Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

종양 기질 상호 작용에 대한 세 가지 차원의 공동 문화 모델

doi: 10.3791/52469 Published: February 2, 2015

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

참고 :이 연구는 적절한 윤리위원회에 의해 승인되었다.

인간의 폐 섬유 아 세포의 1 차 문화

  1. 폐 조직의 컬렉션 :
    1. 직접 수술 수술실에서 인간의 폐 조직 샘플을 얻습니다. 최대한 멀리 종양에서 수집 비 암성 샘플, 암성 및 비 암성 폐 조직으로부터 약 1cm 3 블록 모아서.
    2. 둘 베코 변형 이글 배지 100 단위 / ㎖ 페니실린, 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신 및 0.25 ㎍ / ml의 암포 테리 신 B (무 혈청 배지)로 보충 (DMEM)에서 샘플을 중단. 멸균 50 ㎖ 튜브에 일시 중단 된 샘플을 유지하고 실험실로 전송합니다.
      주 : 섬유 아세포는 높은 이동성이며 예컨대 상피, 내피 및 평활근 세포 등의 다른 종류의 세포에 비하여 증식. 가지 방법은 섬유 아세포의 이러한 기능을 이용하고, outgro 소요조직 섹션에서 날개 세포는 섬유 아 세포에 풍부하다. 여러 셀 통로 후, 다른 종류의 세포가 정제 된 섬유 아세포 세포 배양 결과, 생존 및 10 % 소 태아 혈청 (FBS)을 DMEM으로 전파하지 못한다. 초대 배양 세포는 다음 3-7 통로를 사용할 수있다.
  2. 세포 생장에 대한 절편 문화와 조화 :
    1. 수정 5 이전에보고 된 프로토콜을 사용하여 섬유 아세포의 차 문화를 수행합니다.
    2. 실험실에있어서, 배양 배지가없는 10cm 조직 배양 접시에 조직 샘플을 배치하고 작은 섹션으로 잘라 ~ 멸균 겸자 메스를 사용하여 크기가 2 ~ 3 mm이다. 이 과정에서 다른 세포 생장의 효율이 손상 섹션 건조하게하지 마십시오.
  3. 상피 세포층과 결합 조직의 분리 :
    1. 4 ° C에서 16 시간 동안 배양 2,000 PU / ㎖ 디스 파제 I를 포함하는 매체와 문화에 절단 된 조직 절편을 만끽 해보세요. </ 리>
    2. 접시에 조직 절편을 전송하고, 인접한 결합 조직에서 상피 세포층을 분리합니다. 미생물의 오염을 방지하기 위해 클린 벤치의 섹션을 처리.
      주 : 상피 세포의 초대 배양이 필요한 경우, 단계 130을 수행한다. 단 섬유 아세포가 고립 될 경우 후속 절편 배양 및 세포 통로 정제 된 섬유 아세포 인구를 산출 상피 세포에 대한 불리한 때문에, 1.3 단계를 생략합니다.
  4. 조직 절편의 첨부 :
    1. 두 메스를 사용하여 1mm 조각으로 조직을 말하다. 충분히 작은 조각이 아닌 경우에는 접시으로부터보다 쉽게​​ 분리하고, 세포는 접시 표면에 빨리 성장하지 못할 것이다.
    2. 각 부분을 둘러싸는 빈 영역을 유지하기 위해 서로 떨어져 작은 폐 조직 섹션을 배치. 조직 절편의 부착을 용이하게하기 위해 메스 블레이드를 사용하여 조직 배양 접시의 표면에 흠집을 확인.
      참고 : 긁는또한 세포 마이그레이션 할 수있는 함께 트랙을 제공, 세포 생장을 촉진하기 위해 나타납니다.
      1. 대안 적으로, 개별적 6- 웰 플레이트의 각 웰에 다진 조직편을 배치하고, 커버 슬립으로 그들을 커버. 실리콘 그리스를 사용하여 플레이트의 표면에 커버 슬립을 부착.
      2. 각 웰 멸균 핀을 사용하여 1.5 cm 떨어진 두 지점에서 실리콘 그리스를 놓습니다. 조직편 커버리지 여러 통로 다음 세포 생장 및 세포 증식의 효과를 향상시킨다.
  5. 이후 이식편 문화 :
    1. 샘플이 건조하면 효율적으로 세포 부산물은 대부분 손실로 조직 섹션은, 건조하기 전에 조심스럽게 접시에 배지를 추가합니다. 너무 빨리 조직 섹션은 분리하는 것처럼 매체를 붓지 마십시오.
    2. 10 % FBS와 DMEM에서 배양 세포. 추가 부력에서 분리를 촉진대로, 부동 수 있다는 너무 많은 단지 조직을 충당하기에 충분한 매체를 사용하지만요리.
  6. 셀 통로 :
    1. 배양 접시의 반복​​ 운동이 조직 절편의 이탈로 이어질 수 있으므로 항상주의 문화 매체를 처리합니다.
    2. 5-7일 37 ° C에서 인큐베이터에서 배양 접시를 놓습니다. 매일 매체를 새로 고침하고 매체 변경하는 동안 최소한의 배양 접시를 처리합니다. 섬유 아세포는 다음 몇 주 동안 조직 절편의 가장자리에서 자라다.
      주 : ~ 2-3주 후 벗어나지 아세포 거의 표면적의 양에 따라, 합류에 도달한다.
    3. 1X PBS로 세포를 씻으십시오, 그리고 나는 판에 트립신 1 ㎖를 추가합니다.
    4. 트립신 처리 한 후, 10 % FBS가 보충 된 DMEM 9 ml의 세포를 사용하여 분리. 조직 절편과 함께 10 ㎖ 튜브 내의 매질에 현탁하고 세포를 모은다. 세포 펠렛을 형성하는 원심 분리 후, 새로운 배지에서 얻어진 펠릿을 재현 탁.
    5. 새로운 막힌에 세포와 조직 섹션을 시드진짜야 요리, 어느 시점에서 조직 세포가 부착하고 성장하는 동안 요리에 연결하는 데 실패. 다음 날, 흡인에 의해 떠있는 조직 조각을 제거하고, 매체를 변경합니다. 첨부 섬유 아세포 이후 문화와 함께 전파.

인간 폐 섬유 아세포 암세포 2. 입체 공동 문화

  1. 세포 및 시약의 제조 :
    1. 약 2 × 10 5 상피 세포와 잘 당 2.5 × 10 5 섬유 아세포를 사용합니다. (3 ㎎ / ㎖, pH를 3), FBS (100 %), 재구성 완충액 (50 mM의 NaOH 등, 260 mM의 NaHCO3을 200 mM의 HEPES)가, 5X DMEM는, DMEM은 섬유 아세포 배양 용 10 % FBS가 보충 된 콜라겐 형 IA 준비 3D 및 공동 배양 배지 (1 : 암세포 섬유 아세포 배양 배지 및 배지 1 혼합물).
    2. 문화 A549 폐 선암 세포, 섬유 아세포 및 DMEM에서 A549 차원 공동 배양은 10 % FBS로 보충.
  2. 콜라겐 겔 Formation :
    1. 1X PBS와 10cm 접시에서 배양 섬유 아세포를 씻고 난 판에 트립신 1 ㎖를 추가합니다. 37 ℃에서 ~ 5 분 동안 트립신 처리 후, 10 % FBS가 보충 된 9 ㎖의 DMEM을 사용하여 세포를 분리. 10 ㎖ 튜브에 세포를 배지를 수집하고, 세포 펠렛을 형성하도록 200-300 XG에이를 원심 분리기.
    2. 5 × 105 / ml의 밀도로 100 % FBS에서 얻어진 펠렛을 재현 탁.
    3. 얼음에 콜라겐 젤을 준비합니다. 다음 절차에 앞서 냉장고 시약 피펫 및 튜브 쿨. 심지어 얼음에, 혼합물을 어느 정도 고화하고, 총 부피는 모든 성분의 합보다 작다.
    4. 각 웰에서, FBS에서 섬유 아세포 서스펜션 (2.5 × 10 5 세포)의 0.5 ml의 2.3 ml의 유형 IA 콜라겐, 670 ㎕의 5 배 DMEM, 330 ㎕를 재구성 버퍼를 혼합하여 콜라겐 젤을 준비합니다. 젤은 실온에서 쉽게 설정할 수 있습니다.
      1. 적극적으로 균질 마일을 보장하기 위해 피펫xture. 피펫 팅 과정에서 거품을 만들지 마십시오.
    5. 6- 웰 플레이트의 각 웰에 혼합물 (3 ㎖)를 첨가하고, 30-60 분 동안 방해없이 37 ℃ 배양기에서 허용 아교질로 만들다.
  3. 콜라겐 겔 암 세포 배양 :
    1. 6 수정을 이전에보고 된 프로토콜을 사용하여 입체 공동 문화를 수행합니다.
    2. 1 × 105 / ㎖의 밀도로 3D 공동 - 배양 배지 (또는 A549 세포의 경우에는 10 % FBS를 가진 DMEM)에 재현 탁 암세포.
    3. 각 겔의 표면에 재현 탁 된 세포 용액 (2 × 105 세포) 2 ㎖를 붓는다. 실험 조건에 따라 공동 배양 암 세포 또는 섬유 아세포의 세포 수를 수정한다.
  4. 젤의 수축 :
    1. 암 세포는 콜라겐 겔에 부착 할 수 있도록 37 ℃에서 밤새 인큐베이션 젤. 각 젤을 분리하고 O를 잘 각각 '부동 문화'를 생성6 잘 판 바.
      주 : 부유 배양을 사용하여 겔 크기에 다양한 변경이 공 배양 암세포와 섬유 아세포 세포 간의 상호 작용에 의해 매개되는 기계적 장력 및 콜라겐 분해에 의해 발생된다.
    2. 우물의 가장자리에서 각 젤을 분리 각도 21 G 바늘이나 작은 주걱을 사용합니다. 2-3 일마다이 3D 공동 배양 배지 2 ㎖로 웰을 새로. 5 일간 매일 각 겔의 크기를 측정한다.
  5. 콜라겐 젤의 분석 :
    1. 이러한 분석 Sircol 콜라겐 정량 방법을 사용하여 각각의 콜라겐 겔 함량을 측정. 젤 5에서 RNA를 수집 한 후 transcriptomic 분석 또는 정량 RT-PCR을 수행합니다.

3. 공기 - 액체 인터페이스 문화 침략 분석

  1. 오일, 37 ° C에서 콜라겐 젤을 배양 한 후, 새로운 6-에 메쉬 (70 ㎛의 공극 크기)을 배치하여 공기 수축 겔을 노출잘 접시. 유동 세포 계측법에 사용되는 시판 셀 스트레이너의 메쉬를 확인합니다.
  2. 부드럽게 3D 공동 배양 배지 11 ml로 각각의 웰을 채운다.
  3. 멸균 스푼을 사용하여 메쉬에 젤을 놓고 젤에 남아있는 모든 매체를 제거합니다. 공기가 겔의 상부 표면을 노출 동안이 상태에서, 중간 젤에서 잠수함. 공기 - 액체 인터페이스 등이 문화 조건을 정의합니다.
    주 : 인큐베이터에서 37 ℃에서 공기 - 액체 계면을 유지 배양 5-7 일 후, 경부암 세포 겔로 이동한다. 세포 유형 및 셀룰러 상호 작용의 결과로서 따라, 암세포에서 세포의 형태 학적 변화의 가변 정도는 공기 - 액체 계면 배양에 의해 유도된다.
  4. 조직 학적 평가를 위해 실온에서 밤새 포르말린 용액에서 겔을 고정하고 파라핀에 포함. 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E)와 수직 섹션 (4 μm의) 얼룩​​. 면역 조직 화학 분석 O를 수행n은 섹션 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

이 공동 배양법, 종양 미세 환경을 흉내 낸 콜라겐 젤에 포함 된 암 세포와 섬유 아세포와의 상호 작용을 연구하기위한 유용한 도구이다. 콜라겐 겔 수축, 암세포의 침윤 및 형태 변화 : 이전의 연구에서, 세 개의 파라미터가이 실험 모델에서 평가 하였다. 암 세포의 증식은 또한 면역 염색 Ki67 4를 이용하여 추정 하였다. 폐 조직 샘플을 절제 폐 로브 (도 1A)의 암 및 암이 아닌 부분에서 수집 하였다. 샘플을 잘게 다진시키고 DMEM에서 배양은 10 % FBS (도 1b)로 보충. 조직 절편의 섬유 아세포 성장 현미경 (도 1C)으로 관찰 하였다. 일차 배양 된 폐 섬유 아세포의 콜라겐 겔에 포함되었다 (도 2a, a) 및 A549 폐암 세포 겔상에서 공 배양 하였다 (도 2A, B). 부동 C 후배지 ulture (도 2A는, c), 겔, 공기 - 액체 계면의 조건 하에서 더 배양 하였다 (도 2A, d). 겔을 포르말린에 고정하고 면역 조직 화학 분석 (도 2A, E)를 사용 하였다. 공기 - 액체 계면 문화, 겔 6- 웰 플레이트의 웰 (도 2B)에 격자 위에 놓는다. 겔의 조직 학적 분석은 폐암 관련 섬유 아세포 (그림 3)에 포함 된 콜라겐 겔에 A549 세포의 침략을 밝혔다.

그림 1
그림 1 : 외과 적 절제 인간의 폐 조직에서 섬유 아세포의 파생물. (A) 샘플 절제된 폐 로브 암 및 암이 아닌 부분에서 수집 하였다. (B) 시료를 작은 조각으로 잘게 썰어서 10 % FBS가 보충 된 DMEM에서 배양 하였다.(C) 섬유 아 세포는 조직 섹션 (화살표)에서 성장했다. 세포가 배양 접시에 메스 블레이드에 의해 만들어진 긁힌 자국을 따라 마이그레이션합니다. 스케일 바, 200 μm의.

그림 2
도 2 :. 콜라겐 겔 기액 인터페이스 배양 A549 세포는 섬유 아세포 매립 콜라겐 겔상에서 공동 배양하고, A549 세포의 층이 중간에 격자 상 겔을 배치하여 공기에 노출된다 (A. ) 공 배양 및 공기 - 액체 계면 입체의 실험 절차. (a) 콜라겐 겔 폐 섬유 아세포 매립. (b) 콜라겐 겔상에서 공 배양 A549 세포. (c) 부동 배양. (d) 공기 - 액체 계면 (ALI). 포르말린 겔 (E) 고정술. (B) 번째의 대표 화면6- 웰 플레이트의 웰에 배치 메쉬 E 겔. O / N : 하룻밤.

그림 3
도 3은 Hematoxylin A549 세포 및 인간 폐 섬유 아세포 이루어지는 삼차원 배양 겔의 횡단면 에오신 염색. 콜라겐 겔 해당 A549 세포 배양 주 섬유 아세포 (화살표)으로 매립 겔 침입. 스케일 바, 200 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

CAFS 암세포 주변 ECM의 주요 구성 요소를 형성하고, 종양 만 골격을 제공 할뿐만 아니라 적극적으로 종양 발생에 관여하지 7. 축적 된 증거 CAF 매개 종양 진행 (8)의 중요한 역할을 강조 최종 예후에 CAFS 또는 관련 분자의 영향을 풀어 낸다.

이전 연구에서는 폐 CAFS (4)를 분리하는 가지 방법을 사용. 이 실험에서는, 접시 표면에 조직 절편 밀착성의 유지가 매우 중요하다. 세포 배양 배지에 떠있는 조직 절편으로부터 이주 할 수없는 한 조직 절편 표면으로부터 분리되고 나면, 더 이상 같은 배양 접시에 세포의 생장에 사용될 수 없다. 조직의 절단은 접시 표면에 부착하기위한 접착제 역할을 삼출물을 얻을 수 있습니다. 커버 슬립으로 조직 절편을 고정 할 때 사용되는 그리스의 양도이다 critiCAL. 그리스 소량의 그리스가 과도한 세포 배양 영역을 가리는 반면, 부착 된 커버 슬립을 유지하지 못한다. 커버 슬립 및 적절한 압력을 사용하여 조직 섹션의 첨부 파일은 또한 세포 생장을 촉진하는 열쇠입니다.

암세포 증식 및 내습 실험 모델은 주로 이차원 단층 또는 조직 배양 된 Boyden 챔버 분석에 의존 해왔다. 더 간 통신 및 암세포의 동작 ECM 의존 변조를 이해하기 위해서는, 입체 공동 배양 강력한 도구이다. 그들은 높은 기술 능력이 필요하고 실험 조건이 제한되어 있지만의 Organotypic 문화도 다세포 상호 작용을 조사하는 데 유용합니다.

더불어 문화 모델은 종양 미세 환경을 흉내 낸 조건 하에서 종양 간질 상호 작용을 평가하는 플랫폼 역할. 특정 유전자의 과발현 또는 최저와 세포는 우리의 cultu에 쉽게 적용 할 수있다의 Organotypic 문화를 통해 장점 인 시스템, 다시. 특히, 우리의 이전 관측은 공동 배양 된 섬유 아세포가 적극적으로 암 세포 분화 및 침략 사를 조절하는 것이 좋습니다. 이는 내피 세포, 염증성 세포 및 비 - 암성 상피 세포로서의 실험 환경에서 상호 작용을 가능 다세포 테스트가 관심을 가질 것이다.

CAFS의 고유 특성은 일차 배양 CAF 및 정상 대조 구를 사용하는 공동 배양 연구 나 유전자 발현 프로파일 링에 의해 입증되었다. 한편, 이러한 연구는 또한 11 또는 전사 인자의 활성화 신호 (12) 성장 인자의 상이한 레벨에 기인 할 수있는 CAFS 부 (10)의 인트라 즉 종양 또는 개인간 얼룩이 보였다. 따라서, 상기 암 환자 (13)로부터 유래 된 이종 CAFS를 특성화하는 것이 필수적이다. 반복 세포 통로를 따라,차 배양 CAFS의 특성은 변경 될 수있다. 따라서 초기 구절에서 CAFS의 특성을 더 잘 될 것입니다.

CAFS 차례로, 긴장​​ 트리거 세포 신호를 통해 CAFS를 활성화시킬 수있다 ECM 증착 및 리모델링에 기여한다. CAF 활성화의 이러한 mechanotransduction의 매개 피드 - 포워드 루프 (14)을 제안하고 있으며, 우리의 콜라겐 젤의 수축 모델은 이러한 메커니즘에 대한 통찰력을 제공 할 수있다. 콜라겐 젤의 수축의 메커니즘은 세포의 수축, 증식, 이동, 분화, 콜라겐 리모델링 (15)를 포함한다. 리간드를 사용하여 세부 조직 학적 연구와 실험은, 억제제, 또는 RNAi의 종양 - 기질 상호 작용에 기계적인 통찰력을 얻을하는 데 도움이 될 수 있습니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Sigma-Aldrich D5796
FBS GIBCO 10437
Collagen type IA Nitta gelatin Inc. CELL-1A
Reconstitution buffer Nitta gelatin Inc.
Cover slip NUNC 174934
Silicone grease Dow Corning Toray High vacuum grease
Dispase I WAKO 386-02271
6-well plate BD Falcon 353046
Cell strainer (70 μm) BD Falcon 352350

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Strell, C., Rundqvist, H., Ostman, A. Fibroblasts-a key host cell type in tumor initiation, progression, and metastasis. Ups. J. Med. Sci. 117, (2), 187-195 (2012).
  2. Augsten, M., Hägglöf, C., Peña, C., Ostman, A. A digest on the role of the tumor microenvironment in gastrointestinal cancers. Cancer Microenviron. 3, (1), 167-176 (2010).
  3. Augsten, M. Cancer-Associated Fibroblasts as Another Polarized Cell Type of the Tumor Microenvironment. Front. Oncol. 4, 62 (2014).
  4. Horie, M., et al. Characterization of human lung cancer-associated fibroblasts in three-dimensional in vitro co-culture model. Biochem. Biophys. Res. Commun. 423, (1), 158-163 (2012).
  5. Ohshima, M., et al. TGF-β signaling in gingival fibroblast-epithelial interaction. J. Dent. Res. 89, (11), 1315-1321 (2010).
  6. Ikebe, D., Wang, B., Suzuki, H., Kato, M. Suppression of keratinocyte stratification by a dominant negative JunB mutant without blocking cell proliferation. Genes Cells. 12, (2), 197-207 (2007).
  7. Orimo, A., Weinberg, R. A. Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type. Cell Cycle. 5, (15), 1597-1601 (2006).
  8. Paulsson, J., Micke, P. Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer. Semin. Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).
  9. Navab, R., et al. Prognostic gene-expression signature of carcinoma-associated fibroblasts in non-small cell lung cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 108, (17), 7160-7165 (2011).
  10. Herrera, M., et al. Functional heterogeneity of cancer-associated fibroblasts from human colon tumors shows specific prognostic gene expression signature. Clin. Cancer Res. 19, (21), 5914-5926 (2013).
  11. Hägglöf, C., et al. Stromal PDGFRbeta expression in prostate tumors and non-malignant prostate tissue predicts prostate cancer survival. PLoS One. 5, (5), e10747 (2010).
  12. Saito, R. A., et al. Forkhead box F1 regulates tumor-promoting properties of cancer-associated fibroblasts in lung cancer. Cancer Res. 70, (7), 2644-2654 (2010).
  13. Kalluri, R., Zeisberg, M. Fibroblasts in cancer. Nat. Rev. Cancer. 6, (5), 392-401 (2006).
  14. Calvo, F., et al. Mechanotransduction and YAP-dependent matrix remodelling is required for the generation and maintenance of cancer-associated fibroblasts. Nat. Cell Biol. 15, (6), 637-646 (2013).
  15. Horie, M., et al. Histamine induces human lung fibroblast-mediated collagen gel contraction via histamine H1 receptor. Exp. Lung Res. 40, (5), 222-236 (2014).
종양 기질 상호 작용에 대한 세 가지 차원의 공동 문화 모델
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Horie, M., Saito, A., Yamaguchi, Y., Ohshima, M., Nagase, T. Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction. J. Vis. Exp. (96), e52469, doi:10.3791/52469 (2015).More

Horie, M., Saito, A., Yamaguchi, Y., Ohshima, M., Nagase, T. Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction. J. Vis. Exp. (96), e52469, doi:10.3791/52469 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter