Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

Tre-dimensionel Co-kultur Model for Tumor-stromale Interaktion

doi: 10.3791/52469 Published: February 2, 2015

Protocol

BEMÆRK: Denne undersøgelse blev godkendt af de relevante etiske komitéer.

1. Primær dyrkning af humane lungefibroblaster

  1. Indsamling af lungevæv:
    1. Opnå humane lunge vævsprøver fra det kirurgiske operationsstuen direkte. Saml ca. 1 cm 3 blokke fra kræft og ikke-kræft lungevæv, med ikke-kræft prøve indsamlet så langt væk fra tumoren som muligt.
    2. Suspender prøverne i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 100 enheder / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin og 0,25 pg / ml amphotericin B (serum-frit medium). Bevar de suspenderede prøver i sterile 50 ml rør og overføre til laboratoriet.
      BEMÆRK: fibroblaster stærkt vandrende og proliferativ sammenlignet med andre celletyper, såsom epitel-, endotel- og glatte muskelceller. Udvækst metode drager fordel af disse funktioner af fibroblaster, og outgrofløj celler fra vævssnit er rigelige i fibroblaster. Efter flere cellepassager andre celletyper ikke overleve og formere i DMEM med 10% føtalt bovint serum (FBS), hvilket resulterer i oprensede fibroblast cellekulturer. Cellerne kan anvendes 3-7 passager efter primær kultur.
  2. Eksplantation kultur og konditionering for celle udvækst:
    1. Udfør primær kultur af fibroblaster under anvendelse af en tidligere rapporteret protokol med modifikationer 5.
    2. I laboratoriet placere vævsprøven på en 10 cm vævsdyrkningsskål uden dyrkningsmedium og skæres i små sektioner ~ 2-3 mm i størrelse ved hjælp af steril pincet og en skalpel. Under denne proces, undgå at afsnittet tør, ellers effektivitet celleudvækst forringes.
  3. Adskillelse af epithelcellelaget og bindevæv:
    1. Soak cut vævssnit i dyrkningsmedium indeholdende 2.000 PU / ml dispase I og kultur i 16 timer ved 4 ° C. </ Li>
    2. Overfør vævssnittene til en skål, og adskil epitelcellelaget fra tilstødende bindevæv. Behandle sektioner i en ren bænk for at undgå forurening af mikroorganismer.
      BEMÆRK: Hvis primær kultur af epitelceller er behov for, udføre trin 1.3. Hvis der kun fibroblaster skal isoleres, udelade trin 1.3, da de efterfølgende eksplantat kultur og cellepassager er ugunstige for epitelceller, der giver oprensede fibroblast befolkninger.
  4. Fastgørelse af vævssnit:
    1. Hak væv i 1 mm stykker under anvendelse af to skalpeller. Hvis stykkerne er ikke små nok, de løsnes lettere fra skålen, og cellerne vil ikke vokse på skålen overflade.
    2. Placer små lunge vævssnit fra hinanden for at opretholde et tomt område omkring hvert stykke. Gør ridser på overfladen af ​​vævskulturskål ved hjælp af en skalpel for at lette fastgørelse af vævssnit.
      BEMÆRK: Skrabeogså synes at fremme celle udvækst, der giver spor langs hvilke celler kan migrere.
      1. Alternativt placeres hakket vævsstykker enkeltvis i hver brønd i en 6-brønds plade, og dække dem med et dækglas. Fastgør dækglas til overfladen af ​​pladen ved hjælp af siliconefedt.
      2. Placer siliconefedt på to punkter 1,5 cm fra hinanden i hver brønd under anvendelse af en steril nål. Dækning af væv stykker forbedrer effektiviteten af ​​celle udvækst og celle formering efter flere passager.
  5. Efterfølgende eksplantat kultur:
    1. Forsigtigt tilføje dyrkningsmedium i skålen før vævssnittene tørre ud, så effektiv celleudvækst er tabt for det meste, hvis prøverne tørre ud. Hæld ikke mediet for hurtigt, da vævssnit ville løsne.
    2. Kultur celler i DMEM med 10% FBS. Brug nok medium til blot dække vævet, men ikke for meget, at det giver mulighed for flydende, som ekstra opdrift fremmer løsrivelse fraskål.
  6. Cell passage:
    1. Håndtag dyrkningsmediet med omhu på alle tidspunkter, som gentagne bevægelser i dyrkningsskålen kan føre til frigørelse af vævssnit.
    2. Placer dyrkningsskålene i en inkubator ved 37 ° C i 5-7 dage. Opdater mediet hver anden dag, og håndtere dyrkningsskålene minimalt under medium ændringer. Fibroblaster vokser fra kanten af ​​vævssnit i de kommende uger.
      BEMÆRK: Efter ~ 2-3 uger, outgrowing fibroblaster næsten nå sammenløb, afhængigt af mængden af ​​overfladeareal.
    3. Vask cellerne med 1x PBS, og der tilsættes 1 ml af trypsin I til pladen.
    4. Efter trypsinisering, løsnes cellerne under anvendelse af 9 ml DMEM suppleret med 10% FBS. Saml celler suspenderet i mediet i en 10 ml rør, sammen med vævssnit. Efter centrifugering til dannelse af cellepellets resuspenderes resulterende pellets i det nye medie.
    5. Frø cellerne og vævssnit på en ny culklatur skålen, på hvilket tidspunkt væv ikke at fastgøre til skålen, mens cellerne klæber og vokse. Den følgende dag, fjerne flydende væv stykker ved aspiration, og ændre mediet. Vedhæftede fibroblaster forplanter med efterfølgende kulturer.

