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Biology

कोर जीवविज्ञान अवधारणाओं सिखाने के लिए माउस स्तन ट्यूमर कोशिकाओं का उपयोग: एक साधारण लैब मॉड्यूल

Published: June 18, 2015 doi: 10.3791/52528
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Natural Sciences, Marymount Manhattan College

Introduction

अक्सर स्नातक सामान्य जीव विज्ञान पाठ्यक्रम में, सेल चक्र विनियमन और कैंसर के विषयों पर छू रहे हैं, लेकिन इन पाठ्यक्रमों में सामग्री की चौड़ाई गहराई के लिए थोड़ा समय छोड़ देता है क्योंकि विस्तृत व्याख्या नहीं। इसके अलावा, स्नातक जीव विज्ञान के छात्रों को आम तौर पर पशु सेल संस्कृति के साथ जुड़े उन्नत तकनीकों को उजागर नहीं कर रहे हैं। लागू करने और वे क्या सीखा है का विश्लेषण करते हुए छात्रों, इन अवधारणाओं की एक गहरी समझ विकसित करने में मदद करने के लिए, एक प्रयोगशाला गतिविधि प्रयोगशाला गतिविधि 1 विस्तृत शोध के वाल्टर रीड आर्मी इंस्टीट्यूट (WRAIR) के एक संशोधन के रूप में विकसित किया गया था। प्रयोगशाला मॉड्यूल न्यायपालिका सेल संकेत दे रास्ते बढ़ रही है और एक कैंसर कोशिका मॉडल निस्र्पक, विकासशील और सेल गिनती के तरीकों को क्रियान्वित करने, विरोधी प्रफलन एजेंटों के साथ कोशिकाओं के इलाज के लिए इष्टतम समय के पाठ्यक्रम और खुराकों की स्थापना, और पहचान भी शामिल है कि एक कदम के लिहाज से, प्रयोगात्मक रणनीति का उपयोग करता है । प्रयोग भी ओपन के लिए अनुमति देता है-ended जांच।

इस गतिविधि के लिए आवश्यक तकनीक का सबसे एक ठेठ जीव विज्ञान शिक्षण प्रयोगशाला में पूरा किया जा सकता है। गतिविधि माउस स्तन ट्यूमर (एमएमटी) सेल लाइन की आकृति विज्ञान और विकास दर, मानव स्तन कैंसर 2 के लिए एक मॉडल निस्र्पक छात्रों के साथ शुरू होता है। स्तन कैंसर की वजह से अपनी आबादी में प्रसार, कॉलेज के आयु वर्ग के छात्रों के लिए अपने परिचित है, और उपलब्ध बड़े पैमाने पर डेटा का मॉडल कैंसर के रूप में चुना गया था। एमएमटी सेल लाइन विशेष रूप से यह अच्छी तरह से होती है, आसानी से प्राप्य है, क्योंकि चयनित एक छोटी दोहरीकरण का समय दिया है और विकसित करने के लिए आसान हो गया है। इसके अलावा, एमएमटी कोशिकाओं एस्ट्रोजन निर्भर सबसे अधिक महिला स्तन कैंसर के साथ संगत है, जो कर रहे हैं। छात्रों को तो जिसका कार्रवाई की व्यवस्था अच्छी तरह से छात्रों को अनुमति देने के लिए विविध रहे हैं दवाओं और उपचार की लंबाई के established.The एकाग्रता है कीमोथेरेपी दवाओं के साथ कोशिकाओं के इलाज से एमएमटी कोशिकाओं में न्यायपालिका सेल संकेत दे रास्ते की पहचानकोशिका विभाजन की दर पर इन चर के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए। इस गतिविधि के लिए कुंजी परख बस दो तरीकों में से एक का उपयोग कर, सेल गिनती की आवश्यकता है जो सेल व्यवहार्यता के लिए दृढ़ संकल्प है। प्रत्येक विधि मजबूत माइक्रोस्कोपी कौशल पर निर्भर करता है। छात्रों को एक मानक, hemocytometer का तरीका है और एक उपन्यास photomicroscopy विधि का उपयोग कर सेल व्यवहार्यता का निर्धारण और प्रस्ताव। उनके निष्कर्षों के आधार पर, वे प्रस्ताव कर सकते हैं और गतिविधि के लिए संशोधन का परीक्षण करें। छात्रों को तो अपने डेटा का प्रतिनिधित्व करते हैं और उनकी परिकल्पना को परिष्कृत और नया प्रयोगात्मक रणनीतियों वसीयत करने के लिए परिणामों की व्याख्या।

इस प्रयोगशाला गतिविधि जैविक विज्ञान में पढ़ाई नए या द्वितीय स्तर के छात्रों के लिए अनुकूल है। यह एक प्रथम वर्ष में सामान्य जीव विज्ञान या दूसरे वर्ष, आणविक / सेलुलर जीव विज्ञान पाठ्यक्रम पूरा किया जा सकता है कि एक एक सप्ताह प्रयोगशाला मॉड्यूल में सघन है। गतिविधि का उचित पूरा करने के लिए आवश्यक कौशल सी की एक सरणी के साथ बुनियादी गणित और बीजगणित, अपनेपन शामिलअयस्क प्रयोगशाला कौशल (जैसे, pipetting, समाधान बनाने, बाँझ तकनीक) सेल संस्कृति और स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर के प्रशिक्षक ज्ञान के साथ-साथ, डेटा विश्लेषण, बुनियादी प्रकाश माइक्रोस्कोपी और समय प्रबंधन,। आवश्यक अभिकर्मकों (उदाहरण के लिए, माउस स्तन ट्यूमर कोशिकाओं, एमएमटी 2), कीमोथेरेपी एजेंटों के कैंसर के लिए एक जानवर सेल लाइन मॉडल शामिल हैं (उदाहरण के लिए, Tamoxifen, curcumin, मेटफार्मिन, और एस्पिरिन), trypan नीले और सेल संस्कृति मीडिया (जैसे, ईगल न्यूनतम आवश्यक मध्यम ; उपयुक्त आपूर्ति करता है (उदाहरण के लिए, दाता घोड़े और भ्रूण गोजातीय सीरम) के साथ EMEM)। (; द्वितीय श्रेणी बीएससी), hemocytometer का, और डिजिटल माइक्रोस्कोपी सॉफ्टवेयर की जरूरत उपकरण एक औंधा प्रकाश डिजिटल कैमरा लगाव, कंप्यूटर, 100 मिमी और 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट, सीओ 2 इनक्यूबेटर (या समतुल्य), जैव सुरक्षा कैबिनेट के साथ माइक्रोस्कोप शामिल हैं।

TEAC करने के लिए पशु सेल संस्कृति पर निर्भर है कि विशिष्ट प्रयोगशाला गतिविधियों का अच्छा उदाहरण हैंकोशिका जीव विज्ञान 3 में अवधारणाओं के बारे में एच स्नातक छात्रों। हालांकि कई (जैसे, रेडियोधर्मी आइसोटोप, जीना पशु ऊतक, उन्नत इमेजिंग उपकरण 1,4,5), (एक 400 स्तर के पाठ्यक्रम 6 के लिए उपयुक्त है, उदाहरण के लिए) काफी उन्नत कर रहे हैं कि प्रोटोकॉल का वर्णन आसानी से सुलभ नहीं हैं कि आपूर्ति या तकनीक की आवश्यकता होती है, या बहु सप्ताह या सेमेस्टर लंबे परियोजनाओं 6,7 की आवश्यकता होती है। यहाँ वर्णित प्रयोगशाला गतिविधि स्पष्ट है और आम प्रयोगशाला उपकरणों के साथ एक ही सप्ताह में आयोजित किया जा सकता है।

सारांश में, इस प्रयोगशाला मॉड्यूल को प्रभावी ढंग से परिचय है या बुनियादी और उन्नत प्रयोगशाला कौशल, प्रयोगात्मक डेटा विश्लेषण, पशु सेल संस्कृति की विधि और वैज्ञानिक प्रक्रिया है, जबकि शिक्षण सेल चक्र, सेलुलर संकेत दे रास्ते और कैंसर की अवधारणाओं को पुष्ट। प्रयोगशाला मॉड्यूल सरल और आर्थिक रूप से सुलभ है और ओपन एंडेड जांच के लिए लचीलापन और अवसर दोनों प्रदान करता है। गतिविधि छात्र रचनात्मकता को प्रोत्साहित करती हैएक नुस्खा एक गाइड के रूप में नहीं बल्कि काम करता है कि एक टेम्पलेट प्रयोगात्मक रणनीति प्रदान करके। यह याद रखने की आवश्यकता के रूप में सबसे महत्वपूर्ण बात यह गतिविधि संतुष्ट खिलता वर्गीकरण 8 की सभी शिक्षण डोमेन, समझ, लागू करने, विश्लेषण, मूल्यांकन और पाठ्यपुस्तक से बाहर है और वैज्ञानिक अनुसंधान की दुनिया में उन्हें खींचती है कि एक प्रक्रिया में छात्रों को उलझाने के द्वारा निर्माण।

