっくりと3.5±0.1に溶出液のpHを調整します。急速な添加は、ウイルスを不活性化するため、塩酸滴下を追加します。沈殿物が形成し始めるようこの間の溶出液が白濁します。
- 混合SPEを削減ゆっくりと攪拌に編し、その後30分間、室温で3.5±0.1で溶出液のpHを監視し、維持し続けます。
- 4℃で2500×gで15分間一つ以上の遠心ボトルや遠心分離機に沈殿した牛肉エキス懸濁液を注ぎます。遠心機からボトルを取り出して、いずれかの吸引またはゆっくりペレット状の沈殿物の損失を防ぐために、上清をデカントします。上清を捨てます。
注：沈殿物の量と質で牛肉エキスのロット間のかなりの変動がある場合もあります。他のロットからそれが困難で溶解しながら、いくつかのロットから生成した沈殿物を迅速に溶解します。 - 沈殿物を含む遠心ボトルに、0.15Mリン酸ナトリウムの30ミリリットルを追加します。
- 0.15 Mリン酸ナトリウム、5分以内に溶解牛肉エキスロットからの沈殿物のためのpH 9.0を使用してください。沈殿物が完全に溶解した後、10分間攪拌し、その後、2.7のステップにすぐ進みます。
- 他のすべての沈殿物のために0.15 Mリン酸ナトリウム、pHが7.0から7.5を使用してください。 、またはより困難な沈殿物のために溶解するために10〜15分間攪拌し、オービタルシェーカー上で160 rpmで沈殿物を振盪することにより、ピペットで攪拌中に繰り返し上下ソリューションを描くことによって、滅菌スパチュラでそれらを破ります、またはこれらの手順の組み合わせによって。
注：複数の遠心分離ボトルを使用して、リン酸ナトリウム未満の30ミリリットルを使用して沈殿物を結合した後、1瓶やビーカーに沈殿物を合成後のボトルをすすぐために30ミリリットルの残りの部分を使用します。 - 合わせた沈殿物を平底遠心分離ボトル内にある場合、瓶に攪拌棒を加えます。 2.6.5に進みます。
- 合わせた沈殿物が円錐形の底部を有する遠心分離ボトル内にある場合は、小さなガラスビーカーにそれを転送し、ビーカーにスターラーバーを追加します。
- マグネチックスターラー上に瓶やビーカーを置き、PRまで攪拌ecipitateは完全に溶解しました。
- 0.525％の次亜塩素酸ナトリウムとの組み合わせ型pH電極を再滅菌し、工程2.1に記載のように0.05 Mチオ硫酸ナトリウムを用いて脱塩素。 pHは7と10の規格を使用してpH計を校正。ゆっくりと、1M NaOHで9.0に完全に溶解させ、沈殿物のpHを調整した後、10分間攪拌します。
- 攪拌棒を外し、4,000-10,000×gで、4℃で10分間溶解した沈殿物を遠心分離します。
- ペレットを乱さないように注意しガラスビーカーに上清を注ぎます。ビーカーに攪拌棒を追加し、ペレットを捨てます。
- マグネチックスターラー上にビーカーを置き、溶液をかき混ぜます。 7.0から7.5にpHを調整するのが賢明1.2 M HClのドロップを追加します。
- フィルターは、1.5％牛肉エキスの15ミリリットル、0.05 Mグリシン、pHが7.0〜7.5で前処理されたプレフィルターを含む滅菌フィルターを通過させることにより、上清を滅菌します。
- アッセイサンプルVolumE（S）の計算。
- 空白空白ラボ要塞を除くすべての試験サンプルおよびラボ試薬のためにSを計算するために使用する式（1）、
式（1）
D（アッセイしたオリジナル水試料の体積）は、地下水の500 Lであり、TSV（総サンプル量）は、フィールドサンプルの量は、実験室で受信された5インチ陽電カートリッジフィルター、およびFCSV（最終濃縮サンプルボリューム）を通過させますステップ2.10でろ過以下の体積です。例では、補足的な材料セクションS4.1に示されています。 - そしてブランクラボ試薬（LRB、 すなわち 、試薬グレードの水を使用して、負の品質管理）0.3によってFCSVを乗じて、ブランクラボ要塞（ すなわち 、シードされた試薬グレードの水を使用して、正の品質管理LFB）のためにSを計算します。
- 空白空白ラボ要塞を除くすべての試験サンプルおよびラボ試薬のためにSを計算するために使用する式（1）、
- THREにFCSVを分割Eのサブサンプル。
- 1.04倍アッセイサンプル量と同量のサブサンプル1と2を準備します。彼らは、全培養可能なウイルスアッセイ（サブサンプル1、ステップ4）を用いて分析または24時間内の分子アッセイ（図示せず）のために処理することができない場合は-70℃以下にこれらのサブサンプルを凍結します。それ以外の場合は、4℃で保持します。
- で、または-70℃以下に残りの容量（サブサンプル3）をフリーズします。
- 10でSを分割することにより種菌の体積を計算します 。
式（1） 3.総培養可能なウイルス素量アッセイ
注：すべての手順については、常に細胞単層を乱さないように注意してくださいソリューションを追加します。
- デカントまたは3-6日後に分割でBGM細胞の単層を含む試験容器から吸引メディアとその後除去メディアに等しい平衡塩溶液の量を追加します。
- 細胞培養TEからバランスのとれた塩溶液をデカントまたは吸引目の容器を使用し、次いで、細胞培養試験容器に接種されました
- （補足材料セクションS2.4）総培養可能なウイルス量子アッセイ対照と一緒に接種物の容積に等しいサブサンプル1の体積で各試験サンプルのための10試験容器を接種します。
- LFBとラボ強化さサンプルマトリックス（LFSM; すなわち 、播種水マトリックスサンプル）の場合は、希釈剤としてサブサンプル3および0.15 Mリン酸ナトリウム、pHが7.0から7.5を使用して5-、25-、および125倍希釈液を準備します。希釈液を作製するための手順の一例を補足材料セクションS3に示されています。ステップ3.2.1で希釈していないサブサンプル1を接種した血管に加えて、各試験容器に接種物のボリュームを使用して、各希釈系列のための10洗浄した細胞培養試験容器を接種します。
- インキュベーションの14日後、すべての10連でCPEを持っている（ステップ3.2.2に接種したもの以外の）ステップ3.2.1から任意の試験サンプルについては、事前に（ステップ3.3を参照してください）5-、25-、および125-を削減する、とサブサンプル3の625倍希釈液を接種10は、全培養可能なウイルス量子の新しいセットと一緒に各試験容器に接種物のボリュームを使用して、各希釈系列のための細胞培養試験容器を洗浄しアッセイ対照（補足材料セクションS2.4）。
- 前後に血管を傾けることによって、細胞単層の表面上に接種物を配布します。存在する任意のウイルスを細胞に吸着することができるように、すべての15-20分1-5振動/分で、または血管の揺り動かしながら機械的ロッキングプラットフォーム上で80-120分間室温で試験容器をインキュベートします。
- 予め温め維持培地を追加し、36.5±1℃で試験容器をインキュベートします。
- 最初の3日間、毎日顕微鏡を用いて、各試験容器内のCPEの出現を探し、その後、またはに設定冷凍庫に≥75％のCPEを示す日までの14転送任意の試験容器2〜3日ごとにそれらを調べます以下-70℃です。最終日に血管を調べた後-70℃以下に残りのすべての文化や総培養可能なウイルス量子アッセイ対照をフリーズします。
- すべての文化を解凍し、0.2μmの滅菌フィルターを通してすべてのCPE陽性試験容器からの媒体の≥15％をフィルタリングします。指定されたボリュームが目詰まりにフィルタを通過することができない場合は、濾過前に1,500-18,000×gで4℃で10分間、培地を遠心します。
- 洗浄BGMの試験容器を使用して、すべての第1通路試験容器の第2の通路を実行します。
- すべての負の試験容器から、正の血管から濾過さ媒体から解凍した培地の10％を表し接種量で新しい試験容器を接種します。
- ステップ3.2.4-3.4.3を繰り返しますが、ステップ3.3で説明したように2 回目に1 回目の通路上の負及び正だった任意の試験容器を凍結します。 3 番目のパスを実行唯一のマイナスアッセイ対照と第2通路内の 1 回目の通過時に負と陽性であった細胞培養物を使用して、2 回目の通過のために説明したように年齢。
- 彼らは1 番目と2 番目の通路の両方でCPEまたは、CPEは、第2および第3の通路の両方で、2 番目の通路まで発生していない場合はを表示したときに、ウイルス陽性と個々の試験容器を特定します。
- すべての試験サンプルのウイルス力価を計算するために、 表S2に示すように設定されたデフォルトのプログラム設定でUSEPAの最確数の電卓を使用します。
- 入力MPN / mlの値（M mL）および上部（CL UML）と下位（CL 1mLの ）95％信頼限界/ mlの値を決定する計算に各試験サンプルのためのステップ3.6からのウイルス陽性の複製試験容器の数。
- O式2を使用して対応する試験サンプルのMPN / L値（Mの L）btain。
式（2）
M mLのステップ 3.7でMPN / mlの値であり、Sは、 分析試料の体積であり、そしてDは、 アッセイ され た元の水試料の体積です。 - M mLの値のCL UML値を代入することにより、上側信頼限界/ Lを計算します。 M mLの値のCL 1mLの値を代入することにより信頼下限/ Lを計算します。計算例は補足材料セクションS4.2に示されています。
- 0 / D 1≤などの報告M mLの値。例えば、地下水試料の0.002 MPN / L（≤1/500 L）≤。
- MPNとブランク要塞各ラボの95％信頼限界値とラボのReを計算します第1のSにより計算で得られた値/ mlに乗算した後、0.3によって、結果を分割することによってブランクエージェント。
式（2） Representative Results
ウイルスは、3つの飲料水処理プラント及び電気陽性のフィルタを使用して、プライベートものソース地下水から濃縮しました。フィールドサンプルとLFSM制御からなる2つのサンプルセットは、別々の機会に処理プラントから回収し、一つのサンプルセットは、プライベートウェルから収集しました。各サンプルで使用される種子のMPN値を正確に起因し決定することができなかったため、全体的なウイルス回収は計算から除外された植物やプライベートウェル（1工場と別の1サンプルからの2つのサンプルの2からLFSMサンプルを用いて決定しました複製のフラスコの中で異常なCPE結果）へ。地下水試料からのポリオウイルスの回収は79％（ 図2）16の変動係数58％の平均を意味します。何の培養可能なウイルスは、重複播種していない地下水フィールドサンプルのいずれにおいても検出されませんでした。
この方法の性能はまた、LFB Sを用いて測定しました。二つの異なる種のレベルを使用して変更amples。ポリオウイルス1,000 MPNがで性能を試験するために使用されたのポリオウイルスの300 MPNの「低」力価は、USEPAメソッド1615 A "ハイ"力価で使用される「標準的な」500 MPN LFBレベルより低いレベルでの性能を評価するために使用されましたLFSM制御のレベル。これらのコントロール111％で、平均回収率100％の変動係数（ 図2）と同様に行います。すべてのLRBサンプルは陰性であったし、すべてのLFBサンプルが合格範囲（補足材料表S1）内で行います。
図1のフィルタ溶出カートリッジフィルターを溶出するための圧力容器を使用するための概略図が示されています。正の空気圧は、カートリッジハウジングコン介して圧力容器内の牛肉抽出液を押し出すために使用され電気陽性カートリッジフィルターをtaining。蠕動ポンプは、牛肉抽出液を保持する容器内に配置され、ポンプの入口を、圧力容器の代わりに用いることができます。
地上から図2.平均ポリオウイルス回復（％）および試薬グレード水。平均回収率は、地上からのポリオウイルスのために示されています（ 
; N = 4）および試薬グレード水（ 
; N = 12）のサンプル。 12試薬グレードの水サンプルは、6が300 MPNを播種し、6は、ポリオウイルスの千MPNを播種含まれています。エラーバーは標準誤差を表します。
Discussion
USEPAメソッド1615 17（UCMR3）未規制汚染物質の監視規則の第三の監視サイクル中に使用するために開発され、主に地下水にウイルスの発生を測定するために設計されました。これは、情報収集ルール（ICR）法、15,18と共通のステップ数を共有するが、2つの小さな違いがあります。両方とも、最確数（MPN）の計算に基づいている定量でBGM細胞の単層上でCPEを生成するウイルスを測定するための量子アッセイを使用しています。方法1615が、様々な水マトリックスからウイルスを濃縮するための新しい電気陽性のフィルタの使用を可能にし、細胞培養試験容器の数が20から両方の軽微な変更は、方法全体のコストを削減10に希釈ごと複製減少します。反復数の減少は、労働力を減少させるが、わずかに低い検出限界をもたらします。地下水が地表水よりもウイルスの低い濃度を有することが期待されるものの、19,20番目アッセイしたサンプルの電子の量が違いを部分的に補償する、地表水の5倍です。少ない繰り返しの使用が最も地表水には十分だろうが、いくつかは、サンプル希釈が必要になります。
方法1615は、いくつかの重要なステップと制限があります。牛肉抽出物は、ロットごとに異なります。記載されているように各ロットは、ウイルスの溶出および二次濃縮工程を経てウイルス濃度の能力の有効性について試験されるべき補足材料セクションS2.3です。この方法は、BGM細胞培養物に接種し、ウイルス力価を決定するために試料の量を計算するための正確な公式を使用します。これらの式は厳密に従わない場合は不正確な結果が生成されます。適切な無菌技術は、細胞培養物を維持するために使用されなければなりません。 14日間のインキュベーション期間の間に苦痛を示す非感染BGM細胞培養コントロールは、おそらく細胞培養の維持の問題を示しています。細心の注意はまた、TAでなければなりません交差汚染を避けるための接種及び細胞培養フラスコに培地添加に伴うピペッティングステップの間ケン。補足材料セクションS2で説明した品質管理を厳格に守る必要があります。セクションS2はまた、品質問題のトラブルシューティングに関するアドバイスを提供します。
