诱导小鼠肠道炎症由效应CD4的过继转移 Published: April 21, 2015 doi: 10.3791/52533

DOI

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Erin C. Steinbach^1,2, Gregory R. Gipson¹, Shehzad Z. Sheikh^1,3,4

¹Center for Gastrointestinal Biology and Disease, University of North Carolina at Chapel Hill, ²Department of Microbiology and Immunology, University of North Carolina at Chapel Hill, ³Department of Genetics, University of North Carolina at Chapel Hill, ⁴Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina at Chapel Hill

Abstract

有可用于研究人炎性肠疾病（IBD），每个都有其自己的优点和缺点的发病许多不同的动物模型。我们在这里描述通过过继转移的同源脾的CD4 ⁺ CD45RB ^高 T细胞的成T和B细胞缺陷型受体小鼠启动的一个实验性结肠炎模型。在CD4 ⁺ CD45RB ^高 T细胞群在很大程度上是由幼稚效应细胞能够诱导的慢性肠道炎症，非常类似于人类IBD的关键环节。这种方法可以被操纵来研究疾病发作和进展的方面。此外，它可以被用来研究先天，自适应的功能，以及调节免疫细胞群，和环境暴露的作用，也就是说 ，该微生物群，在肠道炎症。在这篇文章中，我们阐述了诱导结肠炎一步一步的协议的方法。这INC吕代的成功开发实验性结肠炎的研究目的这个小鼠模型所需要的关键技术环节的视频演示。

Protocol

注：确保所有的动物协议通过并符合机构动物护理和使用委员会（IACUC）的规定和国家研究委员会的指南实验动物的护理和使用的批准。供体小鼠可以是男性或女性，但受体小鼠应该是雄性。如果女性收件人使用，供体小鼠必须是女性^5。使用常规的，非无菌床上用品和非酸化水中维持菌落，因为这些可能会影响肠道菌群，并且因此，小鼠^5,6的结肠炎的表型。

1.实验准备

1. 用冰冷的媒体和缓冲区。保持整个实验的细胞在冰上。
2. 执行使用无菌技术的实验在无菌生物危害罩。

2.分离脾T细胞的

1. 安乐死捐助鼠标/鼠标在CO ₂室其次是宫颈dislocatioñ。喷腹部用70％乙醇。
2. 做水平切口在腹部和剥离皮肤暴露腹膜。持有腹膜远离内脏的镊子，并在左腹部腹膜切口暴露和切除脾脏。
3. 放置在10ml完全培养基的脾脏在培养皿。删除和脾丢​​弃多余的组织。
4. 使用2消毒玻片破碎，梳理出脾成单细胞悬液。通过一个70微米的过滤器过滤细胞悬浮到50ml锥形管中，并冲洗过滤用5ml完全培养基中。放置最多5脾脏在一个50ml锥形管中。
5. 离心细胞，在450×g离心7分钟。浇关闭或通过真空抽吸到废物容器弃上清。
6. 轻轻重悬细胞于每裂解液脾5毫升以裂解红血细胞，在室温下10分钟。加完整的媒体等体积（每脾5ml）中的管中。
7. 轻轻重悬细胞于10ml标记缓冲液。
8. 细胞计数台盼蓝排斥。
   1. 除去20微升细胞悬浮液，并加入到180微升台盼蓝到微量离心管中并充分混合。 5分钟后，添加10微升标记的细胞，以血球和在显微镜下计数非蓝色的细胞。确定存活细胞的总数。丢弃电池/台盼蓝组合。
9. 离心细胞在10ml标记缓冲液中，在450×g离心7分钟。浇关闭或通过真空抽吸到废物容器弃上清。

3.富集CD4 ^{+ T}细胞的

注：按照制造商的说明在本节中使用的特定产品。

1. 轻轻悬浮细胞，以20×10 ⁶个细胞/ ml，在寒冷的标签单细胞悬浮液ING缓冲。
2. 添加5μl的每1×10 ⁶个细胞的生物素化的CD4 T细胞富集的抗体。孵育细胞在冰上15分钟。
3. 加入10倍体积标记缓冲液中。离心细胞，在450×g下7分钟。小心吸全部采用真空吸进废物容器上清。
4. 彻底涡旋链霉亲和共轭磁性粒子。添加5μl的每1×10 ⁶个细胞的颗粒。
5. 调匀而是轻轻。保持混合物在6-12℃下进行30分钟。
6. 添加标记缓冲液至20-80×10 ⁶细胞/ ml的浓度。发送上行至1.0ml每12×75mm的圆底试管标记的细胞（称为“阳性馏分管”）。
7. 放置在磁铁每个正分数管6-8分钟。
8. 与正馏分管仍然在磁铁，小心地从阳性馏分管与玻璃巴斯德吸管转移上清至新的无菌50ml锥形管（referred，来作为“富集级分”）。这种富集的馏分含有CD4 ^{+ T}细胞。要小心，不要破坏吸引到磁铁的标记细胞。
9. 留在标记缓冲液的相同体积的正馏分管悬浮细胞如在步骤3.6通过上下吹打大力。将积极分数管回磁铁6-8分钟。
10. 阳性馏分管仍然在磁铁，小心地从阳性馏分管与玻璃巴斯德吸管转移上清液（富集馏分，CD4 ^+），以无菌50ml锥形管中，从步骤3.8而不破坏附着到磁体的细胞。
11. 重复步骤3.9-3.10增加获得CD4 ^{+ T}细胞的产率。使用富集级分（CD4 ⁺细胞）继续协议。

4.标签和分类 ​​细胞⁷

1. 离心富集的细胞在450×g离心7分钟。浇过或真空suct弃上清离子进入废物容器。
2. 重悬的细胞在1ml标记缓冲液。去除细胞等分计算和台盼蓝染色，以评估细胞活力按照步骤2.9。
3. 标记缓冲液的体积加至10×10 ⁶个细胞/ ml;如果细胞是已经<10×10 ^6，离心机在450×g离心7分钟，弃上清通过倾倒或关闭真空抽吸到废物容器中，并标记缓冲液的添加量至10×10 ⁶个细胞/ ml。
   1. 设置的各约5-10×10 ^5个细胞的等分试样单独对未染色，同种型染色，并且单染色的对照细胞在微量离心管中。
4. 添加5微克/毫升的CD4-FITC和1微克/毫升CD45RB-PE到细胞中。加同种型对照染色和单污渍以相同的浓度到合适的离心管中的等分试样。拌匀，但轻轻地，并培育冰上避光30分钟。
5. 加入10倍体积标记缓冲液的细胞和控制秒。离心机450 XG 7分钟。弃上清通过真空抽吸到废物容器。
6. 在标记缓冲液悬浮体积步骤4.5。离心机450 XG 7分钟。弃上清通过真空抽吸到废物容器。
7. 在标记缓冲液重悬，以10×10 ⁶个细胞/ ml。通过70微米的过滤器进入FACS管传递细胞。置于冰上避光，直到准备流式细胞仪。
8. 建立和确定的细胞分选与未染色细胞和单染控制适当的补偿。
9. 排除不能存活的细胞与正向和侧向散射设门（ 图1A）。成立了CD4 ⁺和CD45RB ⁺细胞亚型染色控制门控。门上的细胞CD4 ⁺人口。
10. 排序CD4 ⁺细胞进入CD45RB ^高 CD45RB ^低的人群使用一个简单的柱状图PE染色细胞转化为管用2毫升全媒体。该CD45RB ^高 + CD45RB ⁺细胞（CD45RB ^高 ）的最高40％，并且CD45RB ^低人口是最低的20％的CD4 ⁺ CD45RB ⁺细胞（CD45RB ^低 ; 图1B）。

图1：在FACS分析仪曲线的CD4 ⁺ CD45RB T细胞群的代表性流（A - C）的 FITC CD4-和从通过FACS分选入供体C57BL / 6小鼠的PE CD45RB染色的脾的CD4 ⁺ CD45RB ^高和CD4 ^+。 CD45RB ^低 T细胞群。 （A）双峰事件被排除在前进散点图。 （B）的淋巴细胞进行门控，在正向和侧向散射图。 （C）CD4 ⁺ （D）的CD4 ⁺ CD45RB ^{+ T}细胞上绘制的PE与事件直方图。 CD4 ⁺ CD45RB ^low细胞被认为是CD45RB ⁺细胞的最低的20％。 CD4 ⁺ CD45RB ^高细胞被定义为CD45RB ⁺细胞的最高的40％。

11. 运行的FACS机器上的每个细胞群体的等分试样来评估群体的纯度。
12. 离心分选的细胞在450×g离心7分钟。重悬在1ml PBS中。去除细胞等分计算和台盼蓝染色，以评估细胞活力按照步骤2.9。

5.细胞注射到收件人

1. 重悬分选的细胞以4×10 ⁶个细胞/ ml（CD45RB ^高 ）或2×10 ^6个细胞/ PBS中毫升（CD45RB ^低 ）。
2. 每个收件人转移100微升CD45RB ^高细胞对新的无菌管。添加100微升PBS每收件人该管。因此，每只动物的总注射体积是200微升，和每受体细胞的总量为4×10 ⁵个CD4 ⁺ CD45RB ^高幼稚T细胞。
3. 如果实验组接受调节性T细胞的需要，每个收件人转移100微升CD45RB ^高细胞对新的无菌管。加入100微升每收件人CD45RB ^低细胞对相同的管中。每个动物的总注射量为200微升; CD45RB ^高的比率：CD45RB ^low细胞是2：1。
4. 注入100微升CD45RB ^高或CD45RB的^高 / ^低 CD45RB的CD4 ⁺细胞腹膜内成每个收件人的腹部（总200微升）的右侧和左侧。

在收件人动物6.监测病情进展

1. 为了评估该受体动物的临床状况，对于以下paramete分配骨料临床得分在注射当天RS ^8，此后每周，和在处死时：
   1. 确定通过测量重量损失浪费：0 - 没有体重减轻; 1 - 0.1-10％的损失的初始体重; 2 - 10％以上的损失初始体重（ 图2A）的。

图2：炎症的临床和病理总额转移的迹象野生型CD4 ⁺ CD45RB ^高 T细胞进入RAG1后出现^{- / -}和NRDKO受体小鼠^{11（A）NRDKO}收件人5告负的初始体重平均水平10％。周后转移，而RAG1- / -收件人未在此时显示出疾病的临床症状。每个点代表的初始体​​重为队列±SEM的平均百分比。 **，P <0.005。 （B）中的一些小鼠发展严重的肠道炎症，这表现在直肠脱垂的存在。这是直肠脱垂的NRDKO受体小鼠的代表图片。 （C）的眼观从冒号既RAG1 ^{- / -}和NRDKO受体小鼠增厚，缩短与从RAG1冒号^{- / -}和NRDKO小鼠没有T细胞过继转移。从NRDKO受体小鼠冒号显示严重的炎症，增加结肠重量（数据未显示）。 请点击此处查看该图的放大版本。

1. 2. 通过将动物干净的容器确定大便质量，直到它已通过便血：0 - 无; 1 - 大便软; 2 - 水样和/或便血。
   3. 确定动物的一般健康受疾病的下列迹象的存在：0 - 不弯腰驼背的姿势，毛的皮毛，或皮肤损伤; 1 - 以下目前的任何一个：弯腰驼背的姿势，毛的皮毛，或皮肤损伤。
   4. 确定直肠脱垂存在：0 - 缺席; 1 -本（ 图2B）。
2. 通过CO牺牲动物₂吸入颈椎脱位时，他们已经失去了他们的出发体重20％，或期望的时间点，以先到者为准。临床疾病通常是显而易见的，在开始5周后饱食。
3. 评估疾病严重程度如前所述^5,7。
   1. 分配临床得分如在步骤6.1 ^8。
   2. 测量结肠长度和重量（ 图2C）。
   3. 执行炎症的组织学分析5。
   4. 在肠组织外植体培养⁹确定自发细胞因子的表达，肠系膜淋巴结^10，和/或血清^11。
      1. 简单地说，对于植文化^9，牺牲后删除冒号，开放纵向和干净PBS。孵育在轨道摇床设定以250rpm在完整的媒体为30分钟，在室温下冒号。
      2. 剁的组织切成小块并在完全培养基在37℃下放置24小时。收集上清液，并使用为每100mg组织中的细胞因子，通过ELISA定量。
   5. 执行的T细胞表型和/或功能¹⁰ 体外表征。

Representative Results

约10×10 ⁶ CD4 ⁺ CD45RB ^高Tg从成年C57BL / 6小鼠捐助10脾脏细胞是可靠的隔离。这个数目将根据患者的年龄的供体小鼠的应变和研究者的熟练程度而有所不同。当4×10 ⁵只C57BL / 6的CD4 ⁺ CD45RB ^高 T细胞转移到C57BL / 6 RAG1 ^{- / -}受体小鼠，疾病的临床症状出现围绕周5后饱食或更快，如果小鼠在遗传上易感更严重的疾病（ 图^{2，3）11,12。} CD3 ^{+ T}细胞被认为存积在RAG1的冒号^{- / -}收件人早在3周（ 图^3A）12。

图3：野生型CD4转让⁺ CD45RB ^高的 T细胞进入RAG1 ^{- / -}和RKO ^/δKD收件人诱导的慢性肠道炎症^12（A）（原放大倍数10X，H＆E和免疫组化CD3）。 H＆E染色（顶部面板）显示上皮增生，炎性细胞浸润，隐窝脓肿（箭头）出现在RKO ^/δKD接受者而不是RAG1 ^{- / -}收件人。 ^{/ - -}收件人相比从RAG1冒号从RKO ^/δKD受体小鼠结肠表现出的CD3 ^{+ T}细胞的显着积累的CD3 IHC（底部小图）。 （B）由冒号RKO / ^KDδ受体小鼠表现出更严重的炎症相比，冒号FROM RAG1 ^{- / -}如通过组织学得分确定受体小鼠。 （C，D）的比没有结肠植文化的分泌少IL-10（C）RKO / ^KDδ受体小鼠和更多的IL-12p40的（D）结肠植文化RAG1 ^{- / -}受体小鼠请点击这里查看更大的版本这个数字。

我们以前发表过继T细胞转移到Nfil3 ^{- / -} / RAG1 ^{- / -}双敲除的收件人（NRDKO）开发出更严重的结肠炎相比RAG1 ^{- / -}受体小鼠（ 图^2）11。 NFIL3负鼠结肠巨噬细胞的独立于它的IL-10的诱导效果¹³的IL-12p40的调节。的IL-12p40的和IL-10的失调牵涉在路径人类ogenesis IBD ^1。因此，未选中的IL-12p40生成的过继转移NDRKO受体小鼠导致更迅速的疾病进展，如由体重下降（ 图2A）。一些NRDKO接受者小鼠发展导致直肠脱垂（ 图2B）严重的疾病。极，从NRDKO受体小鼠结肠加厚和缩短，较大量涌入炎性细胞进入结肠，相比RAG1 ^{- / -}受体小鼠（ 图2C）。

相对而言，在RAG1 ^{- / -}小鼠与非淋巴细胞群非功能性PI3K的催化亚基p110δ（RKO ^{/δK D），CD4 +} CD45RB ^高 T细胞饱食诱导疾病的类似快速和严重的临床过程与NRDKO小鼠相比（ 图^3）12。在第3周的组织学分析表明结肠组织肥大，inflamma保守党细胞浸润，隐窝脓肿（箭头）RKO ^/δKD收件人相比RAG1 ^{- / -}受助人（ 图3A）。受体小鼠在该实验安乐死3周因显著号码已失去其初始体重的20％。组织学分数，如通过失明的实验组，并根据在我们的实验室¹²开发特定标准的病理学家确定的，均高于在RKO ^/δKD受体小鼠相比RAG1 ^{- / -}受体小鼠（ 图3B）。此外，来自结肠外植体培养自发产生细胞因子证明降低IL-10和增强的IL-12p40生成由RKO ^/δKD受体小鼠相比RAG1 ^{- / -}受体小鼠（ 图3C，D）的 ^12。再次，增加IL-12p40的和降低的IL-10的产量与人类的发病IBD ^1。