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Protocol

नोट: आचार एक द्वितीय श्रेणी जैव सुरक्षा कैबिनेट में कोशिकाओं और सेल संस्कृति अभिकर्मकों के साथ सभी काम (बीएससी) 9। वे जैविक जोखिम कम से मध्यम मुद्रा के रूप में एमएमटी कोशिकाओं, जैव सुरक्षा स्तर मैं के रूप में वर्गीकृत किया जाता है। का उपयोग करता है (उदाहरण के लिए, पराबैंगनी प्रकाश, 70% इथेनॉल के नीचे पोंछ) के बीच बीएससी करने के लिए समुचित सफाई और परिशोधन प्रक्रियाओं को लागू करें।

1. एमएमटी कोशिकाओं को विकसित

  1. पोषक तत्व अमीर 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक ईगल्स न्यूनतम आवश्यक मध्यम (EMEM) के होते हैं कि मीडिया, 2 मिमी glutamine, और 1% antimycotic / एंटीबायोटिक के 10 मिलीग्राम से युक्त 10 सेमी टिशू कल्चर बर्तन में कोशिकाओं (10 इकाइयों पेनिसिलिन बढ़ो 100 माइक्रोग्राम स्ट्रेप्टोमाइसिन, 0.25 माइक्रोग्राम Amphotericin बी)। 37 डिग्री सेल्सियस पर, एक humidified 5% सीओ 2 चैम्बर में कोशिकाओं को पैदा करो। 3.6 x 10 6 कोशिकाओं / 2 सेमी के घनत्व पर प्लेट कोशिकाओं (चरण 2 में कोशिकाओं की गिनती देखें)।
  2. हर 48 बजे यूएनएल ताजा मीडिया के साथ सेल संस्कृति मीडिया के आधे बदलेंईएसएस अन्यथा संकेत दिया। एक औंधा चरण विपरीत प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ परीक्षा द्वारा सेल व्यवहार्यता और आकृति विज्ञान की जाँच करें।
    1. नोट और 100 के तहत आकार, संरचना, आकार, संगठन और अनुमानित संख्या के लिए कोशिकाओं की विशेषताएँ - 200X बढ़ाई। इस घनत्व में, कोशिकाओं एक विमान में प्रकट होना चाहिए, एक दूसरे के ऊपर और पास में clumped नहीं। प्रत्येक कोशिका एक बात करने के लिए आया है कि यह विस्तार से पतली, लंबी, शाखा की तरह एक्सटेंशन के साथ एक मोटी, गोलाकार कोर के होते हैं (चित्रा 1 देखें)।
  3. वे 7.2 x 10 6 कोशिकाओं / 2 सेमी की एक सेल घनत्व तक पहुँच जाने की कोशिकाओं को प्रतिभाग करना। प्रकोष्ठों 1.8 x 10 6 कोशिकाओं / 2 सेमी 24 प्रति घंटे की एक दोहरीकरण दर दिखा रहे हैं। वे विभाजित किया गया है समय की संख्या को निरूपित करने के लिए कोशिकाओं पारित होने एक्स (px) निर्दिष्ट।
    1. पीढ़ी 3 में (यानी, तीन मार्ग, पी 3 के बाद), फसल, गिनती, और 3.6 एक्स 10 6 के घनत्व पर एक 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट पर कोशिकाओं की थाली 2 सेमी ऊपर।
  4. देखें कोशिकाओं को हर दिन और रिकॉर्ड डिजिटल photomicrographs। नोट और सेल आकृति विज्ञान (यानी, आकार, आकृति, प्रकाश चिंतनशील गुण) का वर्णन है। नियमित रूप से कोशिकाओं की गिनती और सेल नंबर करने के लिए बीता हुआ समय संबंधित द्वारा सेल दुगनी समय निर्धारित करते हैं।

2. एमएमटी कोशिकाओं की गणना

नोट: कोशिकाओं subcultured करने की आवश्यकता है, तो यह निर्धारित करने के लिए कोशिकाओं की गणना, एक प्रयोग के लिए स्थापित करने के लिए या सेल व्यवहार्यता का निर्धारण करने के लिए। यहाँ प्रस्तुत दो तरीके हैं।

  1. एक hemocytometer का उपयोग एक मानक तकनीक कोशिकाओं की गिनती करने के लिए।
    1. एक उज्ज्वल ऑनलाइन hemocytometer, trypan नीले रंग, एक यौगिक प्रकाश माइक्रोस्कोप, बाँझ टेस्ट ट्यूब, pipettes और एक मैनुअल सेल काउंटर का एक 0.2% समाधान प्राप्त करते हैं।
    2. बीएससी के तहत, एक 10 सेमी टिशू कल्चर पकवान से कोशिकाओं को दूर करने के लिए एक 10 एमएल पिपेट का उपयोग करें। कोशिकाओं को एक 24 अच्छी तरह से थाली पर हो रहे हैं, तो मीडिया को दूर करने के लिए एक 1 मिलीलीटर पिपेट या 1,000 μl micropipette का उपयोग करें।
    3. एक 15 मिलीलीटर बाँझ ट्यूब (या 1 मिलीलीटर सूक्ष्म अपकेंद्रित्र या अन्य छोटे मात्रा ट्यूब) में जिसके परिणामस्वरूप सेल निलंबन रखें। अन्यथा, मूल ऊतक संस्कृति की थाली में कोशिकाओं को छोड़ / अच्छी तरह से।
    4. एक गैर बाँझ सूक्ष्म अपकेंद्रित्र या अन्य छोटे मात्रा ट्यूब में: (1 अनुपात 1) बीएससी के तहत, trypan नीले समाधान के 10 μl के साथ सेल निलंबन के 10 μl गठबंधन।
      नोट: Trypan नीले स्वस्थ व्यवहार्य कोशिकाओं द्वारा अवशोषित नहीं है कि एक महत्वपूर्ण दाग है। कोशिकाओं को क्षतिग्रस्त कर रहे हैं या मर चुका है, trypan नीले मृत कोशिकाओं की गिनती करने की अनुमति कोशिका में प्रवेश कर सकते हैं (उर्फ अपवर्जन विधि डाई)। व्यवहार्य कोशिकाओं रंग में एक उज्ज्वल और प्रकाश कर रहे हैं, जबकि इसलिए एक खुर्दबीन के नीचे, मृत कोशिकाओं बैंगनी अंधेरा दिखाई देते हैं।
    5. सेते5 मिनट के लिए आरटी पर।
    6. Hemocytometer पर कवर पर्ची रखें। नाली में trypan नीले-सेल निलंबन मिश्रण के 10 μl लागू करें। 200X बढ़ाई - 100 में hemocytometer देखें। एक चार कोने ग्रिड स्पष्ट है (चित्र 2 देखें)।
    7. प्रत्येक gridded क्षेत्र में कुल कोशिकाओं बनाम (बेदाग) व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या की गणना। चार ग्रिडों औसत और कोशिकाओं / एमएल प्राप्त करने के लिए 1 एक्स 10 4 से गुणा करना।
      1. पकवान प्रति कोशिकाओं (या कोशिकाओं / 2 सेमी) की कुल संख्या एक्सट्रपलेशन। 3.6 x 10 6 कोशिकाओं / 2 सेमी के वांछित घनत्व में एक नया टिशू कल्चर प्लेट बीज या प्लेट पर या कुएं में व्यवहार्य कोशिकाओं की कुल संख्या निर्धारित करने के लिए उपयोग करने के लिए सेल निलंबन की सही मात्रा निर्धारित करने के लिए या तो इस नंबर का उपयोग करें।
        नोट: एक hemocytometer के उपयोग पर अतिरिक्त मार्गदर्शन, 10 देखें।
  2. व्यवहार्य कोशिकाओं की गिनती करने के लिए सॉफ्टवेयर और एक डिजिटल कैमरा का उपयोग करें।
    1. एक डि प्राप्तgital कैमरा, उसके साथ सॉफ्टवेयर, trypan नीले रंग, एक यौगिक प्रकाश माइक्रोस्कोप, बाँझ टेस्ट ट्यूब, pipettes और एक कंप्यूटर के एक 0.4% समाधान।
      नोट: यहां कार्यरत है MOTIC सॉफ्टवेयर के साथ साथ एक Moticam 2,000 डिजिटल कैमरा। कोई तुलना कैमरा और सॉफ्टवेयर के लिए पर्याप्त होना चाहिए। डिजिटल कैमरा सॉफ्टवेयर (निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार) अग्रिम calibrated किया गया है कि यह सुनिश्चित करें।
    2. बीएससी के तहत, एक 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर पकवान में बढ़ एमएमटी कोशिकाओं से मीडिया को दूर करने के लिए एक 1 मिलीलीटर pipet या 1,000 μl micropipette का उपयोग करें। धीरे फिर थाली करने के लिए एक छोटी राशि के लिए संयुक्त राष्ट्र के पूरक (यानी, EMEM किसी की खुराक के बिना) ताजा मीडिया के (लगभग 500 μl) को लागू करने के इसे हटाने से पक्षपाती कोशिकाओं को धो लें। अच्छी तरह से करने के लिए सीधे: 0.2% trypan नीले रंग के 10 μl लागू करें (संयुक्त राष्ट्र के पूरक EMEM के साथ 1 1 गिराए द्वारा किए गए)।
    3. 5 मिनट के लिए आरटी पर थाली सेते हैं।
    4. 200X बढ़ाई डब्ल्यू - 100 में खुर्दबीन के नीचे प्लेट देखेंith एक डिजिटल कैमरा संलग्न। 2% trypan नीले रंग के साथ धुंधला भी अंधेरा है अगर प्लेट unsupplemented मीडिया के साथ धोया जा सकता है।
    5. कंप्यूटर एक पर सॉफ्टवेयर खोलें एन डी सॉफ्टवेयर सेटिंग्स टैब के माध्यम से इस्तेमाल उद्देश्य के लिए calibrated है सत्यापित। FOV की एक छवि दिखाई देनी चाहिए।
    6. उपाय टैब से ग्रिड का चयन करें। वर्गों का एक ग्रिड लगभग चौड़ाई में 0.005 सेमी दिखाई देगा। प्रत्येक वर्ग के क्षेत्र पुष्टि करने के लिए ग्रिड की जानकारी का चयन करें।
    7. कोशिकाओं की गिनती करने के लिए ग्रिड के एक विशेष क्षेत्र चुनें (यानी, 5 चौकों एक्स 9 चौकों)। उपाय टैब से आयत का चयन करें। एक वर्ग के कोने पर क्लिक करें और पसंद के चौकों धरना के लिए अपने कर्सर खींचें।
      नोट: हरे रंग की एक छाया चुनाव और चौड़ाई, ऊंचाई, क्षेत्र प्रदान करता है कि कोने में दिखाई देगा एक सफेद बॉक्स, और चुने ग्रिड की धारा की परिधि के चौराहों को कवर किया जाएगा (चित्रा 3 देखें)।
    8. Viab की संख्या की गणनानिर्धारित क्षेत्र के भीतर Le कोशिकाओं। खुर्दबीन के नीचे की थाली ले जाकर एक ही अच्छी तरह से या थाली में दो अन्य स्थानों के लिए एक ही है।
    9. मापा क्षेत्र में ही है और बढ़ाई नहीं बदला है कि सुनिश्चित करें। क्षेत्र के भीतर व्यवहार्य कोशिकाओं की औसत संख्या की गणना। अच्छी तरह से क्षेत्र का उपयोग करना, करने के लिए ग्रिड में चित्रित क्षेत्र से व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या एक्सट्रपलेशन (एक 24 अच्छी तरह से थाली के लिए, एक अच्छी तरह से एक 100 मिमी के लिए क्षेत्र 2 78.6 सेमी है पकवान, 2 2 सेमी का एक क्षेत्र है) अच्छी तरह से (कोशिकाओं / 2 सेमी) के भीतर कोशिकाओं की कुल संख्या।