フィルタを電気陽性するウイルス吸着の主要なメカニズムは、フィルター上の正電荷の強さとその等電点に関連したウイルスの負電荷の強さと21をテストされている水のpHに関連する電荷相互作用です。フィルターからの溶出はまた、これらの相互作用の強さに影響されます。彼らはウイルス型の間であっても、同一タイプ内の菌株によって異なるため、フィルターからの溶出は一様ではありません。これは、任意の結果は環境水中に存在するウイルスの実際のレベルを過小評価してもよいことを意味します。単一BGM細胞株の使用は、ウイルスの発生を過小評価します。範囲主にポリオウイルスとエンテロウイルスB種の血清型だけでなく、いくつかのレオ14,15,22に限定され、この細胞株でCPEを生成することができます腸内ウイルスの。他の感染性ウイルスの型は検出されません。
地面と試薬グレード水からのポリオウイルスの回収率は、両方の性能評価のためのUSEPAメソッド1615パフォーマンス受け入れ基準を満たした（PE;開始前にアナリストの性能を評価するために使用されているアナリストに未知の力価を有する、すなわち 、シードされた試薬グレードの水サンプル研究の）とLFBサンプル（補足材料表S1）。培養の手順を使用して地下水から58％回収は、水道水23,24を使用して他の人が報告したものと同様です。変動係数100％の（CV）と111％とLFBサンプルからの平均回収率はまた、PEのサンプルについて観察されたものよりも高いにもかかわらず、メソッド性能受け入れ基準を満たしたDURICRをる。 ICRは、平均intralaboratory回収率は85％（; ICR PEデータベースからの未発表データのCV 58〜131％）に36から変化させながら、施設間回収率は92％の変動係数（CV）で56％であったわけ。高い回収率がより高い種子サンプル（122 42対％）の場合よりも低いシードLFBのサンプルについて、本研究で観察されました。 ICRは、計画された時点で、それは、低いシード値を受信したPEのサンプルを、それらの高い種を受信することがより低い回収率を有するであろうことが予想されました。 LFBサンプルについてここで観察されたものと同様の、ICR PEサンプルのポリオウイルスの回収は、シード値の（CV 100％）、54％（CV 69％）、44％（CV 71％）71％であった≤300MPN、300-それぞれ1500 MPN、および> 1500 MPN、。
水試料25中の感染性ウイルスを測定するための多くの方法があります。この方法は、標準化の程度の他の方法に関してで重要です。標準化は、品質と性能のコントロールが含まれていないだけで、だけでなく、すべての分析ラボは、同一の方法を実行することを確実にするために定義されているボリュームと数式を使用しています。標準化せず、実験室全体で結果を比較することは困難であり、複数の分析研究室における大規模な研究を行う際に、従って標準化が不可欠です。内蔵の標準化と、この方法は、追加のウイルス型および細胞株が含まれるように、将来的に拡張することができます。研究は、メソッドへのアデノウイルスの混入のためのデータを提供するために進行中です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beef extract, desiccated powder | BD Bacto | 211520 | |
| Cryogenic tubes | Thermo Fisher | 3775/945373 | |
| Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 14170-112 | |
| Mechanical rocking platform | Daigger | EF4907G | |
| Orbital shaker | Thermo Fisher | 14-285-729 | |
| Sterilizing filter with prefilter | VWR | 28143-295 | |
| Sterilizing syringe filter | Corning | 431219 | |
| pH Standards | Sigma-Aldrich | 33643, 33646, 33648 | |
| MEM | Sigma-Aldrich | M1018 or M4642 | |
| Leibovitz L-15 | Sigma-Aldrich | L4386 | |
| Sodium bicarbonate, 7.5% | Sigma-Aldrich | S8761 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10082-139 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Trypsin, EDTA | Invitrogen | 25200072 |
References
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