Funktionell karakterisering av Na<sup> +</sup> / H<sup> +</sup> Värmeväxlare av intracellulära Utrymmen Använda Proton-dödande Urval att uttrycka dem på plasmamembranet
Summary
The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers.
Abstract
Endosomal försurning är avgörande för ett brett spektrum av processer, såsom protein återvinning och nedbrytning, receptor hyposensibilisering, och signalsubstans lastning i synaptiska vesiklar. Denna försurning beskrivs vara medierad genom proton ATPaser, kopplade till CLC klorid transportörer. Mycket-bevarad elektroneutral protoner transportörer, är Na + / H + växlarna (NHE) 6, 7 och 9 uttrycks också i dessa fack. Mutationer i deras gener har kopplats med mänskliga kognitiva och neurodegenerativa sjukdomar. Paradoxalt nog deras roller förblir svårfångad, eftersom deras intracellulära lokalisering har förhindrat detalj funktionell karakterisering. Detta manuskript visar en metod för att lösa detta problem. Denna består av val av muterade cellinjer, som kan överleva akut cytosolic försurning genom att behålla intracellulära NHE vid plasmamembranet. Den skildrar sedan två kompletterande protokoll för att mäta jon selektivitet och aktivitetav dessa värmeväxlare: (i) en baserad på intracellulära pH-mätningar med hjälp av fluorescens videomikroskopi, och (ii) en som bygger på de snabba kinetik litiumupptag. Sådana protokoll kan extrapoleras för att mäta andra icke-electrogenic transportörer. Dessutom urvalsförfarandet presenteras här genererar celler med en intracellulär behålla defekt fenotyp. Därför dessa celler kommer också uttrycker andra vesikulär membranproteiner på plasmamembranet. Den experimentella strategi avbildas här kan därför utgöra ett potentiellt kraftfullt verktyg för att studera andra intracellulära proteiner som kommer att sedan uttrycks på plasmamembranet tillsammans med vesikulär Na + / H + växlarna som används för urvalet.
Introduction
De flesta intracellulära fack visar ett surt luminal pH, vilket är en viktig parameter för mognad, trafficking, återvinning av proteiner eller hormoner och signalsubstanser lastning. Det har visats att pH-gradienten mellan cytosolen och vesikulär innehåll genereras av vakuolär H + ATPaser 1, kopplad till vesikulära clc klorid transportörer 2. Både i knock-out (KO) möss och mänskliga patienter, har betydelsen av dessa transportörer lyfts fram av de tunga fenotyper orsakas av mutationer i sina gener 3-6.
Medlemmarna i Natrium-Hydrogen växlarna SLC9A familj, kallas också NHE för Na + / H + växlarna, har visat sig vara viktiga effekten i intracellulär pH och cellvolym reglering, samt i vectorial transport av syra-bas-ekvivalenter över epitel . Förutom plasmamembran NHE, tre högkonserverade Na + / H + växlare, NHE 6, 7och 9 uttrycks i trans Golgi nätet och i tidiga endosomer 7. Mutationer i deras gener har kopplats med Angelmans liknande eller Christi syndrom 8-9, familjebaserad autism 10 och Attention Deficit Hyperactivity Disorder 11-12. Dessa växlarna har också varit inblandad i neurodegenerativa problem såsom Alzheimers sjukdom mottaglighet 13 och X-länkade mental retardation intilliggande gener syndrom 14. Sammantaget ger dessa studier belysa vikten av dessa intracellulära NHE i hjärnans utveckling och / eller funktion.
Den intracellulära lokaliseringen av dessa värmeväxlare förhindrar noggranna mätningar av deras jon selektivitet, transportriktningen, kinetiska parametrar och reglering. Som är fallet för alla transportörer som uttrycks i intracellulära fack, är det extremt svårt att bedöma deras biokemiska aktiviteter och därmed till fullo förstå deras fysiologiska roller och mechanismer underliggande deras patologiska konsekvenser. Baserat på den höga cytosoliska K + koncentrationen, var den mest allmänt accepterade hypotesen att de arbetade som K + kopplade proton uttransportörer. Förekomsten av en sådan protonläcka hade hypotes, eftersom det kan motverka protonpumpning av V-ATPaser för att upprätthålla ett stabilt tillstånd vesikulär pH. Syftet med denna visuella artikeln är (i) för att visa en metod som tillåter den genetiska urval av cellinjer som uttrycker sådana vesikulära transportörer vid deras plasmamembran, och (ii) för att visa två oberoende metoder för att mäta funktionerna för dessa transportörer.
Tre decennier sedan, Pouysségur och Franchi har banat en genetisk metod som gjorde det möjligt för molekylär kloning och karakterisering av medlemmarna i NHE familjen 15. Detta baserades på toxicitet intracellulära protoner som en screeningmetod. Det första steget var att få cellinjer bristfälligi någon Na + / H + utväxling på plasmamembranet med hjälp av reversibilitet av denna transportör. Fibroblaster (CCL39 cellinje) var förladdad med Na + eller Li + och placerades sedan i ett surt extracellulärt medium (pH 6,5) under 2 h. Detta ledde till döden av celler som uttrycker en funktionell Na + / H + utbyte och till valet av antiport-brist celler (PS120 cellinje) 16. När odlas i bikarbonat fritt medium, dessa celler är mycket känsliga för akut intracellulär försurning. Följaktligen kommer uttrycket av någon funktionell proton effluxmekanism vid plasmamembranet positivt väljas (se 17), om sådana celler in till akuta intracellulära acidifications. Sådana försurnings tekniker kan användas för att isolera cellinjer med trafficking defekter som möjliggör forcerad expression av WT intracellulära NHE vid plasmamembranet.
Som eukaryot Na + / H+ Växlare är elektroneutral, de är inte mätbar med de elektrofysiologiska metoder som har använts med stor framgång för att mäta kanaler. Detta manuskript visar därför hur man mäter aktiviteten hos detta växla av intracellulära pH-mätningar och snabb kinetik av litium upptag. Som de underliggande begreppen är desamma, är det intressant att notera att många av de processer som utvecklats för sektionen urvalet också används direkt för funktionella mätningar.
Intressant nog har vi observerat att trafficking defekt närvarande i cellinjer utvalda med hjälp av metod som beskrivs i detta manuskript leder till ett större uttryck av andra vesikulära proteiner vid plasmamembranet såsom vesikulär kaliumkanalen TWIK1 18. Detta pekar ut mot valet av en allmän behålla defekt mekanism för vesikulära transmembranproteiner. Därav denna urvalsförfarandet och de celler som den genererar majutgör ett lovande verktyg för det vetenskapliga samfundet arbetar på membranproteiner av intracellulära fack. Samt de mätmetoder som presenteras här kan vara tillämpliga för att studera andra icke-electrogenic transportörer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll beskriver hur man väljer celler som uttrycker intracellulära Na + / H + växlarna vid plasmamembranet utan att deras primära sekvens genom riktad mutagenes. Dessa värmeväxlare kan nu karakteriseras.
Denna metod är baserad på den cellulära toxiciteten hos intracellulära protoner för att välja cellinjer som kommer att uttrycka vesikulär Na + / H + växlarna vid plasmamembranet. Det kan vara möjligt, i princip, att använd…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors are deeply indebted to all the members of the scientific community working on pH and ion transport, who have originated and improved the measurements described here. They particularly thank Dr. Jacques Pouysségur who originated the H+-killing selection technique used here. They acknowledge the University of Nice-Sophia Antipolis, the CNRS, the ANR (JCJC SVSE1 NHEint) and the ICST Labex for support.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Standard cell culture equipement | Used for H+ killing selection composed of many devices with different catalog numbers | ||
| Incubator with CO2 | Sanyo | MCO15A | |
| Incubator without CO2 | Heraeus instrument | BB6220 | |
| Laminar flow hood PSM1200NF | Fisher | 52010120 | |
| DMEM medium | sigma | D5796 | |
| FBS gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Penicilin/streptomycin | PAA | P11-010 | |
| Trypsin 10X | PAA | L11-003 | |
| Atomic Absorption spectrometer with Zeeman furnace system | Thermo Scientific | ICE 3500 GFZ | |
| LiCl | sigma | L4408 | |
| Nitric Acid | sigma | 438073 | |
| Fluorescence videomicroscopy set | Leica | Composed of many devices with different catalog numbers | |
| Inverted automated microscope | Leica | DMI6000B | |
| microscope stand | leica | 11888906 | |
| 11888911 | |||
| 11505180 | |||
| 11888377 | |||
| incident fluorescence | leica | 11888901 | |
| 11504166 | |||
| motor bracket | leica | 11888379 | |
| 11505234 | |||
| 11521505 | |||
| 11522106 | |||
| LED transmission light | leica | 8097321 | |
| 8102034 | |||
| 11521580 | |||
| motorized plate | leica | 11522068 | |
| 11531172 | |||
| 11521734 | |||
| 11521719 | |||
| 11888423 | |||
| 11888424 | |||
| camera output | leica | 11888373 | |
| 11507807 | |||
| 11888393 | |||
| 11888259 | |||
| 11888258 | |||
| 11541510 | |||
| images acquisition/analysis software | leica | 11888375 | |
| optics | leica | 11506507 | |
| 11506243 | |||
| 11506203 | |||
| fluorescence Xenon lamp | leica | DMI6000 | |
| camera | hamamatsu | 8100601 | |
| metafluor/Mmfluor software | 11640905 | ||
| pH sensitive probe, BCECF-AM | life technologies | B1170 | |
| Nigericin | Sigma | N7143 |
References
- Marshansky, V., Futai, M. The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).
- Jentsch, T. J. Chloride and the endosomal-lysosomal pathway: emerging roles of CLC chloride transporters. J Physiol. 578 (3), 633-640 (2007).
- Kornak, U., et al. Mutations in the a3 subunit of the vacuolar H(+)-ATPase cause infantile malignant osteopetrosis. Hum Mol Genet. 9 (13), 2059-2063 (2000).
- Gunther, W., Piwon, N., Jentsch, T. J. The ClC-5 chloride channel knock-out mouse – an animal model for Dent’s disease. Pflugers Arch. 445 (4), 456-462 (2003).
- Kasper, D., et al. Loss of the chloride channel ClC-7 leads to lysosomal storage disease and neurodegeneration. Embo J. 24 (5), 1079-1091 (2005).
- Poet, M., et al. Lysosomal storage disease upon disruption of the neuronal chloride transport protein ClC-6. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (37), 13854-13859 (2006).
- Nakamura, N., Tanaka, S., Teko, Y., Mitsui, K., Kanazawa, H. Four Na+/H+ exchanger isoforms are distributed to Golgi and post-Golgi compartments and are involved in organelle pH regulation. J Biol Chem. 280 (2), 1561-1572 (2005).
- Gilfillan, G. D., et al. SLC9A6 mutations cause X-linked mental retardation, microcephaly, epilepsy, and ataxia, a phenotype mimicking Angelman syndrome. Am J Hum Genet. 82 (4), 1003-1010 (2008).
- Mignot, C., et al. Novel mutation in SLC9A6 gene in a patient with Christianson syndrome and retinitis pigmentosum. Brain & Development. 35 (2), 172-176 (2013).
- Morrow, E. M., et al. Identifying autism loci and genes by tracing recent shared ancestry. Science. 321 (5886), 218-223 (2008).
- Lasky-Su, J., et al. Genome-wide association scan of the time to onset of attention deficit hyperactivity disorder. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 147B (8), 1355-1358 (2008).
- Franke, B., Neale, B. M., Faraone, S. V. Genome-wide association studies in ADHD. Hum Genet. 126 (1), 13-50 (2009).
- Meda, S. A., et al. A large scale multivariate parallel ICA method reveals novel imaging-genetic relationships for Alzheimer’s disease in the ADNI cohort. Neuroimage. 60 (3), 1608-1621 (2012).
- Zhang, L., et al. A microdeletion in Xp11.3 accounts for co-segregation of retinitis pigmentosa and mental retardation in a large kindred. Am J Med Genet A. 140 (4), 349-357 (2006).
- Sardet, C., Franchi, A., Pouysségur, J. Molecular cloning, primary structure, and expression of the human growth factor-activatable Na+/H+ antiporter. Cell. 56 (2), 271-280 (1989).
- Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L’Allemain, G., Paris, S. A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).
- Franchi, A., Cragoe, E., Pouysségur, J. Isolation and properties of fibroblast mutants overexpressing an altered Na+/H+ antiporter. J Biol Chem. 261 (31), 14614-14620 (1986).
- Milosavljevic, N., et al. The Intracellular Na+/H+ Exchanger NHE7 effects a Na+ coupled, but not K+ coupled proton-loading mechanism in endocytosis. Cell Reports. 7 (3), 1-8 (2014).
- Wigler, M., et al. Transformation of mammalian cells with genes from procaryotes and eucaryotes. Cell. 16 (4), 777-785 (1979).
- Lacroix, J., Poët, M., Maherel, C., Counillon, L. A mechanism for the activation of the Na/H exchanger NHE-1 by cytoplasmic acidification and mitogens. EMBO Reports. 5 (1), 91-96 (2004).
- Milosavljevic, N., et al. Nongenomic Effects of Cisplatin: Acute Inhibition of Mechanosensitive Transporters and Channels without Actin Remodeling. Cancer Res. 70 (19), 7514-7522 (2010).
- Boron, W. F., De Weer, P. Intracellular pH transients in squid giant axons caused by CO2, NH3, and metabolic inhibitors. J Gen Physiol. 67 (1), 91-112 (1976).
- Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. Na+-H+ exchange in gastric glands as measured with a cytoplasmic-trapped, fluorescent pH indicator. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (23), 7436-7440 (1984).
- Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. Digital image processing of intracellular pH in gastric oxyntic and chief cells. Nature. 325, 447-450 (1987).
- Quentin, F., et al. RhBG and RhCG, the putative ammonia transporters, are expressed in the same cells in the distal nephron. J Am Soc Nephrol. 14 (3), 545-554 (2003).
- Geyer, R. R., Musa-Aziz, R., Enkavi, G., Mahinthichaichan, P., Tajkhorshid, E., Boron, W. F. Movement of NH3 through the human urea transporter B: a new gas channel. Am J Physiol Renal Physiol. 304 (12), F1447-F1457 (2013).