3. विरोधी प्रफलन एजेंटों के साथ एमएमटी कोशिकाओं का इलाज

  1. चयनित विरोधी प्रफलन चिकित्सीय एजेंट (टेमोक्सीफेन, curcumin और मेटफार्मिन) और बीएससी के तहत वैकल्पिक दवा एस्पिरिन का समाधान तैयार करें।
    1. 27 मिमी के एक शेयर एकाग्रता उत्पन्न करने के लिए 100% इथेनॉल में curcumin और tamoxifen के भंग। Unsupplement में मेटफार्मिन और एस्पिरिन भंगएड EMEM क्रमश: 500 मिमी और 15 मिमी के एक शेयर एकाग्रता उत्पन्न करने के लिए।
  2. एक खुराक प्रतिक्रिया स्थापित करना।
    1. 96 बजे एक खुराक प्रतिक्रिया वक्र उत्पन्न करने के लिए अलग-अलग सांद्रता में तीन विरोधी प्रफलन चिकित्सीय एजेंट (टेमोक्सीफेन, curcumin और मेटफार्मिन) और वैकल्पिक दवा (एस्पिरिन) के साथ एमएमटी कोशिकाओं को समझो। प्रारंभ में प्रकाशित रिपोर्ट 1,11-16 पर आधारित सांद्रता की दूरी पर है और फिर प्रकाशित उन लोगों की तुलना सांद्रता बड़े या छोटे सभी पर दवाओं प्रशासन।
      नोट: एक खुराक प्रतिक्रिया वांछित परिणाम के लिए आवश्यक एक दवा की न्यूनतम एकाग्रता निर्धारित करता है। यहाँ वांछित परिणाम नियंत्रण की तुलना में सेल प्रसार में कमी है।
      1. टेमोक्सीफेन और curcumin के लिए, 0.054 मिमी (1 μl), 0.108 मिमी (2 μl), 0.162 मिमी (3 μl) और 0.216 मिमी (4 μl) की सांद्रता (और इसी मात्रा) का उपयोग करें।
      2. मेटफार्मिन के लिए, 2 मिमी की सांद्रता (और इसी मात्रा) (2 μl का उपयोग), 4 मिमी (4 μl), 6 मिमी (6 μl), 8 मिमी (8 μl) और 10 मिमी (10 μl)।
      3. एस्पिरिन के लिए, 0.030 मिमी (1 μl), 0.060 मिमी (2 μl), 0.099 मिमी (3.3 μl), 0.150 मिमी (5 μl), और 0.216 मिमी (6.7 μl) की सांद्रता (और इसी मात्रा) का उपयोग करें।
    2. 3.6 x 10 6 कोशिकाओं / 2 सेमी की एकाग्रता में एक 24 अच्छी तरह से थाली पर 10 सेमी पकवान से एमएमटी कोशिकाओं विभाजित। दोनों सेल गिनती तरीकों (चरण 2) द्वारा प्रारंभिक सेल एकाग्रता का निर्धारण। कोशिकाओं के इस नए 24 अच्छी तरह से थाली "दिवस स्प्लिट 'कहते हैं।
    3. 24 बजे सेल चढ़ाना के बाद, चरण 3.2.1 में वर्णित सांद्रता में, विरोधी प्रफलन चिकित्सीय एजेंट, Tamoxifen, curcumin, मेटफार्मिन और एस्पिरिन से प्रत्येक के साथ एमएमटी कोशिकाओं का इलाज। "दिवस 0" के रूप में इस पर देखें।
      1. प्रत्येक अच्छी तरह से 500 मीडिया की μl, उपयोग micropipettes बाँझ micropipette के सुझावों के साथ और एक नए सिरे से एक नए तरह सीआर से बचने के लिए इलाज किया जाता है हर बार की एक अधिकतम पकड़ कर सकते हैंओएसएस संदूषण। उपस्थिति 100% इथेनॉल (विलायक नियंत्रण) में उगाई जाने वाली किसी भी दवा उपचार (नकारात्मक नियंत्रण) और कोशिकाओं के अभाव में विकसित कोशिकाओं: दो नियंत्रण के रूप में कुओं का प्रयोग करें।
    4. कोशिकाओं के विकास और कोशिकाओं को हर दूसरे दिन तंग आ चुके हैं जब वर्णित सांद्रता में दवाओं फिर से प्रशासन के 96 घंटे के लिए (1.2 चरण देखें) (जब तक 4 दिन) दिन 1 पर -। उपचार के 4, खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं का निरीक्षण और उपयोग गिनती 2.2 कदम में विधि (चित्रा 4 देखें)।
    5. प्रयोग कम से कम तीन बार दोहराएँ।
    6. प्रयोग की लंबाई से अधिक सेल व्यवहार्यता और दवा की खुराक के बीच संबंध रेखांकन से प्रत्येक दवा के इष्टतम एकाग्रता का निर्धारण (चित्रा 5 देखें)।
  3. एक समय के पाठ्यक्रम की स्थापना करें।
    1. समय अवधि में परिवर्तन के लिए एक निश्चित एकाग्रता में तीन विरोधी प्रफलन चिकित्सीय एजेंट (टेमोक्सीफेन, curcumin और मेटफार्मिन) के साथ एमएमटी कोशिकाओं को समझो। इष्टतम एकाग्रता identif का प्रयोग करेंखुराक प्रतिक्रिया प्रयोगों के माध्यम से आइईडी (चरण 3.2 देखें)।
      1. 0.216 मिमी टेमोक्सीफेन, 0.216 मिमी curcumin के और 10 मिमी मेटफार्मिन: निम्नलिखित सांद्रता का प्रयोग करें।
        नोट: एक दवा अपने इष्टतम वांछित परिणाम का उत्पादन करने के लिए एक समय के पाठ्यक्रम के लिए आवश्यक समय की राशि निर्धारित करता है। इधर, वांछित परिणाम नियंत्रण की तुलना में सेल प्रसार में कमी है।
    2. 3.6 x 10 6 कोशिकाओं / 2 सेमी की एकाग्रता में एक 24 अच्छी तरह से थाली पर 10 सेमी पकवान से एमएमटी कोशिकाओं विभाजित। दोनों सेल गिनती तरीकों (चरण 2) द्वारा प्रारंभिक सेल एकाग्रता का निर्धारण। कोशिकाओं के इस नए 24 अच्छी तरह से थाली "दिवस स्प्लिट 'कहते हैं।
    3. 24 बजे सेल चढ़ाना के बाद, चरण 3.2 में पहचान इष्टतम सांद्रता में, विरोधी प्रफलन चिकित्सीय एजेंट, Tamoxifen, curcumin, मेटफार्मिन और एस्पिरिन से प्रत्येक के साथ एमएमटी कोशिकाओं का इलाज। "दिवस 0" के रूप में इस पर देखें।
      1. प्रत्येक के रूप में अच्छी तरह से, हमें मीडिया के 500 μl की एक अधिकतम पकड़ कर सकते हैंबाँझ micropipette के सुझावों और एक नए सिरे एक नया अच्छी तरह से पार संक्रमण से बचने के लिए इलाज किया जाता है हर बार के साथ ई micropipettes।
      2. उपस्थिति 100% इथेनॉल (विलायक नियंत्रण) में उगाई जाने वाली किसी भी दवा उपचार (नकारात्मक नियंत्रण) और कोशिकाओं के अभाव में विकसित कोशिकाओं: दो नियंत्रण के रूप में कुओं का प्रयोग करें।
  4. कोशिकाओं के विकास और कोशिकाओं को हर दूसरे दिन तंग आ चुके हैं जब चयनित एकाग्रता में दवाओं फिर से प्रशासन के (4 दिन तक) 96 घंटे के लिए (1.2 चरण देखें)। दिन 1 पर - उपचार के 4, खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं का निरीक्षण और 2.2 कदम (चित्रा 4 देखें) में विधि का उपयोग गिनती।
  5. प्रयोग कम से कम तीन बार दोहराएँ।
  6. चयनित एकाग्रता में सेल व्यवहार्यता और नशीली दवाओं के उपचार की लंबाई (समय) के बीच के रिश्ते रेखांकन से प्रत्येक दवा के लिए एमएमटी कोशिकाओं का इष्टतम जोखिम समय का निर्धारण करते हैं (चित्रा 6 देखें)।

4. लैब मॉड्यूल

नोट: निम्न 5 दिन हैप्रयोगशाला मॉड्यूल। चित्रा 7 के लिए प्रयोगशाला अनुसूची अनुसूची 5 दिनों के भीतर करना पड़ेगा क्या का प्रवाह चार्ट है। इस गतिविधि के पांच दिनों में पूरा किया जाना है के लिए एक समय पाठ्यक्रम या एक खुराक प्रतिक्रिया वक्र या तो उत्पन्न होता है। दोनों से घटता उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त समय नहीं है। एक खुराक प्रतिक्रिया प्रयोग नीचे वर्णित है। एक समय के पाठ्यक्रम प्रयोग आसानी से interchanged किया जा सकता है

  1. समूहों में वर्ग विभाजन: एक समूह एक खुराक प्रतिक्रिया और प्रस्तावित खुराक प्रतिक्रिया सांद्रता के बीच में एक एकाग्रता को चुनने अन्य एक समय के पाठ्यक्रम की स्थापना।
    1. उपयुक्त सांद्रता में पर्याप्त संस्कृतियों और दवा कंपनियों के शेयरों को बनाए रखें। जब तक अन्यथा नोट, बीएससी के तहत सभी काम करते हैं।
  2. पहला दिन
    1. सीधी छात्रों को मीडिया बनाने के लिए और (चरण 1 के रूप में) कोशिकाओं को विकसित करने के लिए।
    2. छात्रों को एक 10 सेमी की थाली पर एमएमटी कोशिकाओं के एक शेयर प्राप्त करने के रूप में, छात्रों सेल संस्कृति मीडिया को तैयार करने के लिए प्रत्यक्ष और hemocytome के उपयोग में एक ट्यूटोरियल देआतंकवाद, डिजिटल और माइक्रोस्कोपी (चरण 2 के रूप में) डिजिटल कैमरा माइक्रोस्कोपी सॉफ्टवेयर।
    3. अब निर्माता प्रोटोकॉल का उपयोग कर खुर्दबीन पर इस्तेमाल किया उद्देश्यों (जैसे, 4X, 10X, 20X) के लिए सॉफ्टवेयर जांचना।
  3. दूसरा दिन
    1. छात्रों (चरण 2 के रूप में) कुल सेल नंबर और सेल व्यवहार्यता की पुष्टि की है।
    2. छात्रों को इसी तरह के परिणाम प्राप्त कर रहे हैं पुष्टि करने के लिए, माइक्रोस्कोपी सॉफ्टवेयर और hemocytometer का विधियों दोनों का उपयोग कर 100 मिमी पकवान पर कोशिकाओं गिनती हैं।
    3. सीधी छात्रों (चरण 1 के रूप में) के लिए वांछित शुरू करने सेल चढ़ाना घनत्व के लिए 24 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए 100 मिमी पकवान से एक 24 अच्छी तरह से थाली और विभाजन की कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए। इस दिन विभाजन माना जाता है। 24 घंटे के लिए एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 24 अच्छी तरह से थाली रखें।
  4. तीसरा दिन
    1. एक 24 अच्छी तरह से थाली पर 24 घंटे के लिए एमएमटी कोशिकाओं को विकसित। छात्रों खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं का निरीक्षण और (चरण 2 के रूप में) माइक्रोस्कोपी सॉफ्टवेयर का उपयोग गिनती हैं।
    2. छात्र / ते दे दोकैंसर के इलाज दवा कंपनियों के शेयरों के नमूने हूँ। उन्हें तैयार करने और (चरण 3 में) के रूप में मूल शेयर समाधान पतला है। एक खुराक प्रतिक्रिया वक्र स्थापित करने के लिए उनकी कोशिकाओं को दवाओं के विभिन्न सांद्रता जोड़ें। यह दिवस 0 कहा जाता है।
    3. 48 घंटे की अधिकतम के लिए दवाओं के साथ कोशिकाओं (1.2 चरण) सेते हैं।
  5. 4 दिन
    1. छात्रों को 24 बजे के बाद इलाज कोशिकाओं का निरीक्षण किया है। इस दिन 1 है।
    2. प्रत्येक अच्छी तरह से उपयोग माइक्रोस्कोपी सॉफ्टवेयर गणना। रिकॉर्ड प्रत्येक की तस्वीरें अच्छी तरह से इतना है कि गिनती (चरण 2 के रूप में) प्रयोगशाला के बाहर आयोजित किया जा सकता है।
    3. एक और 24 घंटे के लिए दवाओं के साथ कोशिकाओं (1.2 चरण) सेते हैं।
      नोट: प्रशिक्षक अतिरिक्त ट्यूटोरियल और डेटा विश्लेषण और चित्रमय प्रस्तुति की समीक्षा प्रदान करता है। छात्रों को डेटा संग्रह के अगले दिन के लिए आंकड़े, भूखंड, और सांख्यिकीय विश्लेषण बनाने के लिए सीख लो।
  6. 5 दिन
    1. 48 बजे, 2 दिन के बाद कोशिकाओं छात्रों का इलाज किया है।
    2. प्रत्येक गणनाअच्छी तरह से माइक्रोस्कोपी सॉफ्टवेयर का उपयोग कर। रिकॉर्ड प्रत्येक की तस्वीरें अच्छी तरह से इतना है कि गिनती (चरण 2 के रूप में) प्रयोगशाला के बाहर आयोजित किया जा सकता है।
    3. हार्वेस्ट और (चरण 2 के रूप में) को प्रभावी ढंग से माइक्रोस्कोपी सॉफ्टवेयर विधि का उपयोग करने के लिए छात्र की क्षमता की पुष्टि करने का एक साधन के रूप में पारंपरिक hemocytometer का विधि द्वारा की गिनती के लिए कोशिकाओं को इकट्ठा।
      नोट: तदनुसार, डेटा इकट्ठा करने और निष्कर्ष निकालना या परिकल्पना को संशोधित।

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Representative Results

एमएमटी कोशिकाओं से बढ़ और गिनती विधियों की तुलना।

माउस स्तन ट्यूमर कोशिकाओं को सफलतापूर्वक (चित्रा 1) और MOTIC सॉफ्टवेयर, एक खुर्दबीन के लिए एक डिजिटल कैमरा जुड़े सॉफ्टवेयर प्रोग्राम का उपयोग कर विकसित किया गया एक उपन्यास सेल गिनती विधि हो गई है और विशेषता थे। इस नए सेल गिनती विधि एक hemocytometer (चित्रा 2) को रोजगार एक पारंपरिक गिनती विधि की तुलना में किया गया था और सेल नंबर (तालिका 1) का निर्धारण करने में भी उतना ही सटीक होना दिखाया गया था। कारण विभिन्न विकास की स्थिति या सेल टाइप करने के लिए सेल नंबर पर कोई प्रभाव के लिए नियंत्रित करने के लिए, दो सेल गिनती तरीकों के बीच तुलना विरोधी प्रफलन एजेंटों की उपस्थिति और अनुपस्थिति में और एक अलग सेल लाइन, न्यूरोनल मॉडल PC12 17 के साथ आयोजित किया गया।

चित्रा 3 defin के एक आरोपित ग्रिड का उपयोग कर इस विधि के साथ कोशिकाओं की गिनती के लिए क्षेत्र के चित्रण से पता चलता हैएड आयाम। देखने के लिए ग्रिड क्षेत्र (FOV) के ऊपर रखी है और एक हरे रंग की फ्रेम तो ग्रिड (यानी, 9x5 वर्गों) के एक नामित लंबाई और चौड़ाई के लिए लागू किया जाता है। कोशिकाओं को हरी सीमा के भीतर गिने जाते हैं और प्रोटोकॉल में चर्चा के रूप में कोशिकाओं की संख्या, extrapolated है।

एमएमटी कोशिकाओं के इलाज: विरोधी प्रफलन एजेंटों के लिए एमएमटी कोशिकाओं की खुराक प्रतिक्रिया निर्धारण।

खुराक प्रतिक्रिया स्टडीज (चित्रा 4) प्रत्येक विरोधी प्रफलन एजेंट के लिए आयोजित की गई। इन प्रयोगों डेटा लगातार इकट्ठा किया गया था के दौरान, की समीक्षा की और प्रोटोकॉल के लिए संभव संशोधन warranted रहे थे देखने के लिए अगर विश्लेषण किया। प्रयोग के इसी तरह के परिणाम का उत्पादन प्रत्येक अध्ययन के साथ, तीन बार आयोजित किया गया। सभी कोशिकाओं मर चुके थे जब तक प्रयोग जारी रखा गया या दवाओं के प्रभाव plateaued था। परिणामों की डिजिटल photomicrographs चित्रा 4 में प्रस्तुत कर रहे हैं, और उन निष्कर्षों का एक चित्रमय विश्लेषण प्रस्तुत किया हैचित्रा में 5। प्रभावी एकाग्रता पर्वतमाला चित्रा 5 का एक्स-अक्ष पर और नयाचार अनुभाग में, चित्रा 4 की कथा में रिपोर्ट कर रहे हैं।

टेमोक्सीफेन की सबसे कम एकाग्रता, 0.054 मिमी, अनुपचारित कोशिकाओं (चित्रा -4 ए) की तुलना में लगभग 83% सेल के विकास की मजबूत निषेध नहीं था। सेल व्यवहार्यता टेमोक्सीफेन की बढ़ती सांद्रता (चित्रा 5 ए) के साथ कम करने के लिए जारी रखा। टेमोक्सीफेन का इष्टतम खुराक 48 घंटा पूरा कोशिका मृत्यु कि एकाग्रता (चित्रा -4 ए) पर हुई क्योंकि बाद 0.216 मिमी होने के लिए निर्धारित किया गया था। दिलचस्प है, सेल प्रसार में इन कटौती है कि इन विट्रो सिस्टम मॉडल को रेखांकित साहित्य 18,19 के आधार पर की उम्मीद होगी लेकिन हमेशा पूरी तरह से विवो घटनाओं में प्रतिनिधित्व नहीं करते, जैसा कि tamoxifen के लिए एक सेलुलर प्रतिरोध के कोई संकेत नहीं प्रकट करते हैं। इसके अलावा, जब सबसे कम TRE के साथ विषमक्रमशः, कोशिका विभाजन को रोकने में अधिक प्रभावी curcumin (चित्रा 4 बी और 5 ए) और मेटफार्मिन (चित्रा 4C और 5 ब), टेमोक्सीफेन की सबसे कम एकाग्रता था 9% और 50% की atment सांद्रता।

Curcumin के रूप में अच्छी तरह से कोशिका विभाजन के निषेध पर एक एकाग्रता निर्भर प्रभाव का प्रदर्शन किया। बढ़ रही सांद्रता के साथ, सेल व्यवहार्यता (चित्रा 4D और 5 ए) में एक महत्वपूर्ण कमी आई थी। curcumin के इष्टतम खुराक 0.216 मिमी क्योंकि घंटा 48 के बाद, टेमोक्सीफेन की तरह, कि एकाग्रता में पूरा कोशिका मृत्यु हुई थी होने के लिए निर्धारित किया गया था।

मेटफोर्मिन उपचार सबसे कम एकाग्रता में 33% की कमी करने के लिए अग्रणी, एमएमटी सेल व्यवहार्यता में कम से कम नाटकीय कमी झुकेंगे। बढ़ रही मेटफार्मिन एकाग्रता के साथ सेल व्यवहार्यता में एक सहवर्ती कमी (चित्रा 4C और 5 ब) मनाया गया। मेटफार्मिन का इष्टतम खुराक सर्वोच्च एकाग्रता (1 परीक्षण किया जाना निर्धारित किया गया था0 मिमी)। टेमोक्सीफेन और curcumin, दोनों नियमित रूप से कीमोथेरेपी एजेंट के रूप में इस्तेमाल की तुलना में, मेटफार्मिन सेल चक्र में बाधा 30-40% से भी कम प्रभावी था। दिलचस्प है, कोशिका विभाजन पर मेटफार्मिन के प्रभाव एस्पिरिन के प्रशासन (चित्रा 4D और 5 ए), सेल के विकास के अवरोध का कोई स्पष्ट रूप से पहचान तंत्र के साथ एक चिरायता दवा से प्राप्त उन लोगों के साथ संगत कर रहे थे।

एमएमटी कोशिकाओं के इलाज: विरोधी प्रफलन एजेंटों के लिए एमएमटी सेलुलर प्रतिक्रिया के समय के पाठ्यक्रम का निर्धारण।

एक प्रशासित दवा के प्रभावी खुराक जोखिम के समय से प्रभावित हो सकता है क्योंकि एक समय के पाठ्यक्रम अध्ययन में यह भी प्रत्येक विरोधी प्रफलन एजेंट के लिए आयोजित किया गया। सेल व्यवहार्यता के लिए इस मॉड्यूल assays के रूप में, यह पहली कोशिकाओं (दुगनी समय) तो कोशिकाओं को चुना जा सकता है दवाओं को उजागर कर रहे हैं समय की लंबाई के लिए एक तार्किक खिड़की विभाजित जल्दी कैसे पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है। यह एमएमटी सेल दुगनी समय हो सकता है, इसलिए आवश्यक है,शुरू में कोशिकाओं निस्र्पक जब पता लगाया। इन प्रयोगों के दौरान, डेटा लगातार इकट्ठा की समीक्षा की और प्रोटोकॉल के लिए संभव संशोधन warranted रहे थे देखने के लिए अगर विश्लेषण किया गया था। प्रयोग के इसी तरह के परिणाम का उत्पादन प्रत्येक अध्ययन के साथ, तीन बार आयोजित किया गया। सभी कोशिकाओं मर चुके थे जब तक प्रयोग जारी रखा गया या प्रभाव plateaued था।

समय पाठ्यक्रम के अध्ययन के प्रत्येक विरोधी प्रफलन दवा के अनुकूलित सांद्रता के साथ एमएमटी कोशिकाओं के इलाज से पता चला कि (0.216 मिमी tamoxifen, curcumin के 0.216 मिमी, मेटफार्मिन 10 मिमी) 96 घंटे के लिए पूरी कोशिका मृत्यु के परिणामस्वरूप या नशीली दवाओं के प्रभाव से दूर एक समतल ( चित्रा 6)। एस्पिरिन, "वैकल्पिक" दवा, हमारी खुराक प्रतिक्रिया पढ़ाई में सेल व्यवहार्यता को प्रभावित किया है, प्रभाव मामूली था और इसलिए समय के पाठ्यक्रम के अध्ययन में शामिल नहीं किया गया था।

चित्र 1
चित्रा 1. एमएमटी कोशिकाओं। संशोधित ईगल्स न्यूनतम आवश्यक मध्यम (EMEM) .100X, पैमाने = 0.2 मिमी में 3.6 x 10 6 कोशिकाओं / 2 सेमी से बढ़ी "" स्वस्थ, इलाज माउस स्तन ट्यूमर (एमएमटी) कोशिकाओं की डिजिटल सूक्ष्मदर्शीफ़ोटोग्राफ़, ने संकेत दिया सफेद पट्टी। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2

चित्रा 2। Hemocytometer ग्रिड। Hemocytometer का ग्रिड के सूक्ष्मदर्शीफ़ोटोग्राफ़, 100x। वृत्त (FOV) में दिखाया गया पूरे ग्रिड अनुभाग। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 3। MOTIC सॉफ्टवेयर के साथ गिनती क्षेत्र designating।   माइक्रोस्कोप के माध्यम से देखा के रूप में MOTIC सॉफ्टवेयर के साथ स्थापित एमएमटी कोशिकाओं की गिनती के लिए ग्रिड FOV पर ओवरले और परिभाषित क्षेत्र की छवि। 100X, पैमाने = 0.2 मिमी, सफेद पट्टी द्वारा संकेत दिया। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
विरोधी प्रफलन एजेंटों के लिए एमएमटी कोशिकाओं की चित्रा 4. खुराक प्रतिक्रिया। 96 घंटे के लिए अलग-अलग मात्रा में एंटी-प्रफलन एजेंटों की उपस्थिति में उगाई एमएमटी कोशिकाओं के डिजिटल photomicrographs। Tamoxifen: (ए 1) 0.054 मिमी (ए 2) 0.108 मिमी (ए 3) 0.162 मिमी (ए 4) 0.216 मिमी, Curcumin: (बी 1) 0.054 मिमी (बी 2) 0.108 मिमी (बी 3) 0.162 मिमी (बी 4) .216 मिमी; मेटफोर्मिन: (सी 1) 2 मिमी (सी 2) 4 मिमी (सी 3) 6 मिमी (सी 4) 8 मिमी (सी 5) 10 मिमी; एस्पिरिन: (डी 1) .030 मिमी (डी 2) 0.060 मिमी (डी 3) 0.099 मिमी (D4) 0.150 मिमी (D5) 0.216 मिमी, इथेनॉल (100%) और इलाज दोनों नियंत्रण कर रहे हैं। 100X, पैमाने = 0.1 मिमी, ग्रिड के भीतर प्रत्येक वर्ग को बनाने नीली लाइनों द्वारा संकेत दिया। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5 ए

चित्रा 5 बी

विरोधी प्रफलन एजेंटों के लिए एमएमटी कोशिकाओं की खुराक प्रतिक्रिया प्रयोगों की चित्रा 5. ग्राफिकल प्रतिनिधित्व है। विरोधी प्रफलन एजेंटों एमएमटी सेल व्यवहार्यता पर (ए) टेमोक्सीफेन, curcumin, एस्पिरिन, और (बी) मेटफार्मिन की सांद्रता में वृद्धि के प्रभाव। परिणाम एकसेल उपचार 96 बजे तक जारी रहा, हालांकि इलाज के 48 बजे के बाद नियंत्रण का एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त कर रहे हैं। एन = 3, एसटीडी संकेत दिया है।

चित्रा 6
विरोधी प्रफलन एजेंटों के लिए एमएमटी सेलुलर प्रतिक्रिया के समय के पाठ्यक्रम के विश्लेषण के 6 चित्रा ग्राफिकल प्रतिनिधित्व है। 96 से अधिक एमएमटी सेल व्यवहार्यता पर टेमोक्सीफेन के प्रभाव (0.216mM), curcumin (0.216mM), और मेटफार्मिन (10 मिमी) के समय पाठ्यक्रम का अध्ययन बजे। परिणाम इलाज के 48 बजे के बाद नियंत्रण का एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त कर रहे हैं। एक प्रतिनिधि प्रयोग के परिणाम, एन = 1 यहाँ हैं दिखाया गया है।

चित्रा 7
5 दिन प्रयोगशाला मॉड्यूल के 7. फ्लो चार्ट चित्रा।

सेल प्रकार ड्रग Administereघ प्रयोग के दिन दवा की एकाग्रता MOTIC के साथ कोशिकाओं की संख्या Hemocytometer के साथ कोशिकाओं की संख्या
एमएमटी इलाज दूसरा दिन - 7.8x10 4 कोशिकाओं / 2 सेमी 8.0x10 4 कोशिकाओं / 2 सेमी
एमएमटी इथेनॉल दूसरा दिन 10 मिमी 7.1x10 4 कोशिकाओं / 2 सेमी 7.2x10 4 कोशिकाओं / 2 सेमी
एमएमटी Tamoxifen दूसरा दिन 0.216 एम.एम. 0 कोशिकाओं / 2 सेमी 0 कोशिकाओं / 2 सेमी
एमएमटी Tamoxifen दूसरा दिन 0.054 मिमी 1.3x10 4 कोशिकाओं / 2 सेमी 1.5x10 4 कोशिकाओं / 2 सेमी
एमएमटी Curcumin दूसरा दिन 0.054 मिमी 1.9x10 4 गएल / 2 सेमी 2.0x10 4 कोशिकाओं / 2 सेमी
एमएमटी Curcumin दूसरा दिन 0.216 मिमी 0 कोशिकाओं / 2 सेमी 0 कोशिकाओं / 2 सेमी
एमएमटी मेटफोर्मिन दूसरा दिन 2 मिमी 5.1x10 4 कोशिकाओं / 2 सेमी 5.2x10 4 कोशिकाओं / 2 सेमी
एमएमटी मेटफोर्मिन दूसरा दिन 6 मिमी 3.4x10 4 कोशिकाओं / 2 सेमी 3.5x10 4 कोशिकाओं / 2 सेमी
एमएमटी एस्पिरिन दूसरा दिन 0.099 मिमी 2.8x10 4 कोशिकाओं / 2 सेमी 3.0x10 4 कोशिकाओं / 2 सेमी
PC12 इलाज विभाजित करें - 2.5x10 4 कोशिकाओं / 2 सेमी 2.1x10 4 कोशिकाओं / 2 सेमी

तालिका 1। MOTIC सॉफ्टवेयर या hemocytometer के तरीकों का उपयोग कर या तो hemocytometer और विधियों की गिनती MOTIC सॉफ्टवेयर। एमएमटी कोशिकाओं के सेल गिनती के परिणाम, की तुलना। दोनों इलाज और इलाज कोशिकाओं की गिनती की है, साथ ही एक नियंत्रण के रूप में एक अलग सेल लाइन, PC12 थे।

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Discussion

एक प्रयोगशाला मॉड्यूल पशु सेल संस्कृति की उन्नत तकनीकों के माध्यम से कोशिका जीव विज्ञान में विषयों की एक किस्म को पढ़ाने के लिए करना है कि प्रस्तुत किया है। मॉड्यूल मानव स्तन कैंसर के मॉडल है कि कोशिकाओं की प्रतिकृति पर विरोधी प्रफलन रसायनों की एक संख्या के प्रभाव का विश्लेषण करके यह प्राप्त होता है। प्राथमिक परख सेल गिनती के मौलिक तकनीक पर निर्भर करता है और माइक्रोस्कोपी सॉफ्टवेयर का उपयोग कोशिकाओं की गिनती करने के लिए एक उपन्यास रास्ते का परिचय। मॉड्यूल शामिल गतिविधियों के साधन और सबसे जीव विज्ञान कार्यक्रमों में उपलब्ध उपकरणों के साथ आयोजित किया जा सकता है। मॉड्यूल सस्ती और आसानी से प्राप्त कर रहे हैं कि आपूर्ति के साथ एक 5 दिन की अनुसूची में लागू किया जा सकता है। डिजिटल माइक्रोस्कोप कैमरा और माइक्रोस्कोपी सॉफ्टवेयर की एक विशेष ब्रांड के यहाँ (MOTIC सॉफ्टवेयर) का इस्तेमाल किया जाता है, किसी भी तुलनीय कैमरा और सॉफ्टवेयर पर्याप्त होना चाहिए।

इस प्रयोगशाला मॉड्यूल मानव स्तन कैंसर के लिए एक मॉडल के रूप में एमएमटी कोशिकाओं का इस्तेमाल करता है। छात्रों को पहले से बढ़ने और इन चिह्नित करने के लिए सिखाया जाता हैसंस्कृति में कोशिकाओं। यह इस प्रयोगशाला मॉड्यूल की है कि सफल समापन को रेखांकित करने के लिए महत्वपूर्ण है अच्छी तरह से अनुपचारित एमएमटी कोशिकाओं नियंत्रण के रूप में सेवा करते हैं, विशेष रूप से स्वस्थ एमएमटी कोशिकाओं की उपस्थिति और व्यवहार से परिचित हो (छात्रों उर्फ) जांचकर्ताओं की आवश्यकता है। उचित खुराक प्रतिक्रिया और समय बेशक डेटा उत्पन्न करने के लिए कर रहे हैं अगर सेल के विकास के पैटर्न की इसलिए पूरी तरह से लक्षण, दुगनी समय और एमएमटी कोशिकाओं की सामान्य आकृति विज्ञान आवश्यक है।

एक बार की विशेषता, एमएमटी कोशिकाओं तो कोशिका विभाजन, कोशिका चक्र विनियमन, सेल संकेतन और कैंसर के विषयों के शिक्षण का एक साधन के रूप में विभिन्न विरोधी प्रफलन एजेंटों के लिए उनकी प्रतिक्रिया के लिए परीक्षण किया गया। सेल व्यवहार्यता कोशिकाओं पर इन दवाओं के प्रभाव को समझने के लिए प्रयोग किया जाता है। एक माइक्रोस्कोप की मुहिम शुरू की डिजिटल कैमरा के साथ जुड़े सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, कोशिकाओं की गिनती के एक उपन्यास विधि, का आयोजन किया और इसकी शुद्धता को सत्यापित करने के लिए एक पारंपरिक गिनती hemocytometer आधारित प्रक्रिया की तुलना में है। थीउपन्यास विधि यह स्नातक शिक्षण प्रयोगशालाओं में प्रयोग किया जाता है, क्योंकि विशेष रूप से उल्लेखनीय हैं जो दो फायदे, प्रदान करता है। कोशिकाओं की गिनती के लिए टिशू कल्चर की थाली से हटा दिया जाना चाहिए नहीं है के बाद से सबसे पहले, कम समय मुख्य प्रयोगात्मक परख प्रदर्शन करने की जरूरत है। इस प्रयोगात्मक चर की एक बड़ी संख्या में एक ही बार में और एक सीमित समय अवधि में परीक्षण किया जा करने के लिए अनुमति देता है। दूसरा, विधि छात्रों परिणामों का मूल्यांकन और प्रयोगशाला के बाहर उनके प्रयोगात्मक रणनीति को परिष्कृत करने के लिए अनुमति प्रयोगात्मक उपचार के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया की एक डिजिटल रिकॉर्ड प्रदान करता है।

इन गिनती तरीकों में से दोनों को लागू करने के लिए जब नोट करने के लिए कई मुद्दे हैं। पहला, या तो विधि के साथ कोशिकाओं की गिनती करने से पहले, कोशिकाओं को एक व्यवहार्य सेल और एक मृत सेल के बीच भेद करने के लिए trypan नीले रंग के साथ incubated रहे हैं। मृत कोशिकाओं डाई से प्रवेश कर और व्यवहार्य कोशिकाओं उज्ज्वल सफेद होते हैं, जबकि गहरे नीले रंग दिखाई देते हैं। हालांकि, कोशिकाओं डी वाई के साथ incubated रहे हैंकी सिफारिश की ऊष्मायन अवधि से परे ई, वे अधिक से सना हुआ और भेद करना मुश्किल हो जाएगा। दूसरा, एमएमटी कोशिकाओं hemocytometer या टिशू कल्चर प्लेट पर पेड़ों का झुरमुट और व्यक्तिगत रूप से गिनती करने के लिए मुश्किल हो सकता है। इसलिए, एक "पेड़ों का झुरमुट" (उदाहरण के लिए, 10 कोशिकाओं / पेड़ों का झुरमुट) ग्रिड पर मौजूद है और हर पेड़ों का झुरमुट तो गिनती के दौरान उस संख्या से गुणा किया जाता है कोशिकाओं की एक निश्चित संख्या में शामिल करने के लिए नामित किया गया है। अंत में, एमएमटी कोशिकाओं वे बड़े हो रहे हैं, जिसमें व्यंजनों की सतह का पालन करें। यह कोशिकाओं को हटाने जब थाली करने के लिए सीधे pipet के टिप को छूने और सेल clumps को तोड़ने के लिए और संभव के रूप में की थाली से कई के रूप में कोशिकाओं को हटाने के लिए बल लागू करने के लिए आवश्यक है। नतीजतन यह परंपरागत hemocytometer का विधि का उपयोग करते समय एक सटीक गणना प्राप्त करने के लिए कई प्रयास ले मेरी।

कोशिकाओं को अच्छी तरह से विशेषता है और गिनती विधियों सत्यापन के बाद, दो अलग-अलग प्रयोगों का आयोजन किया जाता है; अलग सांद्रता के प्रभाव की एक खुराक प्रतिक्रिया का अध्ययनएमएमटी कोशिका विभाजन और एक समय के पाठ्यक्रम प्रयोग पर विरोधी प्रफलन दवाओं के इन दवाओं के लिए जोखिम के इष्टतम समय स्पष्ट करने के लिए। परीक्षण और त्रुटि के लिए आवश्यक है और प्राथमिक साहित्य के आवेदन एक सफल प्रयोग के लिए आवश्यक है के रूप में ये बेहद शिक्षाप्रद प्रयोग कर रहे हैं। उदाहरण के लिए, इन विरोधी प्रफलन एजेंटों के लिए एमएमटी कोशिकाओं की एक खुराक प्रतिक्रिया elucidating में आरंभिक प्रयास में 100% कोशिका मृत्यु औषधि प्रशासन के 24 घंटे के भीतर वहां गया था के रूप में परीक्षण सांद्रता, बहुत अधिक थे कि पता चला। साहित्य की एक विस्तृत समीक्षा उपचार सांद्रता का संशोधित श्रृंखला के लिए नेतृत्व किया। यह प्रभावी रूप से प्राथमिक साहित्य लेख, साहित्य डेटाबेस का उपयोग पढ़ें, विश्लेषण और आलोचना करने के लिए कैसे छात्रों को सिखाता है और उन कौशल वैज्ञानिक प्रक्रिया के लिए आवश्यक हैं कि कैसे रेखांकित करता है।

खुराक प्रतिक्रिया के अध्ययन के परिणाम tamoxifen के सभी परीक्षण सांद्रता में सबसे मजबूत विरोधी प्रफलन प्रभाव दर्शाती है कि पता चला है। Tamoxifen, एक विरोधी mitotiसी दवा है, जो आम तौर पर, हार्मोन के प्रति संवेदनशील रोगियों 18-20 रजोनिवृतोत्तर में एस्ट्रोजन संवेदनशील कैंसर के लिए एक विरोधी एस्ट्रोजन चिकित्सा के रूप में विशेष रूप से प्रयोग किया जाता है। दवा वर्तमान में एक स्तन कैंसर के उपचार के रूप में प्रयोग किया जाता है। Tamoxifen इंट्रासेल्युलर एस्ट्रोजन रिसेप्टर के लिए एस्ट्रोजन के साथ प्रतिस्पर्धा और बाध्य करते हैं, तो नीचे डी cyclins और बी, कोशिका चक्र के दो महत्वपूर्ण नियामकों की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है। गतिविधि में प्राप्त परिणामों tamoxifen के सफलतापूर्वक एस्ट्रोजन रिसेप्टर को बंधुआ और मनाया कमी आई सेल प्रसार, जिसके परिणामस्वरूप सेल चक्र के माध्यम से सेल की प्रगति हिचकते कि सलाह देते हैं। साहित्य के आधार पर की उम्मीद होगी के रूप में दिलचस्प है, प्रशासित टेमोक्सीफेन के सभी सांद्रता भर एमएमटी सेल प्रसार की दरों में कमी (उदाहरण के लिए 19 देखें), tamoxifen के लिए सेलुलर प्रतिरोध के कोई संकेत नहीं प्रकट करते हैं। इस प्रयोग का आयोजन किया गया, जिसमें इन विट्रो शर्तों को पूरी तरह से नहीं मॉडल है कि मैं एक अच्छा चेतावनी के रूप में कार्य करता हैएन परिस्थितियों vivo।

एमएमटी कोशिकाओं के Curcumin इलाज भी सेल व्यवहार्यता की कमी हुई। Curcumin एक सेल के विकास के अवरोध करनेवाला 12,16 के रूप में Tumeric जड़ और कृत्यों से ली गई एक यौगिक है। यह नीचे विनियमन एनएफ-कापा बी मार्ग और ओर्निथिन decarboxylase (ODC) गतिविधि के द्वारा काम करता है। एनएफ-कापा बी एपोप्टोसिस रोकना है कि प्रोटीन के लिए कोड है जो विरोधी apoptotic जीन ऐसे TRAF1 और TRAF2 के प्रतिलेखन को नियंत्रित करता है कि एक प्रोटीन जटिल है। ODC polyamines, बढ़ाया सेल के विकास के लिए अग्रणी पोषण की बढ़ स्रोतों के साथ कैंसर की कोशिकाओं को प्रदान करते हैं कि प्रोटीन के उत्पादन को उत्प्रेरित करता है कि एक एंजाइम है। दवा एक स्तन कैंसर के इलाज के रूप में वर्तमान में उपयोग में है। curcumin के विरोधी प्रफलन प्रभाव स्पष्ट रूप से कोशिका विभाजन पर एनएफ-कापा बी और ओर्निथिन decarboxylase से जुड़े सेल संकेतन मार्ग के नियमन गया है नीचे उस प्रभाव को दर्शाता है।

कम सेल व्यवहार्यता इसी तरह मेटफार्मिन treatme के साथ मनाया गयाNT। प्रकाशित रिपोर्ट मेटफार्मिन और स्तन कैंसर के 15 में से एक कम भार ले वाले मरीजों के बीच एक संबंध का सुझाव क्योंकि मेटफोर्मिन, आम तौर पर द्वितीय मधुमेह टाइप करने के लिए प्रशासित एक दवा, चुना गया था। यह एजेंट सी-MYC जीन modulates का मानना ​​था कि और इस तरह एक तेज दर से चक्र के माध्यम से प्रगति करने के लिए कोशिकाओं, cyclins, कोशिका चक्र के भीतर जांच की चौकी के रूप में सेवा है कि अणुओं की cyclin डी अप-नियमन की गतिविधि नीचे नियंत्रित करता है की अनुमति देता है बढ़ी हुई कोशिकाओं के विभाजन और वृद्धि हो जाती है। सी-MYC जीन के मॉडुलन भी cyclin डी के नीचे विनियमन और कोशिका विभाजन में कमी आती है कि कैसे एमएमटी कोशिकाओं पर मेटफार्मिन उपचार के प्रभाव का पता चलता है। मेटफार्मिन डेटा आगे एक दवा Diabetes- अन्य न्यायपालिका शारीरिक घटनाओं के लिए उपयुक्त कार्रवाई का एक तंत्र हो सकता है कि इस मामले में एक condition- के लिए बनाया गया है कि कैसे एक मिसाल है। इसके अलावा, यह टेमोक्सीफेन, curcumin, और मेटफार्मिन हालांकि सभी असामान्य सेलुलर prolif मंदबुद्धि कि रेखांकित करने के लिए महत्वपूर्ण हैअलग तंत्र के माध्यम से eration, प्रत्येक सफलतापूर्वक सेल आबादी में कमी आई है और इन विट्रो में कोशिका विभाजन के साथ दखल दिया।

इस मॉड्यूल भी है कि एक और दवा में ओपन एंडेड जांच, हर्बल उपचार के लिए अनुमति देता है, या एजेंट का परीक्षण किया जा सकता है। एस्पिरिन, एक ओवर-द-काउंटर एनाल्जेसिक, ज्वरनाशक, और हल्के दर्द को राहत देने और बुखार को कम करने के लिए इस्तेमाल किया विरोधी सूजन दवा इस मॉड्यूल में चुना गया था। सूजन को कम करने के लिए एस्पिरिन की क्षमता उन्हें पोषण कि नई रक्त वाहिकाओं के विकास को धीमा और उनके विकास 11,13,14 कि ईंधन स्टेम कोशिकाओं के साथ हस्तक्षेप से ट्यूमर के विकास को बाधित कर सकते हैं। दिलचस्प है, कोशिकाओं एमएमटी के लिए एस्पिरिन की प्रशासन सेल व्यवहार्यता में कुछ कमी का परिणाम था। कई correlative पढ़ाई प्रेरणा रिश्तों बनाम correlative का एक उत्कृष्ट उदाहरण प्रदान करने, 13,14 रिपोर्ट कर रहे हैं, हालांकि लिटिल कैंसर की रोकथाम और उपचार में एस्पिरिन की भूमिका के बारे में जाना जाता है।

समयपाठ्यक्रम के अध्ययन के लिए अनुकूलित खुराक पर दिलाई, जब विरोधी प्रफलन दवाओं प्रारंभिक निवेश के 4 दिनों के भीतर कोशिकाओं के विभाजन के साथ हस्तक्षेप पर अत्यधिक प्रभावी रहे हैं, कि पता चला। इन अध्ययनों से भी इन प्रयोगों के संचालन के लिए एक प्रयोगात्मक रणनीति तैयार करने के लिए जब वे एमएमटी सेल के विकास विशेषताओं के बारे में क्या सीखा है का उपयोग करने के लिए छात्रों के लिए एक अवसर प्रदान करते हैं। वास्तव में, अच्छी तरह से समय और एमएमटी कोशिकाओं की सामान्य सेल आकृति विज्ञान दोहरीकरण, सेल के विकास के पैटर्न निस्र्पक दोनों सही खुराक प्रतिक्रिया और समय बेशक डेटा के लिए आवश्यक है।

दोनों खुराक प्रतिक्रिया और समय के पाठ्यक्रम के अध्ययन दवा एकाग्रता और क्रमशः जोखिम का समय है, और एक जैविक प्रणाली में एक दवा है प्रभाव के बीच संबंधों को निर्धारित करते हैं। यह जांच आधारित अनुसंधान गतिविधियों के संचालन, जबकि जैव रसायन में intermolecular बातचीत और अन्य मूलभूत अवधारणाओं के बारे में सोच छात्रों को पाने के लिए एक शानदार तरीका है। यह ध्यान देने योग्य है कि कई द्वि के बादology की बड़ी कंपनियों के मेडिकल स्कूल में भाग लेने की योजना है, इस प्रयोगशाला मॉड्यूल मेडिकल स्कूल आवश्यकताओं 21 में नव की स्थापना में परिवर्तन के साथ अच्छी तरह से संरेखित करता है।

इस प्रयोगशाला मॉड्यूल में वर्णित के रूप में बिल्कुल लागू किया जा सकता है या आसानी से एक टेम्पलेट के रूप में सेवा कर सकते हैं। बदलाव की एक मेजबान के इस तरह के विकास में मीडिया में विरोधी प्रफलन एजेंट की पसंद है, सेल प्रकार या पोषक तत्व संशोधन के रूप में इस गतिविधि में शामिल किया जा सकता है। जब तक एक परिकल्पना सेल या सामान्य जीव विज्ञान के क्षेत्र में मौलिक और आधुनिक अवधारणाओं कि परीक्षण विकसित की है, के रूप में इस मॉड्यूल के क्रमपरिवर्तन कई हैं। भले ही क्रमपरिवर्तन का, इस गतिविधि के कार्यान्वयन के लिए स्वाभाविक रूप से प्रयोगशाला तकनीकों का एक बड़ा सरणी जानने के लिए और उपकरण और उपकरण की एक किस्म के साथ परिचित बनने के लिए छात्र निर्देशन।

सारांश में, यहाँ वर्णित प्रयोगशाला मॉड्यूल छात्रों को पूरी तरह से विज्ञान की प्रक्रिया में भाग प्राप्त करने के लिए उनकी क्षमता विकसित करने, विश्लेषण और रेखांकन repr करने के लिए अनुमति देता हैडेटा esent, और अपने समय का प्रबंधन और सहयोगात्मक कौशल सान। मॉड्यूल ओपन एंडेड जांच की सुविधा के लिए बनाया गया है और विभिन्न पाठ्यक्रम कार्यक्रम और कौशल के स्तर को आसानी से अनुकूल है। यह इस पत्र के पहले दो लेखकों को स्पष्ट रूप से इस प्रयोगशाला मॉड्यूल है कि जनसंख्या के लिए उपयुक्त है कि प्रदर्शन, स्नातक जीव विज्ञान की बड़ी कंपनियों रहे हैं कि ध्यान दिया जाना चाहिए।

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Disclosures

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tissue Culture Hood ESCO Labculture Reliant Class II Type A2 Biological Safety Cabinet
Waterjactor CO2 Incubator CEDCO Model 1510
Bright-line Hemocytometer American Optical with two separate grids
Motic Images Plus Mac OSX Verison 2.0 or higher
Gilson Pipetman Rainin instrument co. inc P-20D, P-200D, P-1000D
CK30/CK40 Culture Microscope Olympus 4 objective inverted light microscope with camera
200 μl Pipet tips MidSci 40200C
1,000 μl Pipet tips MidSci AVR4
10 ml Seriological Pipets TPP TP94010
24 well plates CoStar- Tissue Culture Cluster 3524 24 wells, 16 mm well diameter, radiation sterilized
Trypan Blue Solution 0.4% Sigma T8154 100 ml, cell culture tested non-haz
Bright-line Hemacytometer replacement coverslip, non-haz Sigma Z375357
Mouse Mammary Tumor(MMT) cells ATCC CCL-51
Eagle Minimum Essentail Medium (EMEM) ATCC 30-2003 500 ml
Fetal Bovine Serum Sigma F0926 500 ml
Metformin Hydrochloride Sigma PHR1084 500 mg
Tamoxifen Sigma T5648 white or white-yellow powder
Curmumin Sigma C1386 yellow-orange powder
Aspirin Sigma A2093 meets USP testing specifications

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References

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McIlrath, V., Trye, A., Aguanno, A. Using Mouse Mammary Tumor Cells to Teach Core Biology Concepts: A Simple Lab Module. J. Vis. Exp. (100), e52528, doi:10.3791/52528 (2015).

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