2. Tre-dimensionel Co-kultur af menneskelige lungefibroblaster og cancerceller

  1. Fremstilling af celler og reagenser:
    1. Ca. bruge 2 x 10 5 epitelceller og 2,5 x 10 5 fibroblaster per brønd. Forbered collagen type IA (3 mg / ml, pH 3), FBS (100%), rekonstituering puffer (50 mM NaOH, 260 mM NaHCO3, 200 mM HEPES), 5x DMEM, DMEM suppleret med 10% FBS for fibroblast kultur, og et 3D co-dyrkningsmedium (en 1: 1 blanding af fibroblast dyrkningsmedium og dyrkningsmedium til kræftceller).
    2. Kultur A549 lungeadenocarcinom celler, fibroblaster og A549 3D co-kultur i DMEM suppleret med 10% FBS.
  2. Kollagengel formation:
    1. Vask fibroblaster dyrket den 10. cm skål med 1x PBS, og der tilsættes 1 ml trypsin I til pladen. Efter trypsinisering for ~ 5 min ved 37 ° C, løsne cellerne under anvendelse af 9 ml DMEM suppleret med 10% FBS. Saml celler suspenderet i mediet i en 10 ml rør og centrifugeres dem på 200-300 xg til dannelse cellepellets.
    2. Resuspender resulterende pellets i 100% FBS ved en densitet på 5 x 10 5 / ml.
    3. Forbered kollagengelen på is. Cool reagenserne, pipetter og rør i et køleskab før den følgende procedure. Selv på is, blandingen størkner til en vis grad, og det samlede volumen er mindre end summen af ​​alle bestanddele.
    4. I hver brønd, forberede kollagen gel ved at blande 0,5 ml fibroblast suspension (2,5 x 10 5 celler) i FBS, 2,3 ml type IA collagen, 670 pi 5x DMEM, og 330 pi rekonstituering buffer. Tillad gelerne at indstille let ved stuetemperatur.
      1. Energisk pipette til at sikre en homogen mixture. Undgå at skabe bobler under pipettering proces.
    5. Tilsæt blandingen (3 ml) til hver brønd i en 6-brønds plade og tillade at gelatinere i inkubatoren ved 37 ° C uden forstyrrelser i 30-60 min.
  3. Cancer cellekultur på kollagengelen:
    1. Udfør tredimensionale co-kultur under anvendelse af en tidligere rapporteret protokol med modifikationer 6.
    2. Resuspender kræftceller i 3D co-dyrkningsmedium (eller i DMEM med 10% FBS i tilfælde af A549-celler) ved en densitet på 1 x 10 5 / ml.
    3. Hæld 2 ml af resuspenderede celler opløsning (2 x 10 5 celler) på overfladen af hver gel. Tilpas celleantal på cancerceller eller fibroblaster i co-kultur afhængigt eksperimentelle betingelser.
  4. Gel sammentrækning:
    1. Inkuber geler natten over ved 37 ° C, så kræftcellerne kan klæbe til kollagengelen. Frigør hver gel, og generere en "flydende kultur i hver brønd of 6-brønds plade.
      BEMÆRK: Ved anvendelse af en flydende kultur, er forskellige ændringer i gel størrelse induceret af mekanisk spænding og collagen nedbrydning, som medieres af cellulær interaktion mellem samdyrket cancerceller og fibroblaster.
    2. Brug en vinklet 21 G nål eller lille spatel til at adskille hver gel fra kanten af ​​brønden. Hver 2-3 dage, opdatere brøndene med 2 ml 3D co-dyrkningsmedium. Måle størrelsen af ​​hver gel hver dag i 5 dage.
  5. Analyse af kollagengeler:
    1. Mål indholdet af hver under anvendelse af kollagen kvantificeringsfremgangsmåder såsom Sircol assay collagen. Udfør transkriptom analyse eller kvantitativ RT-PCR efter indsamling RNA fra gelerne 5.

3. Luft-væske interface Kultur og Invasion Assay

  1. Efter dyrkning af kollagengeler ved 37 ° C i 5 dage, udsættes de aftalte geler til luft ved at placere dem på en mesh (70 um porestørrelse) i ny 6-brøndsplader. Gør masken fra kommercielt tilgængelige celle sier anvendes til flowcytometri.
  2. Forsigtigt fylde hver brønd med 11 ml 3D co-dyrkningsmedium.
  3. Placer geler på nettet ved hjælp af en steril ske, og fjern eventuelt resterende medie fra gelerne. På denne tilstand nedsænkes geler i mediet, mens udsætte den øvre overflade af gelen til luft. Definer denne kultur tilstand som luft-væske-grænsefladen.
    BEMÆRK: Efter 5-7 dage for at opretholde luft-væske-grænsefladen kultur ved 37 ° C i inkubatoren, invasive kræftceller migrere ind i gelen. Afhængigt af celletypen og som et resultat af cellulære interaktioner, er variable grader af celle morfologisk ændring i cancercellerne induceret af luft-væske-grænsefladen kultur.
  4. Til histologisk evaluering fastsætte gelen i formalin opløsning natten over ved stuetemperatur og indlejre i paraffin. Farv lodrette sektioner (4 pm) med hematoxylin og eosin (H & E). Udfør immunhistokemisk analyse on sektionerne 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dette samarbejde dyrkningsmetode, efterligner tumormikromiljøet, er et nyttigt redskab til at undersøge samspillet mellem kræftceller og fibroblaster indlejret i kollagengeler. I den tidligere undersøgelse blev tre parametre evalueret i denne eksperimentelle model: collagen gelkontraktion cancercelle invasion og morfologiske forandringer. Cancercelleproliferation blev også estimeres ved hjælp af Ki67 immunfarvning 4. Lungevæv prøver blev indsamlet fra kræft og ikke-kræft sektioner af en resekteret lungelap (figur 1A). Prøver blev hakket i små stykker og dyrkes i DMEM suppleret med 10% FBS (figur 1B). Fibroblaster vokser ud af vævssnittet blev observeret under mikroskopet (figur 1C). Primære dyrkede lungefibroblaster blev indlejret i en kollagengel (figur 2A, a) og A549 lungecancerceller blev co-dyrket på gelen (figur 2A, b). Efter flydende cULTUR i mediet (figur 2A, c), gelen blev yderligere dyrket under forudsætning af luft-væske-grænsefladen (figur 2A, d). Gelen blev fikseret i formalin og anvendt til immunohistokemiske analyser (figur 2A, e). Til luft-væske-grænseflade kultur blev gelen anbragt på en maske i en brønd i 6-brønds plade (figur 2B). Histologiske analyser af gelen afslørede invasion af A549-celler i kollagengelen indlejret med lungecancer-associerede fibroblaster (figur 3).

Figur 1
Figur 1: udvækst af fibroblaster fra kirurgisk resektion humant lungevæv. (A) Prøver blev indsamlet fra kræft og ikke-kræft sektioner af en resekteret lungelap. (B) Prøver blev hakket i små stykker og dyrkes i DMEM suppleret med 10% FBS.(C) Fibroblaster voksede ud af vævssnittet (pil). Bemærk, at cellerne er migreret langs ridser foretaget af skalpelblade på dyrkningsskålen. Scale bar, 200 pm.

Figur 2
Figur 2:. Air-væske-grænseflade kultur kollagengelen A549-celler blev co-dyrket på et kollagen gel indlejret med fibroblasterne, og laget af A549-celler blev udsat for luft ved at placere gel på en maske i medium (A. ) Eksperimentelle fremgangsmåder for tredimensionale co-kultur og luft-væske-grænsefladen. (a) Collagen gel indlejret med lungefibroblaster. (b) A549-celler co-dyrket på collagen gel. (c) flydende kultur. (d) Luft- væske-grænsefladen (ALI). (E) Fiksering af gelen i formalin. (B) Repræsentant billede af the gel placeres på nettet i en brønd på 6-brønds plade. O / N: natten over.

Figur 3
Figur 3. hematoxylin og eosin-farvning af tværsnit af en tre-dimensionelt dyrket gel sammensat af A549-celler og humane lungefibroblaster. Bemærk, at A549-celler dyrket på kollagengelen invaderede gel indlejret med fibroblaster (pile). Scale bar, 200 um. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

CAF udgør en væsentlig bestanddel af ECM omgivende kræftceller og ikke kun give et stillads for tumor, men også deltage aktivt i tumor udvikling 7. Akkumulerende beviser optrevler virkningen af CAF eller de dermed forbundne molekyler på den endelige prognose, fremhæver de kritiske roller CAF-medieret tumorprogression 8.

I den tidligere undersøgelse har vi anvendt udvækst fremgangsmåde til isolering lunge CAF 4. I dette eksperiment opretholdelse af vævssnittet vedhæftning på skålen overflade er kritisk. Celler er i stand til at migrere ud fra vævssnit flydende i dyrkningsmediet, og når vævssnit blive løsnet fra overfladen, kan de ikke længere kan anvendes til celle udvækst på samme dyrkningsskål. Skæring af vævet giver ekssudater, der tjener som en lim til fastgørelse til skålen overflade. Ved fastsættelsen vævssnittet med en dækglas, er også criti mængden af ​​fedt der anvendescal. Små mængder af fedt undlader at holde dækglasset fastgjort, mens overskydende fedt tilslører cellekultur område. Fastgørelse af vævssnit ved hjælp af en dækglas og passende tryk er også en nøgle til lettere celle udvækst.

De eksperimentelle modeller for cancercelleproliferation og invasion har hovedsagelig påberåbt sig to-dimensionelle monolag vævskulturer eller Boyden kammer assays. For bedre at forstå intercellulær kommunikation og ECM-afhængig modulering af cancercelle adfærd tredimensionale co-kulturer er stærke værktøjer. Organotypiske kulturer er også anvendelige til undersøgelse af multicellulære interaktioner, selvom de behøver højere tekniske færdigheder og eksperimentelle betingelser er begrænset.

Vores co-kultur model fungerer som en platform til at vurdere tumor-stromale interaktioner under betingelser efterligner tumormikromiljøet. Celler med specifikt gen overekspression eller knockdown er let anvendelig i vores culture system, som er en fordel i forhold organotypisk kultur. Især vores tidligere observationer foreslog, at co-dyrkede fibroblaster aktivt modulere kræft celledifferentiering og invasion 4. Det ville være af interesse at teste mulige multicellulære interaktioner i vores eksperimentelle omgivelser, såsom endotelceller, inflammatoriske celler og ikke-kræft epitelceller.

Forskellige karakteristika CAF er blevet påvist i co-kultur studier eller ved genekspressionsprofilering, med primære CAF kulturer og deres normale modparter 9. På den anden side har disse undersøgelser også vist intratumoral eller inter-individuel heterogenitet CAF 10, hvoraf en del kan være tilskrives forskellige vækstfaktor signalering 11 eller transskriptionsfaktoraktivering 12. Således er det vigtigt yderligere at karakterisere heterogene CAF afledt fra cancerpatienter 13. Efter gentagne cellepassager,karakteristika primære dyrkede CAF kan ændres. Derfor ville det være bedre at karakterisere CAF på tidlige passager.

