The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers.
Endozomal asidifikasyonu gibi sinaptik vesiküller protein geri dönüşüm ve bozulma, reseptör duyarsızlaştırma ve nöro-yükleme gibi işlemler, geniş bir aralığı için önemlidir. Bu asitlenme CIC klorür nakliyecilere birleştiğinde proton ATPazların, aracılık tarif edilmektedir. Elektro-proton taşıyıcıları yüksek ölçüde muhafaza edilmiş, Na + / H + değiştiriciler (NHE) 6, 7 ve 9, bu bölmelerin olarak ifade edilmiştir. Genlerindeki mutasyonlar, insan bilişsel ve nörodejeneratif hastalıklar ile bağlantılı olmuştur. Onların hücre içi lokalizasyonu detaylı fonksiyonel karakterizasyonu engelledi gibi Paradoksal, rolleri, zor kalır. Bu yazının bu sorunu çözmek için bir yöntemi gösterir. Bu plazma membranında hücre içi NHEs tutma akut sitosolik asitlenme kalan kapasitesine sahip mutant hücre hatlarının seçimi oluşur. Daha sonra iyon seçiciliği ve aktivitesini ölçmek için iki tamamlayıcı protokol göstermektedir(i) bir floresan görüntü mikroskopi kullanılarak hücre içi pH ölçümleri göre, ve (ii) bir lityum alımının hızlı kinetik göre: Bu değiştirici. Bu tür protokoller olmayan diğer Elektrojenik taşıyıcıları ölçmek için çıkarım olabilir. Ayrıca, burada sunulan seçim prosedürü bir hücre içi tutma arızalı fenotip hücreleri üretir. Bu nedenle, bu hücreler de plazma zarı diğer veziküler membran proteinleri ifade edecektir. Burada tasvir edilen deneysel strateji, bu nedenle daha sonra veziküler + / H + seçimi için kullanılan değiştiriciler, Na ile birlikte, plazma membranında ifade edilecektir diğer hücre içi proteinleri incelemek için potansiyel olarak güçlü bir araç olarak kullanılabilmektedir.
Çoğu hücre içi bölmeleri olgunlaşması, insan ticareti, proteinler veya hormonlar ve yükleme nörotransmitterlerin geri dönüşümü için önemli bir parametredir asidik lümen pH görüntüler. Bu sitosol ve vesiküler içeriği arasındaki pH gradyanı veziküler CIC klorür taşıyıcılar 2 bağlanmış, vaküoler H + ATPazların 1 ile elde edildiği gösterilmiştir. Her iki knock-out (KO) farelerde ve insan hastalarda, bu taşıyıcıları önemi onların genlerinde 3-6 mutasyonlar neden ağır fenotip tarafından vurgulanmıştır.
Sodyum-hidrojen değiştirici SLC9A ailesinin üyeleri, aynı zamanda, Na + / H + değiştirici NHEs olarak adlandırılan hücre-içi pH ve hücre hacmi düzenlenmesinde anahtar etkileyiciler yanı sıra epitelden asit-baz eşdeğerleri vektör taşıma olduğu gösterilmiştir . Plazma zarı NHEs yanı sıra, üç yüksek + / H + değiştiriciler, NHE-6, 7, Na korunmuşve 9, trans-Golgi ağı ve erken endozomlarda 7 olarak ifade edilmiştir. Onların genlerinde mutasyonlar Angelman benzeri veya Christianson sendromları 8-9, aile temelli otizm 10 ve Dikkat Eksikliği Hiperaktivite Bozukluğu 11-12 ile bağlantılı olmuştur. Bu dönüştürücüler ayrıca Alzheimer hastalığı yatkınlık 13 ve X-bağlantılı mental retardasyon bitişik genler gibi nörodejeneratif sorunlara 14 sendromları dahil edilmiştir. Birlikte ele alındığında, bu çalışmalar beyin gelişimi ve / veya fonksiyon bu hücre içi NHEs önemini vurgulamak.
Bu eşanjörleri hücre içi lokalizasyonu doğru onların iyon seçicilik ölçümleri, ulaşım yönü, kinetik parametreleri, ve düzenleme önler. Hücre içi bölümlerinde ifade tüm nakliyeciler için olduğu gibi, onların biyokimyasal faaliyetlerini değerlendirmek ve dolayısıyla tam olarak fizyolojik rolleri ve Mechan anlamak son derece zorizm kendi patolojik etkileri altında yatan. Yüksek sitozolik K + konsantrasyonu dayanarak, en çok yaygın kabul gören hipotez onlar K + birleştiğinde proton akış taşıyıcıları olarak görev olmasıydı. Bu değer sabit bir veziküler pH'sını muhafaza etmek için V-ATPazların proton pompalama telafi edilebilir bir proton sızıntı olması, hipotez edilmiştir. Bu görsel maddenin amacı, plazma membranında veziküler taşıyıcıları ifade, ve (ii) bu nakil fonksiyonlarını ölçmek için, bağımsız iki yaklaşım göstermek için hücre çizgilerinin genetik olarak seçilmesi ile sağlayan bir yöntemi göstermek için, (i) 'dir.
Üç yıl önce, Pouysségur ve Franchi NHE ailesinin 15 üyesi moleküler klonlama ve karakterizasyonu etkin bir genetik yaklaşım öncülük etmiştir. Bu tarama yöntemi olarak hücre içi proton toksisite dayanıyordu. İlk adım hücre hatları eksik elde etmek olduHerhangi bir Na + / H + değişimi bu taşıyıcı geri döndürülme oranı kullanılarak, plazma membranında ifade edilmiştir. Fibroblastlar (CCL39 hücre çizgisi), Na + ya da Li + önceden yüklenmiş ve daha sonra 2 saat süre ile bir asidik hücre dışı ortam (pH 6.5) içine yerleştirildi. Bu fonksiyonel, Na + / H + değişimi ifade eden hücrelerin ölümüne ve damar sertliği-yetersizliğine sahip hücrelerin (PS120 hücre çizgisi) 16 seçimine yol açmıştır. Bikarbonat içermeyen bir ortam içinde kültive edilince, bu hücreleri, akut hücre içi asitlenme çok hassastır. Bu tür hücreleri, akut hücre içi acidifications sunulur Sonuç olarak, eğer plazma membranında herhangi bir işlevsel proton akış mekanizması sentezleme pozitif (bakınız 17) seçilir. Bu gibi asitleştirme teknikler plazma membranında WT hücre içi NHEs zorla ifade sağlayan kusurları trafiğe sahip hücre çizgileri izole etmek için kullanılabilir.
Ökaryotik, Na + / H deEşanjörleri elektro +, onlar kanalları ölçmek için büyük bir başarı ile kullanılmaktadır elektrofizyolojik yaklaşımlarla ölçülebilir değildir. Bu yazıda, bu nedenle hücre içi pH ölçümleri ve lityum alımının hızlı kinetik bu değiştirici aktivitesini ölçmek için nasıl gösterir. Temel kavramlar aynı gibi, bu seçim bölümü için geliştirilmiş süreçlerin birçok fonksiyonel ölçümler için doğrudan kullanılan olduğunu fark etmek ilginçtir.
İlginç bir şekilde, bu metinde tarif edilen yaklaşımı kullanılarak seçilmiş hücre çizgileri mevcut trafik kusur veziküler potasyum kanalı TWIK1 18 olarak plazma zarının diğer veziküler proteinlerin daha büyük bir ifadesine neden olduğu gözlenmiştir. Bu veziküler transmembran proteinler için genel bir tutma kusur mekanizmasının seçimi doğru işaret. Dolayısıyla bu seçim prosedürü ve Mayıs üretir hücrelerihücre içi bölmelerin zar proteinleri üzerinde çalışanlar için ümit veren bir araç oluşturmaktadır. Yanı sıra burada sunulan ölçüm teknikleri olmayan diğer Elektrojenik taşıyıcıları çalışmak için geçerli olabilir.
Bu protokol, mevkiye-yönelik mutagenez ile birincil dizisini değiştirmeden, plazma membranında, hücre içi, Na + / H + değiştiriciler ifade eden hücreleri seçin açıklamaktadır. Bu değiştirici hemen karakterize edilebilir.
Bu yöntem, plazma membranında veziküler, Na + / H + değiştiricileri ifade edecek hücre hatları seçmek için hücre içi proton hücresel zehirlilik dayanmaktadır. Bu örneğin, Li +, K +,</su…
The authors have nothing to disclose.
The authors are deeply indebted to all the members of the scientific community working on pH and ion transport, who have originated and improved the measurements described here. They particularly thank Dr. Jacques Pouysségur who originated the H+-killing selection technique used here. They acknowledge the University of Nice-Sophia Antipolis, the CNRS, the ANR (JCJC SVSE1 NHEint) and the ICST Labex for support.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Standard cell culture equipement | Used for H+ killing selection composed of many devices with different catalog numbers | ||
Incubator with CO2 | Sanyo | MCO15A | |
Incubator without CO2 | Heraeus instrument | BB6220 | |
Laminar flow hood PSM1200NF | Fisher | 52010120 | |
DMEM medium | sigma | D5796 | |
FBS gold | GE Healthcare | A15-151 | |
Penicilin/streptomycin | PAA | P11-010 | |
Trypsin 10X | PAA | L11-003 | |
Atomic Absorption spectrometer with Zeeman furnace system | Thermo Scientific | ICE 3500 GFZ | |
LiCl | sigma | L4408 | |
Nitric Acid | sigma | 438073 | |
Fluorescence videomicroscopy set | Leica | Composed of many devices with different catalog numbers | |
Inverted automated microscope | Leica | DMI6000B | |
microscope stand | leica | 11888906 | |
11888911 | |||
11505180 | |||
11888377 | |||
incident fluorescence | leica | 11888901 | |
11504166 | |||
motor bracket | leica | 11888379 | |
11505234 | |||
11521505 | |||
11522106 | |||
LED transmission light | leica | 8097321 | |
8102034 | |||
11521580 | |||
motorized plate | leica | 11522068 | |
11531172 | |||
11521734 | |||
11521719 | |||
11888423 | |||
11888424 | |||
camera output | leica | 11888373 | |
11507807 | |||
11888393 | |||
11888259 | |||
11888258 | |||
11541510 | |||
images acquisition/analysis software | leica | 11888375 | |
optics | leica | 11506507 | |
11506243 | |||
11506203 | |||
fluorescence Xenon lamp | leica | DMI6000 | |
camera | hamamatsu | 8100601 | |
metafluor/Mmfluor software | 11640905 | ||
pH sensitive probe, BCECF-AM | life technologies | B1170 | |
Nigericin | Sigma | N7143 |