Introduction
Vaak in undergraduate algemene biologie cursussen, de onderwerpen van de regulatie van de celcyclus en kanker worden aangestipt, maar niet in detail onderzocht, omdat de breedte van de inhoud van deze cursussen laat weinig tijd voor diepte. Daarnaast worden gegradueerde biologiestudenten niet typisch blootgesteld aan geavanceerde technieken in verband met dierlijke celkweek. Om studenten te helpen ontwikkelen van een dieper begrip van deze concepten, terwijl de toepassing en het analyseren van wat ze geleerd hebben, werd een laboratorium activiteit ontwikkeld als een wijziging van het Walter Reed Army Institute of Research (WRAIR) uitgebreid laboratorium activiteit 1. Het laboratorium module gebruikt een stapsgewijze experimentele strategie die ook groeien en karakteriseren van een kankercel model, het ontwikkelen en uitvoeren celtelling werkwijzen vaststelling optimale tijdsverloop en doseringen voor behandeling van cellen met anti-proliferatieve middelen, en het identificeren van afwijkende cel-signalerende routes . Het experiment laat ook openen-ended onderzoek.
De meeste technieken vereist voor deze activiteit kan worden bereikt in een typisch biologisch onderwijs laboratorium. De activiteit begint met de leerlingen het karakteriseren van de morfologie en groei van de muis borsttumor (MMT) cellijn, een model voor menselijke borstkanker 2. Borstkanker werd gekozen als het model van kanker als gevolg van de prevalentie in de bevolking, de bekendheid van de college-leeftijd studenten, en de wijdverbreide beschikbare gegevens. De MMT cellijn werd speciaal gekozen omdat het gemakkelijk verkrijgbaar, goed gekarakteriseerde, een korte verdubbelingstijd en gemakkelijk te kweken. Daarnaast MMT cellen hormoongevoelige die overeenkomt met meeste vrouwelijke borstkanker. Studenten identificeerden afwijkende cel-signaalroutes in de MMT cellen door de cellen te behandelen met chemotherapie geneesmiddelen waarvan het werkingsmechanisme staat established.The concentratie van de geneesmiddelen en de lengte van de behandeling worden gevarieerd zodat leerlingenhet effect van deze variabelen op de snelheid van celdeling evalueren. De sleutel voor deze activiteit assay is de bepaling van cellevensvatbaarheid, slechts sprake celtelling, via een van twee methoden. Elke methode is afhankelijk van sterke microscopie vaardigheden. Leerlingen bepalen cellevensvatbaarheid met behulp van een standaard, hemocytometer werkwijze en een nieuwe photomicroscopy werkwijze en stelt. Op basis van hun bevindingen kunnen zij voorstellen en test modificaties de activiteit. Studenten vervolgens vertegenwoordigen hun gegevens en interpreteren van de resultaten om hun hypothese te verfijnen en ontwikkelen van nieuwe experimentele strategieën.
Dit laboratorium activiteit is geschikt voor eerstejaars of tweedejaars niveau studenten hoofdvak in de biologische wetenschappen. Het is gecondenseerd in een week lab module die in een eerste jaar kan worden afgerond, algemene biologie of tweede jaar, cellulaire / moleculaire biologie natuurlijk. Vaardigheden die nodig zijn voor een goede uitvoering van de activiteiten omvatten elementaire rekenkunde en algebra, bekendheid met een reeks van core laboratorium vaardigheden (bv, pipetteren, oplossing maken, steriele techniek), data-analyse, basis licht microscopie en time management, samen met een instructeur kennis van celcultuur en spreadsheet-software. Reagentia die nodig zijn een dier cellijn model voor kanker (bijv muizenborsttumorvirus cellen, MMT 2), chemotherapie middelen (bijvoorbeeld tamoxifen, curcumine, metformine en aspirine), trypan blauw en celcultuur media (bijvoorbeeld Eagle's Minimaal Essentieel Medium ; EMEM) met de juiste supplementen (bijv donor paard en foetaal runderserum). Instrumenten die nodig zijn onder meer een omgekeerde lichtmicroscoop met digitale camera gehechtheid, computer, 100 mm en 24 goed weefselkweek platen, CO 2 incubator (of gelijkwaardig), bioveiligheid kast (BSC; Klasse II), hemocytometer en digitale microscopie software.
Er zijn goede voorbeelden van specifieke lab activiteiten die afhankelijk diercelcultuur Teach studenten over concepten in celbiologie 3. Maar veel nodig leveringen of technieken die niet gemakkelijk toegankelijk (bv radioactieve isotopen, levend dierlijk weefsel, geavanceerde imaging apparatuur 1,4,5), beschrijven protocollen die vrij geavanceerde (bijv, geschikt voor een 400-niveau cursus 6) zijn, of vereisen multi-week of semester lang projecten 6,7. De laboactiviteit beschreven is eenvoudig en kan worden uitgevoerd in een enkele week gemeenschappelijke laboratoriumapparatuur.
Kortom, dit lab module daadwerkelijk invoert of versterkt de begrippen celcyclus, cellulaire signaalwegen en kanker terwijl onderwijzen basis- en geavanceerde laboratorium vaardigheden experimentele data-analyse, de wijze van diercelcultuur en wetenschappelijke proces. Het laboratorium-module is eenvoudig en economisch toegankelijk en biedt flexibiliteit en mogelijkheid voor open-ended onderzoek. De activiteit stimuleert student creativiteitdoor een template experimentele strategie die fungeert als gids maar geen recept. Belangrijker nog, de activiteit voldoet aan alle domeinen van het leren Blooms taxonomie 8 als het vereist herinneren, begrip, het toepassen, analyseren, evalueren en het creëren door het betrekken van studenten in een proces dat ze uit het handboek en in de wereld van het wetenschappelijk onderzoek trekt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerkingen: Gedrag alle werkzaamheden met cellen en celcultuur reagentia in een klasse II bioveiligheid kast (BSC) 9. MMT cellen worden geclassificeerd als Biosafety Level I, zoals ze laag tot matig biologische risico's opleveren. Breng een goede reiniging en ontsmetting procedures om de BSC tussen toepassingen (bijvoorbeeld ultraviolet licht, 70% ethanol vegen).
1. Grow MMT cellen
- Groeien cellen in 10 cm weefselkweekschalen met 10 ml voedselrijk medium dat bestaat uit Eagles Minimum Essential Medium (EMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 2 mM glutamine en 1% Antimycoticum / Antibioticum (10 eenheden penicilline , 100 pg streptomycine, 0,25 ug amfotericine B). Ontwikkel cellen in een bevochtigde 5% CO 2 kamer, bij 37 ° C. Plate cellen bij een dichtheid van 3,6 x 10 6 cellen / cm 2 (zie Tellen cellen in stap 2).
- Vervang de helft van de celkweek media met verse media elke 48 uur UNLess anders vermeld. Controleer levensvatbaarheid en morfologie cel door onderzoek met een omgekeerde fase contrast lichtmicroscoop.
- Opmerking en karakteriseren van cellen voor omvang, structuur, vorm, organisatie en het geschatte aantal onder 100 - 200X vergroting. Op deze dichtheid, moeten de cellen in één vlak verschijnen, niet samengeklonterd boven elkaar en in de directe nabijheid. Elke cel bestaat uit een dikke, bolvormige kern met een dunne, lange, vertakte uitsteeksels uitbreiding ervan dat een punt komen (zie figuur 1).
- Verdeel cellen wanneer ze een celdichtheid van 7,2 x 10 6 cellen / cm2 bereikt. Cellen vertonen een verdubbeling van 1,8 x 10 6 cellen / cm 2 per 24 uur. Wijs cellen Passage X (Px) om het aantal keren dat ze zijn gesplitst duiden.
- Bij generation 3 (dwz na drie passages, P3), oogsten, telling en de plaat cellen op een 24 well weefselkweek plaat bij een dichtheid van 3,6 x 10 6 2.
- Bekijk cellen elke dag en opnemen van digitale microfoto. NB en beschrijf cel morfologie (dat wil zeggen, grootte, vorm, licht reflecterende eigenschappen). Bepaal cel verdubbeling tijd door het tellen van cellen en regelmatig met betrekking verstreken tijd om het aantal cellen.
2. Count MMT Cells
Opmerking: Tel cellen om te bepalen of de cellen moeten worden subcultuur, het opzetten van een experiment of levensvatbaarheid van de cellen te bepalen. Er zijn twee methoden hier gepresenteerd.
- Toepassing van een hemocytometer, een standaardtechniek om cellen te tellen.
- Verkrijg een heldere lijn hemocytometer, een oplossing van trypan blauwe kleurstof, een verbinding lichtmicroscoop, steriele reageerbuizen, pipetten en een handmatige celteller 0,2%.
- Onder de BSC, pipetteer 10 ml cellen uit een 10 cm weefsel kweekplaat verwijderd. Als cellen worden gekweekt op een 24 wells plaat gebruiken een pipet 1 ml of 1000 ul micropipet om de media te verwijderen.
- Plaats de verkregen celsuspensie in een 15 ml steriele buisje (of 1 ml microcentrifuge en andere kleine volume buisje). Anders laat de cellen in de oorspronkelijke weefselkweek plaat / goed.
- Onder de BSC, combineer 10 pi van de celsuspensie met 10 ul van de trypan blauwe oplossing (1: 1 verhouding) in een niet-steriele microcentrifuge of andere kleine volume buis.
Opmerking: trypaanblauw is een vitale vlek die niet wordt geabsorbeerd door gezonde levensvatbare cellen. Wanneer cellen worden beschadigd of dood, trypaanblauw kan de cel waardoor dode cellen te tellen in te voeren (aka kleurstof uitsluiting methode). Daarom is onder een microscoop, dode cellen blijken donkerpaars, terwijl levensvatbare cellen zijn een heldere en licht van kleur. - Broedenbij kamertemperatuur gedurende 5 min.
- Plaats het deksel slip op de hemocytometer. Breng 10 gl van de trypan blue-celsuspensie mengsel in de groef. Bekijk de hemocytometer op 100 - 200X vergroting. Een vierhoekige raster blijkt (zie figuur 2).
- Tel het aantal levensvatbare cellen (ongekleurd) versus totale cellen in elke gerasterde oppervlak. Gemiddeld de vier roosters en vermenigvuldig dat met 1 x 10 4 cellen / ml te verkrijgen.
- Extrapoleer het totale aantal cellen per schaal (of cellen / cm 2). Gebruik dit nummer ofwel wordt de juiste hoeveelheid van de celsuspensie gebruikt in nieuw weefselkweekplaat zaden met de gewenste dichtheid van 3,6 x 10 6 cellen / cm 2 of vast totaal aantal levensvatbare cellen op de plaat of in de put.
Opmerking: Voor aanvullende begeleiding bij het gebruik van een hemocytometer, zie 10.
- Extrapoleer het totale aantal cellen per schaal (of cellen / cm 2). Gebruik dit nummer ofwel wordt de juiste hoeveelheid van de celsuspensie gebruikt in nieuw weefselkweekplaat zaden met de gewenste dichtheid van 3,6 x 10 6 cellen / cm 2 of vast totaal aantal levensvatbare cellen op de plaat of in de put.
- Gebruik software en een digitale camera om levensvatbare cellen te tellen.
- Zorg voor een digitale camera, de bijbehorende software, een oplossing van trypan blauwe kleurstof, een verbinding lichtmicroscoop, steriele reageerbuizen, pipetten en een computer 0,4%.
Opmerking: Een Moticam 2000 digitale camera met bijbehorende Motic Software wordt hier toegepast. Elke vergelijkbare camera en software moet voldoende zijn. Zorg ervoor dat de digitale camera software is gekalibreerd op voorhand (volgens het protocol van de fabrikant). - Onder de BSC, gebruik dan een 1 ml pipet of 1000 ul micropipet om de media van het MMT cellen groeien in een 24 well weefselkweek schotel te verwijderen. Was de hechtende cellen door voorzichtig aanleggen van een kleine hoeveelheid (ongeveer 500 ui) uit niet-aangevuld (bijv EMEM zonder toevoegingen) vers medium aan de plaat, weer te verwijderen. Breng 10 pl van 0,2% trypan blauw (gemaakt door verdunning 1: 1 met un-gesupplementeerd EMEM) rechtstreeks naar de bron.
- Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
- Bekijk de plaat onder de microscoop op 100 - 200X vergroting wet een digitale camera bevestigd. Plaat kan worden gewassen met ongesupplementeerd media als kleuring met 2% trypaanblauw is te donker.
- Open de software op de computer een nd controleren of de software is gekalibreerd om de doelstelling die via het tabblad Instellingen. Een beeld van de FOV moeten verschijnen.
- Selecteer het raster op het tabblad Measure. Een raster van pleinen ongeveer 0,005 cm in de breedte zal verschijnen. Rasterkleur informatie naar de oppervlakte van elk vierkant bevestigen.
- Kies een bepaald gebied van het raster om cellen te tellen (dat wil zeggen 5 x 9 vierkantjes vierkanten). Selecteer de rechthoek uit het tabblad Measure. Klik op de hoek van een vierkant en sleep de cursor naar de pleinen van de keuze omvatten.
Opmerking: Een schaduw van groen zal de pleinen van keuze en een witte doos zal verschijnen in de hoek dat de breedte, hoogte, het gebied biedt, en de omtrek van de sectie van de gekozen raster te dekken (zie figuur 3). - Tel het aantal Viable cellen binnen de geconstateerde oppervlakte. Doe hetzelfde voor twee plaatsen in dezelfde put of plaatjes door het bewegen van de plaat onder de microscoop.
- Zorg ervoor dat de gemeten gebied is hetzelfde en de vergroting is niet veranderd. Bereken het gemiddelde aantal levensvatbare cellen in het gebied. De oppervlakte van de bron (een 24 wei-plaat, een putje met een oppervlakte van 2 cm2, een 100 mm schaal het gebied is 78,6 cm 2), extrapoleren het aantal levensvatbare cellen van het gebied begrensd in het rooster het totale aantal cellen in het putje (cellen / cm 2).
- Zorg voor een digitale camera, de bijbehorende software, een oplossing van trypan blauwe kleurstof, een verbinding lichtmicroscoop, steriele reageerbuizen, pipetten en een computer 0,4%.
3. Behandel MMT Cellen met anti-proliferatieve Agents
- Bereid oplossingen van de geselecteerde anti-proliferatieve therapeutische agentia (tamoxifen, curcumine en metformine) en optionele geneesmiddel aspirine onder de BSC.
- Los curcumine en tamoxifen in 100% ethanol om een voorraad concentratie van 27 mm te genereren. Los metformine en aspirine in unsupplemented EMEM een voorraad concentratie van 500 mM en 15 mm te genereren, respectievelijk.
- Opzetten van een dosis-respons.
- Behandel MMT cellen met de drie anti-proliferatieve therapeutische agentia (tamoxifen, curcumine en metformine) en optionele geneesmiddelen (aspirine) bij variërende concentraties om 96 uur een dosis-respons curve te genereren. Aanvankelijk toedienen alle drugs in een reeks concentraties gebaseerd op gepubliceerde verslagen 1,11-16 en in concentraties groter of kleiner dan die uitgegeven.
Opmerking: Een dosisrespons bepaalt de minimale concentratie van een geneesmiddel noodzakelijk om de gewenste resultaten. Hier het gewenste resultaat is een vermindering van celproliferatie in vergelijking met de controle.- Voor tamoxifen en curcumine, gebruik concentraties (en overeenkomstige volumes) van 0,054 mM (1 pi), 0,108 mM (2 ui), 0,162 mM (3 pl) en 0,216 mM (4 pl).
- Voor metformine gebruiken concentraties (en de bijbehorende volumes) van 2 mm (2 pl), 4 mM (4 pl), 6 mM (6 pl), 8 mM (8 ui) en 10 mM (10 ui).
- Voor aspirine gebruik concentraties (en overeenkomstige volumes) van 0,030 mM (1 pi), 0,060 mM (2 ui), 0,099 mM (3,3 ui), 0,150 mM (5 ul) en 0,216 mM (6,7 ui).
- Split MMT cellen van de 10 cm schaal op een 24 puts plaat bij een concentratie van 3,6 x 10 6 cellen / cm 2. Bepaal de initiële celconcentratie van zowel cel-telmethoden (stap 2). Bel deze nieuwe 24 goed plaat van cellen "Dag Split".
- 24 uur na cel plating, behandelen MMT cellen met elk van de anti-proliferatieve therapeutische agentia, tamoxifen, curcumine, metformine en aspirine, bij de in fase 3.2.1 concentraties. Raadpleeg dit als "Dag 0".
- Zoals elk putje kan een maximum van 500 ul van de media, gebruik micropipetten met steriele micropipet tips en een nieuwe tip elke keer een nieuw goed wordt behandeld om te voorkomen cr houdenoss verontreiniging. Met twee putjes als controles: cellen gekweekt in afwezigheid van behandeling met geneesmiddelen (negatieve controle) en gekweekt in aanwezigheid van 100% ethanol (oplosmiddel).
- Groeien cellen en opnieuw toedienen van drugs aan de beschreven concentraties wanneer de cellen om de andere dag gevoed worden (zie stap 1.2) voor 96 uur (tot dag 4) op dag 1 -. 4 van de behandeling, in acht nemen van de cellen onder de microscoop en tel gebruik de werkwijze in stap 2,2 (zie figuur 4).
- Herhaal het experiment ten minste drie keer.
- Bepaal de optimale concentratie van elk geneesmiddel door grafieken de relatie tussen cellevensvatbaarheid en geneesmiddeldosering over de lengte van het experiment (zie figuur 5).
- Behandel MMT cellen met de drie anti-proliferatieve therapeutische agentia (tamoxifen, curcumine en metformine) en optionele geneesmiddelen (aspirine) bij variërende concentraties om 96 uur een dosis-respons curve te genereren. Aanvankelijk toedienen alle drugs in een reeks concentraties gebaseerd op gepubliceerde verslagen 1,11-16 en in concentraties groter of kleiner dan die uitgegeven.
- Opzetten van een Time Course.
- Behandel MMT cellen met de drie anti-proliferatieve therapeutische agentia (tamoxifen, curcumine en metformine) met een vaste concentratie variërende tijdsperioden. Gebruik de optimale concentratie identified door de dosis-respons experimenten (zie stap 3.2).
- Gebruik de volgende concentraties: 0,216 mM tamoxifen, 0,216 mM curcumine en 10 mM metformine.
Opmerking: tijdsverloop bepaalt de hoeveelheid tijd die nodig is voor een geneesmiddel zijn optimale gewenste resultaat. Hier, het gewenste resultaat is een vermindering van celproliferatie in vergelijking met de controle.
- Gebruik de volgende concentraties: 0,216 mM tamoxifen, 0,216 mM curcumine en 10 mM metformine.
- Split MMT cellen van de 10 cm schaal op een 24 puts plaat bij een concentratie van 3,6 x 10 6 cellen / cm 2. Bepaal de initiële celconcentratie van zowel cel-telmethoden (stap 2). Bel deze nieuwe 24 goed plaat van cellen "Dag Split".
- 24 uur na cel plating, behandelen MMT cellen met elk van de anti-proliferatieve therapeutische agentia, tamoxifen, curcumine, metformine en aspirine, bij de optimale concentraties die in stap 3.2. Raadpleeg dit als "Dag 0".
- Aangezien elke put kan maximaal 500 gl medium op, use micropipetten met steriele micropipet tips en een nieuwe tip elke keer een nieuw goed wordt behandeld om kruisbesmetting te voorkomen.
- Met twee putjes als controles: cellen gekweekt in afwezigheid van behandeling met geneesmiddelen (negatieve controle) en gekweekt in aanwezigheid van 100% ethanol (oplosmiddel).
- Behandel MMT cellen met de drie anti-proliferatieve therapeutische agentia (tamoxifen, curcumine en metformine) met een vaste concentratie variërende tijdsperioden. Gebruik de optimale concentratie identified door de dosis-respons experimenten (zie stap 3.2).
- Groeien cellen en opnieuw toedienen van drugs in de gekozen concentratie wanneer de cellen om de andere dag gevoed worden (zie stap 1.2) voor 96 uur (tot dag 4). Op dag 1-4 van de behandeling, observeert de cellen onder de microscoop en tel volgens de methode in stap 2,2 (zie figuur 4).
- Herhaal het experiment ten minste drie keer.
- Bepaal de optimale belichtingstijd van MMT cellen aan elk geneesmiddel door grafieken de relatie tussen levensvatbaarheid en duur (tijd) drugsbehandelingen cellen in de geschikte concentratie (zie Figuur 6).
4. Het Lab Module
Opmerking: De volgende is een 5-daagselab periodiciteit van de lab module. Figuur 7 is een stroomschema van hoe het programma zou leiden binnen de 5 dagen. Voor deze activiteit in vijf dagen te vullen ofwel een tijdsverloop of een dosis response curve wordt gegenereerd. Er is niet genoeg tijd om beide curves te genereren. Een dosis respons-experiment wordt hieronder beschreven. Een tijdsverloop experiment kan eenvoudig worden verwisseld
- Splits de klas in groepen: één groep stelt een dosis-respons en de andere een tijdsverloop kiezen voor een concentratie in het midden van de voorgenomen concentratie dosis-respons.
- Handhaaf voldoende culturen en drugs voorraden bij passende concentraties. Tenzij anders vermeld, voeren alle werkzaamheden onder de BSC.
- Dag 1
- Direct studenten om media te maken en te groeien cellen (zoals in stap 1).
- Als studenten krijgen een voorraad van MMT cellen op een 10 cm plaat, direct de studenten om celcultuur media voorbereiden en geven een tutorial in het gebruik van de hemocytometer, digitale microscopie en de digitale camera microscopie software (zoals in stap 2).
- Kalibreer de programmatuur aan die op de microscoopdoelstellingen (bijvoorbeeld 4X, 10X, 20X) nu gebruik protocol van de fabrikant.
- Dag 2
- Laat de leerlingen bevestigen totale aantal cellen en levensvatbaarheid van de cellen (zoals in stap 2).
- Laat leerlingentelling cellen op 100 mm schaal met behulp van zowel de microscopie en software hemocytometer methoden bevestigen soortgelijke resultaten worden verkregen.
- Direct studenten een 24 putjesplaat en spleet cellen uit de 100 mm schotel naar de 24 well platen in de gewenste startcel plating densiteit (zoals in stap 1). Dit wordt beschouwd als Dag van Split. Plaats de 24 goed plaat in een celkweek incubator voor 24 uur.
- Dag 3
- Grow MMT cellen voor 24 uur op een 24 wells plaat. Laat de leerlingen in acht cellen onder de microscoop en te tellen met behulp van microscopie software (zoals in stap 2).
- Geef de student / teben monsters van de behandeling van kanker drug voorraden. Laat ze bereiden en verdun de oorspronkelijke voorraad-oplossing (zoals in stap 3). Voeg de verscheidene concentraties van de geneesmiddelen hun cellen om een dosis respons curve vast te stellen. Dit heet Day 0.
- Incubeer cellen (stap 1,2) met middelen voor maximaal 48 uur.
- Dag 4
- Laat de leerlingen observeren behandelde cellen na 24 uur. Dit is Dag 1.
- Count elk putje met behulp van microscopie software. Neem foto van elk putje zodat tellen kan buiten het laboratorium worden uitgevoerd (zoals in stap 2).
- Incubeer cellen (stap 1,2) met middelen voor nog eens 24 uur.
Opmerking: Instructor biedt extra tutorials en reviews van data-analyse en grafische presentatie. Studenten leren cijfers, percelen, en statistische analyse te maken voor de volgende dag van het verzamelen van gegevens.
- Dag 5
- Laat studenten behandelde cellen na 48 uur, Dag 2.
- Tel elkeook met behulp van microscopie software. Neem foto van elk putje zodat tellen kan buiten het laboratorium worden uitgevoerd (zoals in stap 2).
- Oogst en laat cellen voor het tellen van de traditionele hemocytometer werkwijze kan nagaan student vermogen om effectief gebruik van de microscopie software methode (zoals in stap 2).
Opmerking: Verzamel gegevens en conclusies te trekken of te herzien hypotheses, dienovereenkomstig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Groeiende MMT cellen en vergelijking telmethoden.
Muizenborsttumorvirus cellen werden met succes gekweekt en gekarakteriseerd (Figuur 1) en een nieuwe cel telmethode ontwikkeld volgens Motic Software, een digitale camera geassocieerde softwareprogramma voor een microscoop. Deze nieuwe celtelling methode vergeleken met een traditionele telmethode toepassing van een hemocytometer (figuur 2) en is bewezen even nauwkeurig vaststelt celaantal (tabel 1) zijn. Om te bepalen op de gevolgen van het aantal cellen door verschillende groeiomstandigheden of celtype, de vergelijking tussen de twee cellen telmethoden werd uitgevoerd in aanwezigheid en afwezigheid van anti-proliferatieve middelen en met een andere cellijn, de neuronale PC12 model 17.
Figuur 3 toont de afbakening van de ruimte voor het tellen van cellen met deze methode onder toepassing van een gesuperponeerde raster van defined afmetingen. Het raster wordt gelegd over het gezichtsveld (FOV) en een groen kader wordt vervolgens op een aangegeven lengte en breedte van het rooster (dwz 9x5 vierkanten). De cellen worden geteld in de groene frame en het aantal cellen wordt geëxtrapoleerd, zoals besproken in het protocol.
Behandeling MMT cellen: Bepaling van de dosisrespons van MMT cellen aan anti-proliferatieve middelen.
Dosis-respons studies (Figuur 4) werden uitgevoerd voor elke antiproliferatief middel. Gedurende deze experimenten data voortdurend werd verzameld, beoordeeld en geanalyseerd om te zien of eventuele herzieningen van het protocol werden gerechtvaardigd. Het experiment werd driemaal uitgevoerd met elke studie welke soortgelijke resultaten. Experimenten werden voortgezet totdat alle cellen dood waren of de effecten van de drugs had plateaued. Digitale microfoto van de resultaten zijn weergegeven in figuur 4, en een grafische analyse van deze vaststellingen is gepresenteerdfiguur 5. effectiviteit concentratiebereiken gerapporteerd in de legenda van figuur 4, op de X-as van figuur 5 en in het protocol.
Bij de laagste concentratie tamoxifen, 0,054 mM, was er sterke remming van celgroei van ongeveer 83% in vergelijking met onbehandelde cellen (Figuur 4A). Levensvatbaarheid van de cellen bleef dalen met toenemende concentraties van tamoxifen (figuur 5A). De optimale dosering van tamoxifen werd bepaald op 0,216 mM want na 48 uur voltooid celdood optrad bij die concentratie (Figuur 4A). Interessant is dat deze vermindering in cel vermeerdering tonen geen aanwijzing van een cellulaire resistentie tegen tamoxifen, zoals verwacht op basis van de literatuur 18,19 onderstrepen dat in vitro systeemmodel maar niet altijd volledig vertegenwoordigen vivo events. Wanneer verder tegenover de laagste treatment concentraties curcumin (figuur 4B en 5A) en metformine (figuur 4C en 5B), tamoxifen laagste concentratie bedroeg 9% en 50% meer effectief in het stoppen van celdeling, respectievelijk.
Curcumine vertoonden een concentratieafhankelijke effect op de remming van celdeling ook. Met toenemende concentraties was er een significante afname in cel levensvatbaarheid (figuur 4D en 5A). De optimale dosering van curcumine werd bepaald op 0,216 mM want na 48 uur, zoals tamoxifen, was er volledige celdood bij die concentratie.
Metformine behandeling leverde de minst opvallende daling in MMT cellevensvatbaarheid, wat leidt tot 33% vermindering bij laagste concentratie. Een gelijktijdige verlaging van cellevensvatbaarheid met metformine toenemende concentratie werd waargenomen (Figuur 4C en 5B). De optimale dosering van metformine werd vastgesteld dat de hoogst geteste concentratie (10 mM). In vergelijking met tamoxifen en curcumine, zowel routinematig gebruikt als chemotherapeutica, metformine 30-40% minder effectief in het remmen van de celcyclus. Interessant is dat de effecten van metformine op de celdeling waren in overeenstemming met die verkregen door toediening van acetylsalicylzuur (figuur 4D en 5A), a salicylic middel zonder duidelijk geïdentificeerde mechanisme van remming van celgroei.
Behandeling MMT cellen: Bepaling het tijdsverloop van de MMT cellulaire respons op anti-proliferatieve middelen.
Een tijdsverloop studie werd uitgevoerd voor elke anti-proliferatief agens aangezien de effectieve dosis van een toegediende geneesmiddel kan worden beïnvloed door de tijd van blootstelling. Aangezien deze module assays voor levensvatbaarheid van de cel, is het belangrijk om eerst te bepalen hoe snel de cellen delen (verdubbelingstijd) dus logisch venster voor hoe lang de cellen worden blootgesteld aan de geneesmiddelen kunnen worden gekozen. Het is daarom essentieel dat MMT cel verdubbelingstijd zijnvastgesteld bij eerste karakterisering van de cellen. Gedurende deze experimenten, werd data voortdurend verzameld, beoordeeld en geanalyseerd om te zien of eventuele herzieningen van het protocol werden gerechtvaardigd. Het experiment werd driemaal uitgevoerd met elke studie welke soortgelijke resultaten. Experimenten werden voortgezet totdat alle cellen dood waren of de effecten had plateaued.
Tijdsverloop studies aangetoond dat behandeling van MMT cellen met optimale concentraties van elke anti-proliferatieve geneesmiddel (tamoxifen 0,216 mM, curcumin 0,216 mM, metformine 10 mM) gedurende 96 uur resulteerde in volledige celdood of een afvlakking van de effecten van de drug ( figuur 6). Hoewel aspirine, de "optionele" drug, heeft invloed op levensvatbaarheid van de cellen in onze dosisreactie studies, de impact was klein en werd daarom niet opgenomen in tijdsverloop studies.
Figuur 1. MMT cellen. Digital microfoto van "gezond", onbehandelde muizen borsttumor (MMT) cellen gekweekt op 3,6 x 10 6 cellen / cm2 in gewijzigde Eagles Minimum Essential Medium (EMEM) .100X, schaal = 0,2 mm, aangegeven door witte balk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Hemocytometer raster. Microfoto van hemocytometer raster, 100x. Gehele rooster sectie getoond in cirkel (FOV). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
iles / ftp_upload / 52.528 / 52528fig3.jpg "/>
Figuur 3. Het aanwijzen van de telling met Motic software. Afbeelding van raster overlay op FOV en bepaald gebied voor het tellen van MMT cellen opgericht met de Motic software zoals gezien door de microscoop. 100X, schaal = 0,2 mm, aangegeven met witte balk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Dosis respons van MMT cellen aan anti-proliferatieve middelen. Digital microfoto van MMT cellen gekweekt in de aanwezigheid van anti-proliferatieve agentia op variërende concentraties gedurende 96 uren. Tamoxifen: (A1) 0,054 mM (A2) 0,108 mM (A3) 0,162 mM (A4) 0,216 mM; Curcumine: (B1) 0,054 mM (B2) 0,108 mM (B3) 0,162 mM (B4) .216 mM; Metformine: (C1) 2 mM (C2) 4 mM (C3) 6 mM (C4) 8 mM (C5) 10 mM; Aspirine: (D1) 0,030 mM (D2) 0,060 mM (D3) 0,099 mM (D4) 0,150 mM (D5) 0,216 mM; Ethanol (100%) en onbehandelde beide controles. 100X, schaal = 0,1 mm, aangegeven met blauwe lijnen die deel uitmaken van elk vierkant in het raster. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Grafische weergave van de dosis-respons experimenten MMT cellen aan anti-proliferatieve middelen. Effecten van toenemende concentraties van anti-proliferatieve middelen (A) tamoxifen, curcumine, aspirine, en (B) metformine op MMT cellevensvatbaarheid. Resultaten van eenopnieuw uitgedrukt als percentage van de controle na 48 uren behandeling, hoewel celtherapie gedurende 96 uur. n = 3, STD aangegeven.
Figuur 6. Grafische weergave van tijdverloop analyse van MMT cellulaire reactie op anti-proliferatieve middelen. Tijdsverloop studie van de effecten van tamoxifen (0.216mM), curcumine (0.216mM) en metformine (10 mM) op MMT cellevensvatbaarheid dan 96 hrs. De resultaten worden uitgedrukt als percentage van de controle na 48 uur behandeling. Hier worden de resultaten van een representatief experiment, n = 1.
Figuur 7. Stroomdiagram van 5-daagse lab module.
| Cell Type | Drug Administered | Dag van Experiment | Concentratie van de Drug | Celgetal met Motic | Celgetal met hemocytometer |
| MMT | Onbehandeld | Dag 2 | - | 7.8x10 4 cellen / cm 2 | 8.0x10 4 cellen / cm 2 |
| MMT | Ethanol | Dag 2 | 10 mM | 7.1x10 4 cellen / cm 2 | 7.2x10 4 cellen / cm 2 |
| MMT | Tamoxifen | Dag 2 | 0,216 MM | 0 cellen / cm 2 | 0 cellen / cm 2 |
| MMT | Tamoxifen | Dag 2 | 0,054 mM | 1.3x10 4 cellen / cm 2 | 1.5x10 4 cellen / cm 2 |
| MMT | Curcumine | Dag 2 | 0,054 mM | 1.9x10 4 cells / cm2 | 2.0x10 4 cellen / cm 2 |
| MMT | Curcumine | Dag 2 | 0,216 mM | 0 cellen / cm 2 | 0 cellen / cm 2 |
| MMT | Metformine | Dag 2 | 2 mM | 5.1x10 4 cellen / cm 2 | 5.2x10 4 cellen / cm 2 |
| MMT | Metformine | Dag 2 | 6 mM | 3.4x10 4 cellen / cm 2 | 3.5x10 4 cellen / cm 2 |
| MMT | Aspirine | Dag 2 | 0,099 mM | 2.8x10 4 cellen / cm 2 | 3.0x10 4 cellen / cm 2 |
| PC12 | Onbehandeld | Klieven | - | 4 2,5x10 cellen / cm 2 | 2.1x10 4 cellen / cm 2 |
Tabel 1. Vergelijking van de hemocytometer en Motic software tellen methoden. Resultaten van de cel tellen van MMT cellen, met behulp van Motic software of de hemocytometer methoden. Zowel onbehandelde en behandelde cellen werden geteld, en een andere cellijn PC12, als controle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een lab module wordt gepresenteerd dat zich richt op een verscheidenheid van onderwerpen in de celbiologie te leren door middel van de geavanceerde technieken van dierlijke celkweek. De module doet dit door het analyseren van de effecten van een aantal anti-proliferatieve stoffen op de vermenigvuldiging van cellen die menselijk borstkankermodel. De primaire test is gebaseerd op de fundamentele techniek celtelling en introduceert een nieuwe manier om cellen microscopische software tellen. De activiteiten die de module kan worden uitgevoerd met instrumenten en uitrusting in de ingenieursw programma. De module kan in een 5-daagse schema worden uitgevoerd met voorraden die zijn goedkoop en gemakkelijk te verkrijgen zijn. Hoewel een bepaald merk digitale microscoop camera en microscopie software here (Motic Software) wordt gebruikt, moeten alle vergelijkbare camera en software volstaan.
Dit lab module maakt gebruik van MMT cellen als een model voor de menselijke borstkanker. Studenten worden eerst geleerd om te groeien en te karakteriseren dezecellen in de cultuur. Het is belangrijk te weten dat een succesvolle afronding van dit laboratorium module onderstrepen vereist de onderzoekers (aka studenten) worden goed vertrouwd met het uiterlijk en het gedrag van gezonde MMT cellen, vooral omdat onbehandelde MMT cellen dienen als controles. Daarom grondige karakterisatie van de celgroei patronen verdubbelingstijd en algemene morfologie van MMT cellen is essentieel goede dosisrespons tijdsverloop gegevens worden gegenereerd.
Zodra het kenmerk, MMT cellen werden vervolgens getest op hun reactie op verschillende anti-proliferatieve agentia middel van het onderwijzen van de onderwerpen van celdeling, celcyclus regulatie, celsignalen en kanker. Cellevensvatbaarheid wordt gebruikt om het effect van deze geneesmiddelen op de cellen te begrijpen. Een nieuwe werkwijze voor het tellen van cellen met behulp van software geassocieerd met een microscoop gemonteerde camera, wordt uitgevoerd en vergeleken met een traditionele counting-hemocytometer gebaseerde procedure om de nauwkeurigheid te verifiëren. This nieuwe werkwijze biedt twee voordelen, die bijzonder opmerkelijk omdat het wordt gebruikt in initieel practicumruimten. Ten eerste, omdat de cellen niet nodig uit het weefsel kweekplaat voor het tellen te verwijderen, is minder tijd nodig om de belangrijkste experimentele assay uit te voeren. Dit maakt een groot aantal experimentele variabelen te testen tegelijk en in een beperkte tijdsperiode. Ten tweede voorziet de werkwijze in een digitaal document van de cellulaire respons op de experimentele behandeling waardoor de leerlingen de resultaten en het verfijnen hun experimentele strategie buiten het laboratorium.
Er zijn een aantal zaken op te merken bij beide tellen methoden uitvoering. De voorafgaande aan het tellen van de cellen met beide methoden worden de cellen geïncubeerd met trypan blue onderscheid te maken tussen levende cellen en dode cellen. Dode cellen worden gepenetreerd door de kleurstof en lijken donkerblauw, terwijl levensvatbare cellen zijn helder wit. Indien de cellen worden geïncubeerd met DYe dan de aanbevolen incubatietijd, zullen zij over-bevlekt en moeilijk te onderscheiden. Ten tweede kan MMT cellen klonteren op de hemocytometer of weefsel kweekplaat en moeilijk afzonderlijk te tellen. Daarom is een "klont" aangewezen om een bepaald aantal cellen (bijvoorbeeld 10 cellen / clump) is en elke massa aanwezig op het rooster vervolgens vermenigvuldigd met dit aantal gedurende de telling bevatten. Tenslotte MMT cellen hechten aan het oppervlak van gerechten waarin zij worden geteeld. Het is daarom noodzakelijk om het topje van de pipet rechtstreeks raken aan de plaat bij het verwijderen van de cellen en de kracht van toepassing te breken cel klonten en verwijder zo veel cellen van de plaat mogelijk. Daardoor mijn nemen verschillende pogingen om een nauwkeurige telling behalen via de traditionele methode hemocytometer.
Met de cellen goed gekarakteriseerd en telmethoden gecontroleerd worden twee verschillende experimenten uitgevoerd; Een dosis-respons studie naar de effecten van variërende concentratiesanti-proliferatieve geneesmiddelen op MMT celdeling en een tijdsverloop experiment om de optimale tijd van blootstelling aan deze geneesmiddelen helderen. Dit zijn verrijkend experimenten trial and error noodzakelijk en toepassing van de primaire literatuur is vereist voor een succesvolle experiment. Bijvoorbeeld, eerste pogingen de opheldering van een dosisrespons van MMT cellen om deze anti-proliferatieve middelen bleek dat de geteste concentraties te hoog, aangezien er 100% celdood binnen 24 uur van toediening. Een uitgebreide review van de literatuur heeft geleid tot een herziene reeks van de behandeling concentraties. Dit leert effectief studenten hoe ze literatuur databases gebruiken, lezen, analyseren en kritiek primaire literatuur artikelen en onderstreept hoe die vaardigheden zijn essentieel voor het wetenschappelijke proces.
De resultaten van de dosis respons studies toonden aan dat tamoxifen vertoont de sterkste anti-proliferatief effect bij alle concentraties getest. Tamoxifen, een anti-mitotic geneesmiddel wordt specifiek gebruikt als een anti-oestrogeen therapie voor oestrogeen gevoelige kankers, typisch in postmenopauzale, hormoongevoelige patiënten 18-20. Het geneesmiddel wordt momenteel gebruikt als een behandeling van borstkanker. Tamoxifen concurreert met oestrogeen de intracellulaire oestrogeenreceptor en wanneer gebonden, omlaag reguleert de expressie van cycline D en B, twee belangrijke regulatoren van de celcyclus. De resultaten verkregen in de activiteit suggereren dat tamoxifen succes gehecht aan de oestrogeenreceptor en remde de progressie van de cel door de celcyclus, wat resulteert in de verminderde celproliferatie waargenomen. Interessant is dat de vermindering van MMT cel vermeerdering percentages in alle concentraties van tamoxifen toegediende onthullen geen indicatie van cellulaire resistentie tegen tamoxifen, zoals verwacht op basis van de literatuur (zie bijvoorbeeld 19). Dit dient als een goede herinnering dat de in vitro omstandigheden waaronder de proef werd uitgevoerd niet volledig model in vivo omstandigheden.
Curcumine behandeling van MMT cellen ook resulteerde in een vermindering van cellevensvatbaarheid. Curcumine is een verbinding afgeleid van de wortel en tumeric fungeert als celgroei inhibitor 12,16. Het werkt door down-reguleren van de NF-kappa B pathway en ornithinedecarboxylase (ODC) activiteit. NF-kappa B is een eiwitcomplex dat transcriptie van de anti-apoptotische genen zoals TRAF1 en TRAF2, die coderen voor eiwitten die apoptose remmen regelt. ODC is een enzym dat de productie van polyaminen, eiwitten die kanker cellen met verhoogde voedingsbronnen leidt tot verhoogde celgroei katalyseert. Het geneesmiddel wordt momenteel in gebruik als behandeling van borstkanker. De anti-proliferatieve effecten van curcumine toont duidelijk het effect dat de regulering naar beneden van de cel signaleringsroute met NF-kappa B en ornithinedecarboxylase heeft op de celdeling.
Verminderde levensvatbaarheid van de cellen werd op soortgelijke wijze waargenomen met metformine treatment. Metformine, een medicijn typisch toegediend aan diabetes type II, werd gekozen omdat gepubliceerde rapporten suggereren een correlatie tussen patiënten die metformine en een lagere incidentie van borstkanker 15 nemen. Gemeend wordt dat het middel moduleert de c-MYC gen en daardoor neerwaarts reguleert de activiteit van cycline D. Up-regulatie van cyclinen, moleculen die dienen als controlepunt binnen de celcyclus, het cellen om de voortgang door de cyclus in een sneller tempo resulterend in verhoogde celdeling en groei. De effecten van metformine op MMT cellen laat zien hoe modulatie van het c-myc-gen leidt tot de downregulatie van cycline D en een vermindering van celdeling. De metformine data illustreert verder hoe een medicijn ontwikkeld voor een conditie- in dit geval een diabetes-werkingsmechanisme geschikt voor andere afwijkende fysiologische gebeurtenissen kunnen hebben. Bovendien is het belangrijk te benadrukken dat alhoewel tamoxifen, curcumine, en metformine alle vertragen abnormale cellulaire Prolifking door middel van verschillende mechanismen, elk met succes verminderd celpopulaties en bemoeid met de celdeling in vitro.
Deze module maakt het ook voor open-ended onderzoek in die andere medicatie, kruidenmiddel of middel kan worden getest. Aspirine, een over-the-counter pijnstillende, koortswerende en ontstekingsremmende medicatie gebruikt om milde pijn te verlichten en koorts te verminderen werd gekozen in deze module. Aspirine vermogen om ontsteking te verminderen kunnen tumorgroei remmen door het vertragen van de ontwikkeling van nieuwe bloedvaten die hen voeden en interfereren met stamcellen die hun groei 11,13,14 brandstof. Interessant toediening van aspirine MMT cellen resulteerde in een geringe daling in cellevensvatbaarheid. Er is weinig bekend over de rol van aspirine in preventie van kanker en de behandeling hoewel veel correlatieve studies worden gerapporteerd 13,14, die een uitstekend voorbeeld van correlatieve versus oorzakelijke relaties.
De tijdNatuurlijk studies bleek dat, bij toediening geoptimaliseerde doses, de anti-proliferatieve geneesmiddelen zeer effectief bij interfereren met celdeling binnen 4 dagen na de eerste blootstelling. Deze studies bieden ook een kans voor de studenten om te gebruiken wat ze geleerd over MMT celgroei kenmerken bij het ontwerpen van een experimentele strategie voor het uitvoeren van deze experimenten. In feite, grondig karakteriseren van de celgroei patronen verdubbelingstijd en algemene celmorfologie van MMT cellen is essentieel voor zowel accurate dosis respons en tijdsverloop data.
Zowel dosisrespons tijdsverloop studies de verhouding tussen de geneesmiddelconcentratie en de blootstellingsduur, respectievelijk, en het effect van een geneesmiddel in een biologisch systeem. Dit is een uitstekende manier om de studenten denken over intermoleculaire interacties en andere fundamentele concepten in de biochemie, terwijl het uitvoeren van onderzoek gedreven, onderzoek te krijgen. Vermeldenswaard is dat, omdat veel biology majors plan om medische school te gaan, dit lab module uitgelijnd goed met de nieuw ingestelde veranderingen in de medische school eisen 21.
Dit lab module kan precies worden uitgevoerd zoals beschreven of kunnen gemakkelijk dienen als een matrijs. Een groot aantal variaties in deze activiteit worden opgenomen, zoals de keuze van de anti-proliferatief middel, celtype of nutriënt modificatie in de groeimedia. Zolang een hypothese ontwikkeld dat de fundamentele en geavanceerde concepten in cel of algemene biologie test, de permutaties van deze module zijn talrijk. Ongeacht de permutatie, de uitvoering van deze activiteit natuurlijk regisseert student om een groot scala van laboratorium-technieken te leren en vertrouwd te raken met een verscheidenheid van apparatuur en instrumentarium.
Samengevat, het lab module hier beschreven kunnen studenten volledig deel te nemen in het proces van de wetenschap, hun vaardigheden te verwerven te ontwikkelen, te analyseren en grafisch reprESENT data en scherpen hun time management en collaboratieve vaardigheden. De module is ontworpen om open onderzoek te vergemakkelijken en is gemakkelijk aan te passen aan de verschillende cursusdata en vaardigheidsniveaus. Opgemerkt moet worden dat de eerste twee auteurs van dit artikel zijn undergraduate biologie majors, wat duidelijk aantoont dat lab module is geschikt voor die populatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs kregen geen financiële of vergelijkbare steun van Motic.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Culture Hood | ESCO Labculture Reliant | Class II Type A2 Biological Safety Cabinet | |
| Waterjactor CO2 Incubator | CEDCO | Model 1510 | |
| Bright-line Hemocytometer | American Optical | with two separate grids | |
| Motic Images Plus | Mac OSX Verison 2.0 or higher | ||
| Gilson Pipetman | Rainin instrument co. inc | P-20D, P-200D, P-1000D | |
| CK30/CK40 Culture Microscope | Olympus | 4 objective inverted light microscope with camera | |
| 200 μl Pipet tips | MidSci | 40200C | |
| 1,000 μl Pipet tips | MidSci | AVR4 | |
| 10 ml Seriological Pipets | TPP | TP94010 | |
| 24 well plates | CoStar- Tissue Culture Cluster | 3524 | 24 wells, 16 mm well diameter, radiation sterilized |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Sigma | T8154 | 100 ml, cell culture tested non-haz |
| Bright-line Hemacytometer replacement coverslip, non-haz | Sigma | Z375357 | |
| Mouse Mammary Tumor(MMT) cells | ATCC | CCL-51 | |
| Eagle Minimum Essentail Medium (EMEM) | ATCC | 30-2003 | 500 ml |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926 | 500 ml |
| Metformin Hydrochloride | Sigma | PHR1084 | 500 mg |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | white or white-yellow powder |
| Curmumin | Sigma | C1386 | yellow-orange powder |
| Aspirin | Sigma | A2093 | meets USP testing specifications |
References
- Hammamieh, R., et al. Students investigating the antiproliferative effects of synthesized drugs on mouse mammary tumor cells. Cell Biol Educ. 4 (3), 221-234 (2005).
- Sykes, J. A., Whitescarver, J., Briggs, L. Observations on a cell line producing mammary tumor virus. J Natl Cancer Inst. 41 (6), 1315-1327 (1968).
- Palombi, P. S. J., Snell, K. Learning about Cells as Dynamic Entities: An Inquiry-Driven Cell Culture Project. Bioscene: Journal of College Biology Teaching. 33, 27-33 (2008).
- Ledbetter, M. L. S., Lippert, M. J. Glucose Transport in Cultured Animal Cells: An Exercise for the Undergraduate Cell Biology Laboratory. Cell Biology Education. 1 (3), 76-86 (2002).
- Weaver, D. Cardiac Cells Beating in Culture: A Laboratory Exercise. American Biology Teacher. 69, 407-410 (2007).
- Marion, R. E., Gardner, G. E., Parks, L. D. Multiweek cell culture project for use in upper-level biology laboratories. Advances in Physiology Education. 36, 154-157 (2012).
- Mozdziak, P. E. P., James, N., Carson, S. usanD. An Introductory Undergraduate Course Covering Animal Cell Culture Techniques. Biochemistry and Molecular Biology Education. 32 (5), 319-322 (2004).
- Anderson, L. W., et al. A taxonomy for learning, teaching and assessing: A revision of Bloom's Taxonomy of educational objectives (Complete Edition). , Longman, London, England. (2001).
- Centers for Disease Contol and Prevention. Appendix A - Primary Containment for Biohazards: Selection, Installation and Use of Biological Safety Cabinets. , (2014).
- Davis, J. M. Basic Cell Culture: A Practical Approach. , 2nd edn, Oxford University Press. Oxford, UK. (2002).
- Algra, A. M., Rothwell, P. M. Effects of regular aspirin on long-term cancer incidence and metastasis: a systematic comparison of evidence from observational studies versus randomised trials. Lancet Oncol. 13 (5), 518-527 (2012).
- Anand, P., Sundaram, C., Jhurani, S., Kunnumakkara, A. B., Aggarwal, B. B. Curcumin and cancer: an 'old-age' disease with an 'age-old' solution. Cancer Lett. 267 (1), 133-164 (2008).
- Ararat, E., Sahin, I., Altundag, K. Mechanisms behind the aspirin use and decreased breast cancer incidence. J BUON. 16 (1), 180 (2011).
- Ararat, E., Sahin, I., Altundag, K. Aspirin intake may prevent metastasis in patients with triple-negative breast cancer. Med Oncol. 28 (4), 1308-1310 (2011).
- Blandino, G., et al. Metformin elicits anticancer effects through the sequential modulation of DICER and c-MYC. Nat Commun. 3, 865 (2012).
- Kunnumakkara, A. B., Anand, P., Aggarwal, B. B. Curcumin inhibits proliferation, invasion, angiogenesis and metastasis of different cancers through interaction with multiple cell signaling proteins. Cancer Lett. 269 (2), 199-225 (2008).
- Burstein, D. E., Blumberg, P. M., Greene, L. A. Nerve growth factor-induced neuronal differentiation of PC12 pheochromocytoma cells: lack of inhibition by a tumor promoter. Brain Res. 247 (1), 115-119 (1982).
- Nazarali, S. A., Narod, S. A. Tamoxifen for women at high risk of breast cancer. Breast Cancer (Dove Med Press). 6, 29-36 (2014).
- Cui, J., et al. Cross-talk between HER2 and MED1 regulates tamoxifen resistance of human breast cancer cells). Cancer Res. 72 (21), 5625-5634 (2012).
- Komm, B. S., Mirkin, S. An overview of current and emerging SERMs. J Steroid Biochem Mol Biol. 143C, 207-222 (2014).
- Kaplan, R. M., Satterfield, J. M., Kington, R. S. Building a better physician--the case for the new MCAT. N Engl J Med. 366 (14), 1265-1268 (2012).