CAF bidrager til ECM deposition og ombygninger, som igen kan aktivere CAF gennem spændinger udløst cellesignalering. En sådan mechanotransduction-medieret feed-forward løkke af CAF-aktivering er blevet foreslået 14, og vores kollagengel sammentrækning model kan give indsigt i disse mekanismer. Mekanismerne af kollagen gelkontraktion omfatter celle sammentrækning, proliferation, migration, differentiering og collagenomformning 15. Detaljerede histologiske undersøgelser og forsøg med ligander, inhibitorer eller RNAi kan være nyttigt at få en mekanistisk indsigt i tumor-stromal interaktioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Sigma-Aldrich D5796
FBS GIBCO 10437
Collagen type IA Nitta gelatin Inc. CELL-1A
Reconstitution buffer Nitta gelatin Inc.
Cover slip NUNC 174934
Silicone grease Dow Corning Toray High vacuum grease
Dispase I WAKO 386-02271
6-well plate BD Falcon 353046
Cell strainer (70 μm) BD Falcon 352350

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Strell, C., Rundqvist, H., Ostman, A. Fibroblasts-a key host cell type in tumor initiation, progression, and metastasis. Ups. J. Med. Sci. 117, (2), 187-195 (2012).
  2. Augsten, M., Hägglöf, C., Peña, C., Ostman, A. A digest on the role of the tumor microenvironment in gastrointestinal cancers. Cancer Microenviron. 3, (1), 167-176 (2010).
  3. Augsten, M. Cancer-Associated Fibroblasts as Another Polarized Cell Type of the Tumor Microenvironment. Front. Oncol. 4, 62 (2014).
  4. Horie, M., et al. Characterization of human lung cancer-associated fibroblasts in three-dimensional in vitro co-culture model. Biochem. Biophys. Res. Commun. 423, (1), 158-163 (2012).
  5. Ohshima, M., et al. TGF-β signaling in gingival fibroblast-epithelial interaction. J. Dent. Res. 89, (11), 1315-1321 (2010).
  6. Ikebe, D., Wang, B., Suzuki, H., Kato, M. Suppression of keratinocyte stratification by a dominant negative JunB mutant without blocking cell proliferation. Genes Cells. 12, (2), 197-207 (2007).
  7. Orimo, A., Weinberg, R. A. Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type. Cell Cycle. 5, (15), 1597-1601 (2006).
  8. Paulsson, J., Micke, P. Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer. Semin. Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).
  9. Navab, R., et al. Prognostic gene-expression signature of carcinoma-associated fibroblasts in non-small cell lung cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 108, (17), 7160-7165 (2011).
  10. Herrera, M., et al. Functional heterogeneity of cancer-associated fibroblasts from human colon tumors shows specific prognostic gene expression signature. Clin. Cancer Res. 19, (21), 5914-5926 (2013).
  11. Hägglöf, C., et al. Stromal PDGFRbeta expression in prostate tumors and non-malignant prostate tissue predicts prostate cancer survival. PLoS One. 5, (5), e10747 (2010).
  12. Saito, R. A., et al. Forkhead box F1 regulates tumor-promoting properties of cancer-associated fibroblasts in lung cancer. Cancer Res. 70, (7), 2644-2654 (2010).
  13. Kalluri, R., Zeisberg, M. Fibroblasts in cancer. Nat. Rev. Cancer. 6, (5), 392-401 (2006).
  14. Calvo, F., et al. Mechanotransduction and YAP-dependent matrix remodelling is required for the generation and maintenance of cancer-associated fibroblasts. Nat. Cell Biol. 15, (6), 637-646 (2013).
  15. Horie, M., et al. Histamine induces human lung fibroblast-mediated collagen gel contraction via histamine H1 receptor. Exp. Lung Res. 40, (5), 222-236 (2014).
Tre-dimensionel Co-kultur Model for Tumor-stromale Interaktion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Horie, M., Saito, A., Yamaguchi, Y., Ohshima, M., Nagase, T. Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction. J. Vis. Exp. (96), e52469, doi:10.3791/52469 (2015).More

Horie, M., Saito, A., Yamaguchi, Y., Ohshima, M., Nagase, T. Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction. J. Vis. Exp. (96), e52469, doi:10.3791/52469 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter