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Developmental Biology

चिकजीएफपी न्यूरल ट्यूब ग्राफ्टिंग और कार्बोसाइन डाई डीआईआई इंजेक्शन का उपयोग करके चिकन भ्रूण के भीतर तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं और रक्त वाहिकाओं की दोहरी लेबलिंग

Published: May 28, 2015 doi: 10.3791/52514
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3
1Birth Defects Research Centre, UCL Institute of Child Health, 2Blizard Institute, Centre for Digestive Diseases, Queen Mary University of London, Barts and The London School of Medicine and Dentistry, 3Department of Clinical Genetics, Erasmus University Medical Center, Rotterdam

Summary

यहां हम तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं और रक्त वाहिकाओं की दोहरी लेबलिंग की रिपोर्ट करते हैं जो चिकजीएफपी न्यूरल ट्यूब इंट्राप्रपीज का उपयोग करके इंट्रा-वैस्कुलर डीआईआई इंजेक्शन के साथ संयुक्त रूप से ग्राफ्टिंग करते हैं। यह प्रयोगात्मक तकनीक हमें ऑर्गेनोजेनेसिस के दौरान एनसीसी-व्युत्पन्न (आंत्र) तंत्रिका तंत्र और संवहनी प्रणाली के विकास की कल्पना और अध्ययन करने की अनुमति देती है।

Abstract

सभी विकासशील अंगों को तंत्रिका तंत्र (संवेदी और मोटर नियंत्रण के लिए) के साथ-साथ संवहनी प्रणाली (गैस विनिमय, तरल पदार्थ और पोषक तत्वों की आपूर्ति के लिए) दोनों से जोड़ा जाना चाहिए। नतीजतन तंत्रिका और संवहनी दोनों प्रणालियां एक दूसरे के साथ विकसित होती हैं और अपने ब्रांचिंग आर्किटेक्चर में हड़ताली समानताएं साझा करती हैं। यहां हम भ्रूणीय जोड़तोड़ की रिपोर्ट करते हैं जो हमें तंत्रिका क्रेस्ट-व्युत्पन्न तंत्रिका ऊतक (इस मामले में आंत्र तंत्रिका तंत्र), और संवहनी प्रणाली के एक साथ विकास का अध्ययन करने की अनुमति देते हैं। यह तंत्रिका ट्यूब के असतत खंडों के प्रत्यारोपण के माध्यम से चिकन कल्पना पैदा करके हासिल किया जाता है, और संबद्ध तंत्रिका शिखा, एक ही भ्रूण में संवहनी DiI इंजेक्शन के साथ संयुक्त। हमारी विधि इंट्रास्पेस ग्राफ्टिंग के लिए ट्रांसजेनिक चिकजीएफपी भ्रूण का उपयोग करती है, जिससे प्रत्यारोपण तकनीक 1 9 70 के दशक के बाद से महान प्रभाव के साथ उपयोग किए जाने वाले शास्त्रीय बटेर-चिक इंटरप्रीपीज़ ग्राफ्टिंग प्रोटोकॉल की तुलना में अधिक शक्तिशाली हो गई है। चिकजीएफपी-चिकइंट्रास्पेसेज ग्राफ्टिंग प्रत्यारोपित कोशिकाओं और अक्षुण्ण ऊतकों में उनके अनुमानों की इमेजिंग की सुविधा प्रदान करता है, और प्रजातियों के मतभेदों से जुड़े सेल विकास में किसी भी संभावित पूर्वाग्रह को समाप्त करता है। यह विधि एंटिक तंत्रिका तंत्र और संवहनी प्रणाली के सह-विकास का अध्ययन करने के लिए एवियन भ्रूण (अन्य कशेरुकी भ्रूण की तुलना में) की पहुंच में आसानी का पूरा लाभ उठाती है।

Introduction

चिकन भ्रूण कशेरुकी विकासात्मक जीव विज्ञान में एक अमूल्य मॉडल जीव है, कम नहीं है क्योंकि ओवो में इसका विकास प्रयोगात्मक जोड़तोड़ की अनुमति देता है जो अन्यथा गर्भाशयमें विकसित कशेरुकी में प्रदर्शन करना असंभव है। इस पहुंच और जोड़तोड़ की आसानी के कारण चिक भ्रूण विकासात्मक जीव विज्ञान के क्षेत्र में कई मौलिक खोजों में महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहा है । सबसे शक्तिशाली तकनीकों में से कोशिका भाग्य का अध्ययन करने के लिए बटेर-चिक चिमरिक भ्रूण का उपयोग किया गया है, 1 9 70 के1-3में प्रोफेसर निकोल ले Douarin द्वारा बीड़ा उठाया एक विधि। विशेष रूप से, बटेर-चिक कल्पना आनुवंशिक रूप से चिह्नित करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी रही है और प्रारंभिक विकास के दौरान अत्यधिक प्रवासी तंत्रिका क्रेस्ट सेल (एनसीसी) आबादी का पालन करती है। एनसीसी प्रवासी कोशिकाओं की एक बहुपसेंट आबादी है, जो तंत्रिका ट्यूब के हाशिए पर पृष्ठीय ectoderm में उत्पन्न होती है, जो कशेरुकी भ्रूण में कोशिका प्रकारों की एक विस्तृत श्रृंखला को जन्म देती है। इनमें क्रैनियोफेशियल संरचनाएं (उपास्थि, हड्डी, मांसपेशियां), न्यूरॉन्स और ग्लिया (संवेदी और स्वायत्त तंत्रिका तंत्र में), मेलानोसाइट्स, और एंडोक्राइन सिस्टम2,4,5की कोशिकाओं की एक उपजनसंख्या शामिल हैं। एनसीसी भाग्य को प्रभावित करने वाले सबसे महत्वपूर्ण कारकों में से एक तंत्रिका ट्यूब के पूर्वकाल-पीछे धुरी के साथ उनका प्रारंभिक स्थान है। उदाहरण के लिए, आंत्र एनसीसी, जो आंत्र तंत्रिका तंत्र (ईएनएस) के न्यूरॉन्स और ग्लिया को जन्म देता है, दो असतत उप-आबादी से उत्पन्न होता है: पहला वागल (कौडल हिंडब्रेन) क्षेत्र में स्थित है, और दूसरा तंत्रिका ट्यूब6-13के पवित्र क्षेत्र में। तंत्रिका ट्यूब के संबंधित क्षेत्रों की अंतर या अंतर-प्रजातियों की ग्राफ्टिंग इन कोशिकाओं को स्थायी रूप से लेबल करने के लिए पसंद की तकनीक रही है और बाद में तंत्रिका ट्यूब के हाशिए पर उनके जन्म से, पाचन तंत्र6,7,10के भीतर अपने अंतिम गंतव्यों के लिए ट्रैकिंग की अनुमति देती है।

अन्य पशु मॉडलों की तुलना में लड़की में प्रदर्शन करना आसान एक और भ्रूणीय हेरफेर, संवहनी प्रणाली की महत्वपूर्ण लेबलिंग है। दरअसल, के रूप में लड़की भ्रूण विकसित करता है, यह एक अतिरिक्त भ्रूण संवहनी नेटवर्क है कि जर्दी से ऑक्सीजन और पोषक तत्वों को परिचालित के शीर्ष पर देता है । जर्दी की सतह पर स्थित इस सुलभ संवहनी नेटवर्क का उपयोग ऑर्गेनोजेनेसिस12,14-17के दौरान भ्रूण के विकासशील संवहनी प्रणाली को लेबल करने के लिए एक प्रवेश द्वार के रूप में किया जा सकता है। लिपोफिलिक डाई डीआईआई जैसे विभिन्न रंगों का इंट्रावैस्कुलर इंजेक्शन नवजात संवहनी नेटवर्क के सभी चमकीले जहाजों को चित्रित/दाग देना संभव बनाता है ।

क्योंकि विकासशील अंगों को तंत्रिका तंत्र (संवेदी और मोटर नियंत्रण के लिए) के साथ-साथ संवहनी प्रणाली (गैस विनिमय, तरल पदार्थ और पोषक तत्वों की आपूर्ति के लिए) दोनों से जुड़ा होना चाहिए, दोनों नेटवर्क एक दूसरे के साथ विकसित होते हैं और अपने ब्रांचिंग आर्किटेक्चर18-20में हड़ताली समानताएं साझा करते हैं। यहां हम भ्रूणीय जोड़तोड़ की रिपोर्ट करते हैं जो हमें ऑर्गेनोजेनेसिस के दौरान संवहनी प्रणाली के साथ-साथ एनसीसी-व्युत्पन्न ईएनएस के एक साथ विकास का अध्ययन करने की अनुमति देते हैं । यह तंत्रिका ट्यूब के असतत खंडों के प्रत्यारोपण के माध्यम से चिकन कल्पना पैदा करके हासिल किया जाता है, जिसमें तंत्रिका शिखा भी शामिल है, जो संवहनी DiI इंजेक्शन के साथ संयुक्त है। बटेर-चिकन कल्पनाओं से एक अग्रिम के रूप में, हमारी विधि इंट्राप्रजाति ग्राफ्टिंग के लिए ट्रांसजेनिक जीएफपी चिक भ्रूण का उपयोग करती है, इमेजिंग कोशिकाओं और उनके अनुमानों के संदर्भ में प्रत्यारोपण तकनीक को अधिक शक्तिशाली बना रही है, और प्रजातियों के मतभेदों से जुड़े किसी भी संभावित पूर्वाग्रह को नष्ट करती है।

Protocol

1. तंत्रिका ट्यूब Ablations के लिए माइक्रो स्केलपेल की तैयारी

  1. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्टील सिलाई सुई से माइक्रो-स्केलपेल को आकार दें।
    1. सबसे पहले एक पीसने एक शक्ति बेंच चक्की पर घुड़सवार पहिया का उपयोग कर दोनों पक्षों पर सुई समतल ।
    2. सुई के दोनों किनारों पर वैकल्पिक दिशाओं में, एक नियंत्रित परिपत्र गति का उपयोग करके एक मोटे ग्रेड अर्कांसस पत्थर पर सबसे पहले स्केलपेल को आकार देना शुरू करें।
    3. एक अच्छी तरह से परिभाषित अत्याधुनिक(चित्रा 1A, बी)के साथ, एक अल्ट्रा फाइन माइक्रो-स्केलपेल को आकार देने के लिए एक अतिरिक्त ठीक ग्रेड अर्कांसस पत्थर पर एक ही शार्पनिंग आंदोलनों को जारी रखें।
      नोट: माइक्रो-स्केलपेल के विकल्प इलेक्ट्रोलिटिक रूप से तेज सुई, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध टंगस्टन सुई, या खींचे गए ग्लास सुई हो सकते हैं।

2. वांछित चरण के लिए जंगली प्रकार और GFP अंडे इनक्यूबेट

  1. इनक्यूबेशन से पहले 14 -15 डिग्री सेल्सियस पर एक ठंडा इनक्यूबेटर में निषेचित चिकन अंडे और ट्रांसजेनिक जीएफपी चिकन अंडे स्टोर करें क्योंकि इस तापमान पर विकास रुका हुआ है। अंडे को कुछ दिनों के लिए, एक सप्ताह तक स्टोर करें।
  2. विकास शुरू करने के लिए, एक ट्रे पर जंगली प्रकार और जीएफपी अंडे क्षैतिज रूप से रखें और एक आर्द्रीकृत (58 - 60%) 37.5 ºC पर इनक्यूबेटर, ताकि भ्रूण तंत्रिका ट्यूब ग्राफ्टिंग के लिए मिलान चरणों में हों।
  3. वगल तंत्रिका ट्यूब ग्राफ्टिंग करने के लिए विकास के 10 -12 सोलाइट चरण में भ्रूण प्राप्त करने के लिए, 1.5 दिनों (33 - 38 बजे) के लिए अंडे को इनक्यूबेट करना और हैम्बर्गर और हैमिल्टन21के विकास तालिकाओं के अनुसार चरण भ्रूण।

3. विंडोइंग और ग्राफ्टिंग के लिए अंडे तैयार करें

  1. एक समय में एक अंडे को खिड़की के लिए कस्टम-निर्मित अंडा धारक के पास ले जाएं। अंडे के नुकीले सिरे की ऊपरी सतह पर सीधे कैंची के साथ बार-बार दोहन करके अंडे के खोल में एक छोटा छेद बनाएं।
  2. 181/2 जी हाइपोडर्मिक सुई और 5 मिलीलीटर सिरिंज के साथ अंडे से 2 - 3 मिलीलीटर एल्बुमिन निकालें। एल्बुमिन को हटाने से अंडे के भीतर जर्दी कम हो जाता है और भ्रूण को कोई नुकसान पहुंचाए बिना बाद में खिड़की की सुविधा होती है।
    1. एल्बुमिन को छोड़ दें। ठीक कैंची के साथ आकार के लिए कटौती स्पष्ट टेप की एक छोटी पट्टी के साथ छेद सील।
  3. घुमावदार कैंची का उपयोग करके, अंडे के खोल की ऊपरी सतह में एक और छेद टैप करें। छेद में कैंची की नोक डालें और, बेंच के समानांतर कैंची रखते हुए, खोल के शीर्ष पर ~ 2 सेमी व्यास की खिड़की को काटने के लिए एक परिपत्र प्रस्ताव में काम करें।
    1. कैंची को स्थिर स्थिति में रखें और अंडा घुमाएं। अंडे के खोल की हटाई गई डिस्क को छोड़ दें। E1.5 पर, भ्रूण जर्दी के शीर्ष पर एक गहरे पीले रंग की डिस्क के रूप में पहचानने योग्य है।
    2. चिमटी का उपयोग कर अंडे के भीतर गिर गया है कि किसी भी खोल मलबे को हटा दें। किसी भी अनिषेचित अंडे को त्यागें (अन्यथा हल्के पीले जर्दी पर शीर्ष पर एक छोटे सफेद स्थान द्वारा पहचाना जाता है)।

4. ग्राफ्टेड ऊतक प्राप्त करने के लिए मेजबान भ्रूण तैयार करें

  1. स्टीरियो-माइक्रोस्कोप को आंखों के स्तर पर समायोजित करें और प्रतिबिंब पैदा किए बिना भ्रूण को पर्याप्त रूप से रोशन करने के लिए हंसनेक प्रकाश स्रोत के अभिविन्यास को अनुकूलित करें।
  2. भ्रूण को उचितकल्पना करने के लिए, एक मुंह की ट्यूब और एक खींचा ग्लास माइक्रो-पिपेट(चित्रा 1C, Oii)का उपयोग करके गहरे पीले रंग की डिस्क के केंद्र में भारतीय स्याही की एक छोटी मात्रा इंजेक्ट करें।
    1. 100 माइक्रोग्राम/एमएल अंतिम एकाग्रता पर पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त पीबीएस के साथ स्याही 50:50 तैयार करें। ब्लास्टोडर्म की परिधि के बाहर जर्दी झिल्ली के माध्यम से माइक्रो-पिपेट डालें फिर ध्यान से भ्रूण के नीचे सीधे अपनी नोक को कोण करें।
    2. मुंह की नली पर उड़ाकर भ्रूण के नीचे स्याही पहुंचाएं। यदि मुंह में पाइपिंग की अनुमति नहीं है, तो इसके बजाय 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करें। भ्रूण के नीचे किसी भी हवा के बुलबुले पेश न करें, जिससे प्रदूषण हो सकता है, फिर ध्यान से ग्लास माइक्रो-पिपेट को हटा दें। यह एक नाजुक कदम है जो अगर सटीकता के साथ नहीं किया जाता है तो भ्रूण की मौत का कारण बन सकता है।
  3. हैम्बर्गर और हैमिल्टन21 के संदर्भ में भ्रूण मंच और एक प्रयोगशाला पुस्तक में मंच रिकॉर्ड ।
  4. एक सुई धारक पर घुड़सवार एक कस्टम मेड माइक्रो-स्केलपेल (या एक ठीक टंगस्टन सुई) का उपयोग करना, उस क्षेत्र के बगल में, विटेललाइन झिल्ली में एक बहुत छोटा गहरा घाव बनाता है जहां माइक्रो-सर्जरी की जाएगी।
    1. भ्रूण और झिल्ली के बीच जगह बनाने के लिए झिल्ली के आंसू (ग्लास माइक्रो-पिपेट और मुंह ट्यूब का उपयोग करके) पर पीबीएस की 2 - 3 बूंदें सावधानीपूर्वक लागू करें। पूरे क्षेत्र को बेनकाब करने के लिए झिल्ली में एक बड़ी खिड़की काटें जहां माइक्रो-सर्जरी होगी।
  5. माइक्रो-स्केलपेल का उपयोग करके ब्याज के तंत्रिका ट्यूब क्षेत्र को हटा दें, पूरे पृष्ठीय तंत्रिका ट्यूब (वीडियो में सोमाइट 1 से 7 के स्तर पर) में रोस्ट्रल और कौडल ट्रांसवर्स चीरों से शुरू होता है।
    1. न्यूरल ट्यूब और सोमाइट्स के बीच द्विपक्षीय रूप से कटौती करें ताकि तंत्रिका ट्यूब को आसपास के ऊतकों से अलग किया जा सके, बिना सोमाइट्स को नुकसान पहुंचाए।
    2. बहुत धीरे से अंतर्निहित नोटोकॉर्ड से तंत्रिका ट्यूब को अलग करें, जो बरकरार रहना चाहिए। ध्यान दें कि सफल तंत्रिका ट्यूब उत्तेजना सभी आसपास के ऊतकों को पूरी तरह से बरकरार छोड़देगी (चित्रा 2)।
    3. उत्पादित तंत्रिका ट्यूब को ग्लास माइक्रो-पिपेट में हटा दें, फिर त्यागें।
  6. एक प्रयोगशाला पुस्तक में तंत्रिका ट्यूब ablation के स्तर को रिकॉर्ड करें। मेजबान भ्रूण अब दाता तंत्रिका ट्यूब प्राप्त करने के लिए तैयार है ।

5. दाता भ्रष्टाचार ऊतक तैयार

  1. फिटसी फिल्टर के साथ फ्लोरोसेंट स्टीरियो-माइक्रोस्कोप के नीचे देखकर एक खिड़की, स्टेज-मिलान जीएफपी भ्रूण का चयन करें। जीएफपी फ्लोरेसेंस से सोमाइट्स की कल्पना करना और भ्रूण को स्टेज करना बहुत आसान हो जाता है ।
  2. एक बार एक मंच मिलान भ्रूण की पहचान की गई है, 4 चीरों बनाकर अंडे से भ्रूण को हटा दें, Pascheff-Wolff वसंत कैंची के साथ(चित्रा 1C, एल)भ्रूण के चारों ओर एक आयत आकार में तो धीरे से यह एक भ्रूण चम्मच के साथ उठाओ ।
  3. भ्रूण को एक वर्ग घड़ी ग्लास में एक सिलगार्ड बहुलक आधार के साथ रखें। किसी भी संलग्न जर्दी को हटाने के लिए डुमोंट #5 चिमटी के साथ भ्रूण को धीरे से हिलाएं। विटेललाइन झिल्ली निकालें और स्टेनलेस मिन्यूटियन पिन(चित्रा 1C)का उपयोग करके पॉलीमर बेस पर भ्रूण को पिन करें।
  4. वसंत कैंची का उपयोग करना, तंत्रिका ट्यूब और आसपास के somites के आसपास एक आयताकार आकार में 4 चीरों बनाने के लिए, एक ही क्षेत्र है कि मेजबान भ्रूण से हटा दिया गया है में ।
  5. एक प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करना, दाता GFP भ्रूण से तंत्रिका ट्यूब और सोमाइट ऊतकों को पेन/स्ट्रीप पीबीएस में ०.२% अग्नाशय युक्त घड़ी ग्लास में स्थानांतरित करें ।
  6. ऊतकों को अलग करने में मदद करने के लिए आरटी में 10 मिनट के लिए आगे बढ़ने के लिए एंजाइमेटिक पाचन की अनुमति दें। एंजाइम में इनक्यूबेशन के बाद, सभी आसन्न ऊतकों से तंत्रिका ट्यूब को मैन्युअल रूप से अलग करने के लिए एक हैंडल पर चढ़कर स्टेनलेस मिन्यूटिएन पिन का उपयोग करें।
  7. एक ग्लास माइक्रो-पिपेट का उपयोग करके, बर्फ पर डीएमईएम + 10% सीरम(जैसेबकरी, घोड़ा या भ्रूण बछड़े) वाले एक और घड़ी ग्लास में अलग तंत्रिका ट्यूब को स्थानांतरित करें, ताकि अतिरिक्त अग्नाशय को कुल्ला किया जा सके और एंजाइमेटिक पाचन को रोका जा सके। 5 मिनट के बाद, विच्छेदित तंत्रिका ट्यूब को ऑर्थोटोपिक रूप से लड़की मेजबान(चित्रा 2 और S1)में ग्राफ्ट करने के लिए तैयार है।

6. ऊतक भ्रष्टाचार

  1. ग्लास माइक्रो-पिपेट का उपयोग करके, सावधानी से विच्छेदित तंत्रिका ट्यूब को घड़ी ग्लास से मेजबान भ्रूण में स्थानांतरित करें। तंत्रिका ट्यूब को सही पूर्वकाल-पीछे अभिविन्यास में रखें और माइक्रो-स्केलपेल का उपयोग करके चिक होस्ट के उत्पादित क्षेत्र से सटे एक्सप्लांट को धीरे-धीरे पुश करें। न्यूरल ट्यूब के अभिविन्यास की पहचान करने के लिए एक छोटे से निक को काटकर, या एक छोटे से निक को काटकर, से जुड़े ectoderm का एक छोटा सा टुकड़ा छोड़ दें।
    1. यदि आवश्यक हो, तो उत्पादित क्षेत्र के सटीक आकार के लिए एक्सप्लांट को ट्रिम करने के लिए माइक्रो-स्केलपेल का उपयोग करें।
  2. धीरे-धीरे तंत्रिका ट्यूब को एब्लेटेड क्षेत्र में मार्गदर्शन करें और इसे ऐसी स्थिति में रखें कि पृष्ठीय पक्ष सही ढंग से केंद्रित हो। एक गिलास माइक्रो-पिपेट का उपयोग करें, एक मुंह ट्यूब के लिए घुड़सवार, PBS और/या भ्रष्टाचार के आसपास तरल पदार्थ को दूर करने के लिए । यह दाता और मेजबान ऊतकों का पालन करने के लिए और भ्रष्टाचार की स्थापना करने में मदद करता है ।
  3. निर्जलीकरण और प्रदूषण को रोकने के लिए 24 मिमी चौड़े स्पष्ट टेप के साथ पूरी खिड़की को सील करें।
  4. अंडे केशेल पर पेंसिल से मार्किंग करके चिमरिक भ्रूण को लेबल करें और लैब बुक में उसका नंबर रिकॉर्ड करें । आगे के विकास के लिए अंडा इनक्यूबेटर को वापस करें।

7. मेजबान भ्रूण के रक्त वाहिकाओं में DiI सुई

  1. वांछित प्रायोगिक समय बिंदु पर (यहां, 3 -10 दिन बाद), इनक्यूबेटर से चिमरिक भ्रूण को पुनः प्राप्त करें और अंडे के भीतर भ्रूण तक पहुंच प्राप्त करने के लिए सीधे कैंची का उपयोग करके स्पष्ट टेप को हटा दें।
  2. यदि आवश्यक हो, तो कैंची का उपयोग करके खोल में खिड़की को बड़ा करें। यदि यह खोल से जुड़ा हुआ है, तो कोरियोलाएंटोनिक झिल्ली को नुकसान न पहुंचाएं, जिसके परिणामस्वरूप रक्तस्राव होगा और रक्त वाहिका लेबलिंग को ख़तरे में डालना होगा।
  3. जर्दी पर एक सुलभ नस चुनें सुनिश्चित करें कि रक्त प्रवाह भ्रूण की ओर निर्देशित है । विटेललाइन नसों में से एक का एक ब्रांचिंग पॉइंट चुनें(चित्रा 3B, सी)।
    नोट: E6.5 - E7.5 पर, कोरियोलाएंटोक झिल्ली को जर्दी नसों तक पहुंचने के लिए चिमटी के साथ धीरे से स्थानांतरित करने की आवश्यकता हो सकती है। E8.5 के बाद, एकमात्र विकल्प कोरियोलाएंटोइक झिल्ली नसों में से एक में इंजेक्ट करना है, क्योंकि इस चरण तक, कोरियोलाएंटोइक झिल्ली पूरी तरह से भ्रूण को कवर करती है।
  4. विपरीत दिशाओं में फाड़ कर दो ड्यूमोंट #5 चिमटी का उपयोग करके चुने गए इंजेक्शन बिंदु के ऊपर विटेलिन झिल्ली निकालें।
  5. ड्यूमोंट #5 का उपयोग करके एक खींची गई कांच की सुई को तोड़ें और सेलट्रैकर सीएम-डीआईआई के साथ लोड होने से पहले नस के अनुमानित आकार में इसके व्यास को समायोजित करें। डीआईआई स्टॉक सॉल्यूशन को डीएमएसओ में 40 माइक्रोग्राम/माइक्रोन पर बनाएं और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। 4 μg/μl की एकाग्रता पर 0.3 एम सुक्रोज/पीबीएस में काम करने का समाधान तैयार करें।
    1. 0.3 एम सुक्रोज/पीबीएस में 5 -10 माइक्रोन के बीच एक मुंह ट्यूब के साथ सक्शन का उपयोग करके सुई में एस्पिरेट करें। पुराने भ्रूण 25 माइक्रोन या उससे अधिक तक की आवश्यकता हो सकती है । E8.5 से, भ्रूण बड़ा है, और अधिक मांसपेशियों नसों, जो DiI भरी हुई कांच सुई के साथ छुरा से पहले एक Dumont #5 के साथ स्थिति में आयोजित करने की आवश्यकता हो सकती है ।
  6. तेजी से सुई को नस में डालें और मुंह की नली के साथ तेजी से उड़ा दें ताकि डीआईआई को थक्का बनाए बिना धीरे-धीरे रक्त प्रवाह में शामिल होने की अनुमति दी जा सके। वैकल्पिक रूप से, डीआईआई डिलीवरी के लिए प्रेशर इंजेक्टर का उपयोग करें।

8. सेक्शनिंग या होलमाउंट परीक्षा के लिए हार्वेस्ट भ्रूण

  1. संभव के रूप में भ्रूण के भीतर ज्यादा DiI के रूप में बनाए रखने के लिए, यह एक छिद्रित चम्मच पर स्कूपिंग और सीधे कैंची की एक जोड़ी के साथ रक्त वाहिकाओं और संयोजी ऊतकों को काटने के द्वारा इंजेक्शन के तुरंत बाद भ्रूण फसल, जर्दी से भ्रूण मुक्त करने के लिए ।
  2. किसी भी ढीली झिल्ली को हटा दें और रुचि के अंगों(यानी,फेफड़ों और पाचन तंत्र को इस ट्यूटोरियल में) को काटना, ऊतक को संकुचित न करने का बहुत ध्यान रखते हुए, जो डीआईआई का प्रसार बनाता है। तुरंत आरटी में 1 - 2 घंटे के लिए 4% पीएफए में विसर्जन करके ऊतकों को ठीक करें।
  3. पीबीएस में 5 मिनट के लिए ऊतक कुल्ला, तो PBS में 15 मिनट 5 μg/ml DAPI युक्त । पूरे माउंट परीक्षा के लिए एक पुल माइक्रोस्कोप स्लाइड पर नमूनों माउंट या उन्हें क्रायो-सेक्शनिंग के लिए एम्बेड।

Representative Results

चित्रा 1 तंत्रिका ट्यूब के माइक्रोसर्जिकल अलगाव और प्रत्यारोपण को पूरा करने के लिए आवश्यक विशिष्ट उपकरणों को दिखाता है। चित्रा 2 प्रत्यारोपण प्रक्रिया से पता चलता है। प्रत्यारोपण भ्रूण प्रत्यारोपण सफलता के लिए जांच कर रहे हैं । यह एक स्टीरियो फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के तहत भ्रूण की जांच शामिल है, आम तौर पर सुबह माइक्रोसर्जरी के बाद, भ्रष्टाचार व्युत्पन्न (GFP +) एनसीसी की उपस्थिति के लिए । यदि प्रत्यारोपण सफल रहा है, तो जीएफपी + एनसीसी तंत्रिका ट्यूब के आसपास और प्रारंभिक प्रवास मार्गों में देखा जा सकता है जो अग्रणी की ओर अग्रसर है। यदि प्रक्रिया सफल नहीं रही है, तो जीएफपी + एनसीसी को तंत्रिका ट्यूब के बाहर नहीं देखा जाएगा, या यदि वे मेजबान में मौजूद हैं तो वे कम संख्या में हो सकते हैं। इन असफल भ्रूणों को छोड़ दिया जाता है। आमतौर पर, 5-8 तंत्रिका ट्यूब प्रत्यारोपण एक दिन में किया जाता है, और इन 80% सफल रहे हैं। असफल तंत्रिका ट्यूब प्रत्यारोपण के कारणों में माइक्रोसर्जरी के दौरान किए गए ऊतक क्षति के कारण भ्रूण की मृत्यु, या मेजबान भ्रूण में एकीकृत करने के लिए तंत्रिका ट्यूब की विफलता शामिल है। उत्तरार्द्ध मेजबान के भीतर तंत्रिका ट्यूब के खराब प्लेसमेंट या खराब विच्छेदन तकनीक के कारण या अत्यधिक जोखिम से विघटन एंजाइम के कारण खराब गुणवत्ता वाली तंत्रिका ट्यूब से परिणाम दे सकता है। प्रारंभिक स्क्रीनिंग कदम, साथ ही GFP + कोशिकाओं के लिए इसी तरह के बाद परीक्षाओं, उपयोगी है के रूप में इसका मतलब है कि समय और संसाधनों भ्रूण है कि पेट के भीतर GFP लेबल एनसीसी नहीं है पर प्रयोगों प्रदर्शन से बर्बाद नहीं कर रहे हैं ।

चित्रा 3 रक्त वाहिकाओं के डीआई इंजेक्शन के लिए प्रक्रिया दिखाता है। दक्षता/DiI इंजेक्शन तकनीक की सफलता पर निर्भर करता है: पहले, लक्षित नस के लिए इष्टतम व्यास के लिए इंजेक्शन सुई काटने, दूसरा एक सटीक इशारा जब नस में सुई डालने (तो दूसरी तरफ के माध्यम से छेद नहीं), और तीसरे सुई से परहेज एक निरंतर दर पर उड़ाने से इंजेक्शन के दौरान खामियों को दूर हो रही है । यदि इन तीन मापदंडों में से किसी को गलत तरीके से किया जाता है, भ्रूण बाहर खून बह जाएगा या कई घंटे की आवश्यकता के लिए एक दूसरे के प्रयास से पहले ठीक हो जाएगा के रूप में नकसीर यह लगभग असंभव को फिर से तुरंत सुई बनाता है । सफल भ्रूण एक स्टीरियोफोरेसेंस माइक्रोस्कोप के तहत देखने के द्वारा तुरंत चुना जाना चाहिए और तेजी से विच्छेदित किया जाना चाहिए । सफल भ्रूण में, DiI लेबल रक्त वाहिकाओं भ्रूण भर में मौजूद है(चित्रा 3C, डी)केशिका बिस्तरों(चित्रा 3 डी)सहित ।

भ्रूण की कटाई और ऊतक वर्गों या साबुत गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट की जांच पर, विशिष्ट परिणामों से पता चलता है कि आदिम ईएनएस के भीतर जीएफपी + एनसीसी और डीआईआई-लेबल वाले आंत रक्त वाहिका नेटवर्क की ठीक संरचना(चित्रा 4)संपूर्ण तैयारी की जांच कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके की जा सकती है जिससे छवि ढेर तीन आयामी (3 डी) पुनर्निर्माण का उत्पादन करते हैं जो जीएफपी + ईएनएनएस कोशिकाओं और DiI सना हुआ संवहनी प्रणाली(चित्रा 4 ए-सी) के ठीक अनुमानों के बीच अंतरसंबंध दिखाते हैं; जी-1; वीडियो 1 और 2)।

Figure 1
चित्रा 1. अनुशंसित माइक्रोसर्जरी उपकरण। (क) सिलाई सुई से आकार के माइक्रो स्केलपेल । (ख) माइक्रो-स्केलपेल को आकार देने के लिए ठीक अरकंसास पत्थर । (ग) ए) सीधी कैंची, ख) घुमावदार कैंची, सी) 181/2 जी हाइपोडर्मिक सुई के साथ 5 मिलीलीटर सिरिंज, डी) प्लास्टिक पिपरेट, ई) कस्टम मेड अंडा धारक, च) काली स्याही, जी) स्क्वायर वॉच ग्लास, ज) काले सिलगार्ड बेस के साथ स्क्वायर वॉच ग्लास, i) सुई धारक पर माइक्रो-स्केलपेल, जे) मिन्यूटेन पिन, कश्मीर) मिन्यूटेन या टंगस्टन सुई पर सुई धारक, एल) पचेफ-वोल्फ स्प्रिंग कैंची, एम) ड्यूमोंट #5 चिमटी, एन) छिद्रित चम्मच, ओआई) शॉर्ट फायर-खींचा हुआ सुई, ओआईआई) लंबे फायर-खींचा सुई, पी) मुंह ट्यूब ट्यूब। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । 

Figure 2
चित्रा 2। इंट्रास्पेस तंत्रिका ट्यूब प्रत्यारोपण। चिक भ्रूण/जीएफपी तंत्रिका ट्यूब छवियों को डेलांडे एट अलसे संशोधित किया गया है । 12. आंत्र तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं द्वारा आंत उपनिवेशीकरण के लिए संवहनीकरण आवश्यक नहीं है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3। नसों में Dii इंजेक्शन। (क) अनुशंसित उपकरण: क) सेलट्रैकर सीएम-डीआईआई ड्रॉप ऑन पैराफिल्म, ख) खींचा ग्लास इंजेक्शन सुई, ग) माउथ ट्यूब । (ख) E4 चिमरिक चिक भ्रूण में नसों में DiI इंजेक्शन के योजनाबद्ध आरेख । (ग) ओवो DiI नसों में इंजेक्शन में ठीक कांच की सुई दिखाता है जिसमें दीई नस (तीर) में डाला जाता है । (घ) जीएफपी + न्यूरल ट्यूब (तीर) के साथ E4 चिमरिक भ्रूण पोस्ट DiI इंजेक्शन (लाल) । (ङ) डीआईआई ने एक जीवित भ्रूण में ठीक रक्त वाहिका नेटवर्क, 24 घंटे के बाद इंजेक्शन दाग । बीआर: मस्तिष्क; एच: दिल; पौंड: अंग कली; एक: allantois। (सी) और (डी) में छवियां Delalande एट अलसे संशोधित किया गया है । 12 आंत्र तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं द्वारा आंत उपनिवेशीकरण के लिए संवहनीकरण आवश्यक नहीं है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: एक E5.5 लड़की भ्रूण के पेट और caecum में प्रतिनिधि परिणाम । (ए-सी) 3 आयामी (3 डी) पेट के क्षेत्र में एक कॉन्फोकल छवि ढेर का पुनर्निर्माण दिखा रहा है (डी) जीएफपी + आंत्र तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाएं (एनसीसी) (ई) डीआईआई दाग संवहनी प्रणाली और (एफ एफ)) पेट के स्तर पर दोनों नेटवर्क डी-एफ हिस्टोलॉजिकल वर्गों की एक विलय छवि (जी) जीएफपी + एनसीसी (एच) डीआईआई दाग संवहनी प्रणाली और (I) दोनों नेटवर्क की एक विलय छवि । नाभिक दापी (सियान) से सना हुआ है। (जी-एच) 3 डी कैटम क्षेत्र में एक कॉन्फोकल इमेज स्टैक का पुनर्निर्माण (ए) जीएफपी + एनसीसी माइग्रेशन फ्रंट इन ग्रीन, (बी) रेड में डीआईआई दाग वैस्कुलर सिस्टम, और (सी) दोनों नेटवर्कों की एक विलय छवि । छवियां (ए-एफ) Delalande एट अलसे संशोधित किया गया है । 12 आंत्र तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं द्वारा आंत उपनिवेशीकरण के लिए संवहनीकरण आवश्यक नहीं है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure S1
चित्रा S1। एंजाइमेटिक पाचन और सूक्ष्म विच्छेदन द्वारा आसपास के ऊतकों से एक दाता GFP + तंत्रिका ट्यूब का अलगाव। (क) जीएफपी + न्यूरल ट्यूब और आसन्न सोमाइट्स दाता भ्रूण से विच्छेदित । (ख) अग्नाशय पाचन और माइक्रो विच्छेदन के बाद अलग तंत्रिका ट्यूब स्टेनलेस मिन्यूटियन पिन का उपयोग कर । तो: सोमाइट्स; NT: तंत्रिका ट्यूब; नेकां: Notochord ।

video 1
वीडियो 1. चित्रा 4C में छवि के 3 आयामी 360 ° रोटेशन, E5.5 (HH27-28) में पेट में संवहनी प्रणाली और ENCC दिखा। कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Video 2
वीडियो 2. चित्रा 4I में छवि का 3-आयामी 360 ° रोटेशन, E5.5 (HH27-28) में कैक्यूम के क्षेत्र में संवहनी प्रणाली और एनसीसी माइग्रेशन फ्रंट दिखाता है। कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

यहां वर्णित रक्त वाहिका लेबलिंग के साथ संयुक्त तंत्रिका ट्यूब ग्राफ्टिंग की विधि, स्वायत्त तंत्रिका तंत्र (ईएनएस) और संवहनी प्रणाली के तत्व के सह-विकास का अध्ययन करने के लिए अंडे के भीतर एवियन भ्रूण (अन्य कशेरुकी भ्रूण की तुलना में) की पहुंच में आसानी का पूरा लाभ उठाती है।

एनसीसी डेरिवेटिव लेबलिंग के लिए, चिकजीएफपी-चिकइंट्राप्रेपी ग्राफ्टिंग विधि का हम वर्णन शास्त्रीय बटेर-चिक कल्पना विधि पर कई फायदे हैं जो 40 साल पहले1-3से अधिक स्थापित किए गए थे। सबसे पहले, फिटसी प्रकाश के तहत, जीएफपी फ्लोरेसेंस बेहद उज्ज्वल है, इस हद तक कि जीएफपी + कोशिकाएं जीवित चिमरिक भ्रूण में आसानी से समझदार हैं। यह भ्रष्टाचार की सफलता को ओवो मेंजांचने की अनुमति देता है, जबकि बटेर-चिक ग्राफ्टिंग के लिए भ्रूण को मार दिया जाना चाहिए, संसाधित और QCPN का उपयोग कर इम्यूनो दाग, इससे पहले कि भ्रष्टाचार की सफलता का पता लगाया जा सकता है2। दूसरा, ट्रांसजेनिक चिकजीएफपी में जीएफपी अभिव्यक्ति साइटोप्लाज्मिक है, इसलिए यह न केवल सेल निकायों को लेबल करता है, बल्कि प्रत्यारोपित कोशिकाओं के अनुमानों को22कल्पना करने की अनुमति देता है। यह उच्च रिज़ॉल्यूशन पर देखे जाने वाले जटिल न्यूरोनल नेटवर्क को अनुमति देता है (ध्यान दें कि जब नमूना एंटी-जीएफपी एंटीबॉडी के साथ इम्यूनो दाग होता है तो ठीक अनुमानों की सबसे अच्छी कल्पना की जाती है)। के रूप में QCPN लेबलिंग बटेर सेल नाभिक तक ही सीमित है, इस तरह के नेटवर्क बटेर-लड़की कल्पना का उपयोग कर पता नहीं कर रहे हैं । तीसरा, इंट्रास्पेस ग्राफ्टिंग चिमरिक भ्रूण के भीतर कोशिकाओं के बीच किसी भी संभावित प्रजाति के अंतर को समाप्त करता है। चूंकि बटेर भ्रूण में लड़की (19 दिन बनाम 21 दिन) की तुलना में कम इनक्यूबेशन अवधि होती है, इसलिए यह सुझाव दिया गया है कि बटेर कोशिकाओं में चिक कोशिकाओं की तुलना में अधिक प्रसार दर होती है, जो संभावित रूप से चिमरिक ऊतकों के विकास को प्रभावित कर सकती है23। दिलचस्प बात यह भी है कि यह पौधों में दिखाया गया है कि इंटरप्रपीज ग्राफ्टिंग मेजबान 24में डीएनए मिथाइलेशन पैटर्न में व्यापक परिवर्तन पैदा कर सकता है। चौथा, लड़कीGFP एनसीसी भाग्य और सेल प्रतिबद्धता25जैसे विषयों को संबोधित करने के लिए बैक-ट्रांसप्लांट प्रयोगों की सुविधा प्रदान करता है । पांचवां, ट्रांसजेनिक चिकजीएफपी जीएफपी + सेल सबपॉपुलेशन की एफएएफएस छंटाई, जीएफपी + कोशिकाओं वाले अंगों की ऑर्गेनोटिपिक संस्कृति, अभिव्यक्ति प्लाज्मिड्स 26 के इलेक्ट्रोपाउरेशन के माध्यम से जीएफपी + ग्राफ्टेड ऊतक के आनुवंशिक हेरफेर और ऑप्टिकल अनुमान टोमोग्राफी27जैसी अन्य इमेजिंग प्रौद्योगिकियों सहित कई अन्य तकनीकों के लिए भी उपयोगी है।

तंत्रिका ट्यूब प्रत्यारोपण दृष्टिकोण तंत्रिका ट्यूब की छोटी मात्रा की जगह microsurgically द्वारा संशोधित किया जा सकता है। तंत्रिका ट्यूब के छोटे खंडों का उपयोग करके माइक्रोसर्जरी भ्रूण के लिए संभावित रूप से कम हानिकारक है और अस्तित्व में सुधार किया जा सकता है। हालांकि, कम तंत्रिका ट्यूब प्रत्यारोपण का नकारात्मक पक्ष यह है कि मेजबान में GFP + एनसीसी की संख्या कम हो जाएगी । उपयोगकर्ता भ्रूण के इष्टतम अस्तित्व को देने के लिए प्रत्यारोपित तंत्रिका ट्यूब की मात्रा और जानकारीपूर्ण परिणाम देने के लिए पर्याप्त मेजबान आंत के भीतर जीएफपी + एनसीसी की संख्या के बीच संतुलन प्राप्त करने की कोशिश कर सकते हैं।

पोत चित्रकला के लिए, DiI को लाभ है कि इसकी फ्लोरेसेंस बहुत उज्ज्वल और मजबूत है। इसके अलावा, यह बेहतरीन खोला केशिकाओं के धुंधला आश्वासन निर्धारण के दौरान फैलाना करने की क्षमता है । चूंकि यह एक महत्वपूर्ण डाई है, भ्रूण इंजेक्शन प्रक्रिया जीवित है और एक दाग संवहनी प्रणाली के साथ विकसित करने पर ले जा सकते है (हमारे हाथों में 24 घंटे तक, हालांकि धुंधला समय के साथ और अधिक समयनिष्ठ हो जाता है, चित्रा 3Eदेखें) । DiI संवहनी चित्रकला के साथ लड़कीजीएफपी ग्राफ्टिंग का संयोजन इसलिए लाइव इमेजिंग के साथ संगत है। इन सभी फायदों के अलावा, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि संवहनी इंजेक्शन केवल चमकीले जहाजों को लेबल करता है और इसलिए खुले हुए केशिकाओं, एंडोथेलियल टिप कोशिकाओं या अलग एंडोथेलियल कोशिकाओं की पहचान नहीं करता है। हालांकि, एवियन ट्रांसजेनेसिस में आगे की प्रगति ऐसे मुद्दों को दरकिनार करने के लिए नए तरीके प्रदान कर सकती है, जैसा कि टीजी (tie1: H2B-eYFP) बटेर भ्रूण का उपयोग करके संवहनी मॉर्फोजेनेसिस28का अध्ययन करने के लिए प्रयोगों द्वारा उदाहरण दिया गया है । इस तकनीक की एक और सीमा यह है कि, E7.5 और उससे आगे भ्रूण में प्रभावी पोत लेबलिंग के लिए, डाई की बड़ी मात्रा में इंजेक्शन की जरूरत है, जो प्रयोग महंगा कर सकते हैं । हालांकि, तकनीक के एक संशोधन में हाइलाइटर इंक14का इसयूजिंग कम लागत वाले रक्त वाहिका लेबलिंग शामिल हो सकते हैं, हालांकि इस दृष्टिकोण को हमारे हाथों में आजमाया नहीं गया है।

प्रक्रियाओं के महत्वपूर्ण चरणों में ब्लास्टोडिस्क के नीचे स्याही इंजेक्शन लगाकर भ्रूण की कल्पना करने की प्रक्रिया शामिल है। यदि जर्दी को कवर करने वाली झिल्ली इस स्तर पर स्याही से भरी सुई से फट जाती है तो भ्रूण के अस्तित्व से गंभीर रूप से समझौता किया जाता है। इसके अलावा, यह महत्वपूर्ण है, जब एक दाता तंत्रिका ट्यूब तैयार, कि ऊतक अग्न्याशय में एक जरूरत से ज्यादा लंबे समय के लिए नहीं छोड़ा जाता है (एक अधिकतम के रूप में लगभग 10 मिनट पर विचार करें) । अग्नाशय के लिए लंबे समय तक जोखिम ऊतक को नुकसान पहुंचाता है और तंत्रिका ट्यूब को संभालना मुश्किल होता है और यह मेजबान में अच्छी तरह से शामिल नहीं होगा। जंगली प्रकार के भ्रूण पर DiI इंजेक्शन तकनीक का अनुभव प्राप्त करना चिमरिक भ्रूण इंजेक्शन से पहले आवश्यक है, क्योंकि इंजेक्शन लगाने का केवल एक प्रयास प्रत्येक भ्रूण के लिए आम तौर पर संभव है। DiI मात्रा और सुई व्यास प्रत्येक भ्रूण के लिए महत्वपूर्ण मापदंडों रहे है और जंगली प्रकार, मंच मिलान नियंत्रण पर मूल्यांकन किया जाना चाहिए ।

अंत में, लाइव चिक भ्रूण में तंत्रिका ट्यूब प्रत्यारोपण और DiI पोत चित्रकला की हमारी दोहरी लेबलिंग विधि का उपयोग ऑर्गेनोजेनेसिस के दौरान एनसीसी और रक्त वाहिका नेटवर्क के बीच अंतर-संबंधों की जांच करने के लिए किया जा सकता है। अंग विकास के दौरान सही लक्ष्य इनरवेशन और संवहनीकरण स्थापित करने के लिए जिम्मेदार तंत्र को ध्यान में रखते हुए अभी भी काफी हद तक अज्ञात हैं, यह पद्धति इस क्षेत्र में भविष्य की खोजों के लिए क्षमता रखती है।

Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

निषेचित जीएफपी चिकन अंडे प्रो हेलेन सांग, रोसलिन संस्थान, और एडिनबर्ग विश्वविद्यालय, ब्रिटेन द्वारा आपूर्ति किए गए थे । रोसलिन ट्रांसजेनिक चिकन सुविधा वेलकम ट्रस्ट द्वारा और जैव प्रौद्योगिकी और जैविक विज्ञान अनुसंधान परिषद (BBSRC) द्वारा वित्त पोषित है । काम आंशिक रूप से वित्त पोषित किया गया था, और NT का समर्थन किया, ग्रेट ऑरमंड स्ट्रीट अस्पताल बच्चों के चैरिटी, लंदन, ब्रिटेन द्वारा । लेखकों बेन Jevans, बाल स्वास्थ्य के यूसीएल संस्थान, ग्राफ्टिंग के लिए भ्रूण तैयार करने के साथ मदद के लिए शुक्रिया अदा करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fertilised chick eggs Henry Stewart and Co, Louth, UK
Fertilised GFP chick eggs The Transgenic Chicken Facility, The Roslin Institute, The University of Edinburgh
Egg incubator (Profi-H Hatcher) Lyon Technologies, CA, USA 910-033
14C Incubator Precision Cooled Incubator, Leec Ltd., Nottingham, UK Model LT2
Stereo-microscope  LEICA Model MZ 12.5
Digital Camera LEICA DC500
Image acquisition software LEICA IM50
Goose neck halogen cold light source Advanced Imaging Concepts, Inc KL 1500 LCD 
181⁄2 G hypodermic needle  SIGMA - ALDRICH HSWNH181
Pancreatin SIGMA - ALDRICH P3292
DMEM SIGMA - ALDRICH D5030
Goat serum SIGMA - ALDRICH G6767
5 ml syringe SIGMA - ALDRICH Z248010
Mouth tube SIGMA - ALDRICH A5177
Sigma Pasteur pipettes non-plugged, L 5 3/4 in. SIGMA - ALDRICH S6018
Transfer pipettes, polyethylene SIGMA - ALDRICH Z350796 
Borosillicate glass capillaries, thin wall without filament Harvard apparatus PY8 30-0035
Iris Scissors - ToughCut Fine Science Tools 14058-09
Curved Iris Scissors - ToughCut Fine Science Tools 14059-09
Needle holders (Nickel-plated pin holder)  Fine Science Tools 26018-17 
Pascheff-Wolff Spring Scissors  Fine Science Tools  15371-92
Dumont #5 forceps  Fine Science Tools  11251-30 
Minutien pins  Fine Science Tools 26002-15
Dumont AA forceps, Inox Epoxy- coated  Fine Science Tools 11210-10 
Perforated spoon Fine Science Tools 10370-18
Tungsten needles (0.125mm diameter) Fine Science Tools 10130-05
Sellotape (clear, 24 mm width) Any Supplier
Pen/Strep (Penicillin, Streptomycin) Solution VWR international 101447-068 
Sylgard 184 silicone elastomer kit Dow Corning S09 512 516
Pelikan black ink Pelikan 211-169
CellTracker CM-DiI  Molecular Probes C-7001
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Molecular Probes D1306
Settings for glass needle puller  Sutter Instruments Flaming/Brown micropipette puller model P-86
Heat 950; Pull 150; Velocity 100; Time 200; Pressure 500

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 99 इंट्राप्रेजिज ियां ग्राफ्टिंग कल्पना तंत्रिका ट्यूब पोत चित्रकला कार्बोसाइनिन डाई वैस्कुलर नेटवर्क ट्रांसजेनिक जीएफपी चिकन न्यूरल क्रेस्ट कोशिकाएं आंत्र तंत्रिका तंत्र
चिक<sup>जीएफपी </sup>न्यूरल ट्यूब ग्राफ्टिंग और कार्बोसाइन डाई डीआईआई इंजेक्शन का उपयोग करके चिकन भ्रूण के भीतर तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं और रक्त वाहिकाओं की दोहरी लेबलिंग
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Delalande, J. M., Thapar, N., Burns, A. J. Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection. J. Vis. Exp. (99), e52514, doi:10.3791/52514 (2015).

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