Discussion

在这里，我们描述了一个一步一步的协议，通过过继转移CD4 ⁺ CD45RB ^{+ T}细胞的免疫缺陷小鼠诱导小鼠结肠的炎症。我们使用的C57BL / 6供体脾和同系RAG1 ^{- / -}受体小鼠，尽管其它菌株（ 例如 ，BALB / c小鼠，129S6 / SvEv，非肥胖糖尿病（NOD））免疫缺陷的和遗传模型（ 例如 ，SCID， 的Rag2 ^{- / - ），}也可以使用^4,14-16。它是公认的背景品系影响小鼠¹实验性结肠炎严重程度。此外，在鼠人口肠溶微生物设施之间差别很大，甚至那些之间的同一机构^6,17内。而图2和3没有显示肠炎的发展RAG1 ^{- / -}小鼠在第4周后转移，在我们和其他人的经验RAG1 ^{- / -}受体开发CLICD4 ⁺ CD45RB ^高的 T细胞^18-23转移后6,9周的nical疾病。这个变异性的临床过程和疾病的表达，并应建立这种模型实验性结肠炎的最小化区域内和跨实验不一致时予以考虑。

用于该实验的再现性的一个关键步骤是CD4 ⁺ CD45RB ^高细胞的纯群体没有残留的活化/存储器/调节性T细胞的FACS隔离。这包括流式细胞仪的精通了解。重要的是要首先负选择非存活和CD4-细胞。然后，用一个简单的直方图CD45RB-PE细胞，选择细胞的最高的40％来表示CD45RB ^高 T细胞和最低的20％作为CD45RB ^低 T细胞。其它标记，以考虑幼稚CD4 + T细胞的分离使用的是CD62L和CD25，但根据我们的经验CD45RB ^高 低分离是足够的和可重复^5。另外，有可能会发生变化CD45RB ^高的比率，以CD45RB转移到接受者来研究疾病表型调节性T细胞群的影响^的低的T细胞。与别人谁是熟悉流式细胞仪初步建立FACS协议，然后使用该协议在未来的实验工作。此外，一个步骤，其中显著变化可以在该协议影响的结果是腹腔注射T细胞到受体小鼠。在此，区域内和跨实验者变性可以大大地影响了实验的结果。有人建议，在执行此步骤中的人是熟悉的处理的小鼠，并与注射技术，以便在细胞中过继转移的质量和数量，以减少可变性。另外，要改变的小鼠之间的针，如针变钝可以影响的功效是非常重要的腹腔注射。

需要优化协议的步骤包括第3节：标签和排序细胞：CD4 ⁺ T细胞和第4节的富集。的CD4 ^{+ T}细胞富集的优化取决于所使用的磁系，并应按照制造商的说明。对于磁性细胞分离系统选项列特定试剂/设备的表中。最好是富集CD4 ^{+ T}细胞通过阴性选择，作为直接标记该群体可以影响细胞的表型。有可用于用于FACS标记细胞许多抗体克隆。抗体浓度（步骤4.4）应该优化以确保特异性染色和FACS中，得到的CD4 ⁺ CD45RB T细胞群的适当的分离。

该协议的发展可能需要排除故障。每个实验的第一，成功取决于研究人员的熟练程度，并将与这些方法中改进的技术人员增加。然而，始终获得低数量的T细胞用于过继转移的可能由不隔离期间在冰上保持细胞，也积极地再悬浮离心细胞，或使用脾细胞从年轻小鼠脾脏小引起的。此外，优化的抗CD4和抗CD45RB标记抗体的浓度染色，以避免缺陷或非特异性的细胞染色（见上文）。如果收件人发展广泛不同程度的肠道炎症，最可能的原因是不确切的腹腔内注射技术。这应该改善与实践，并且可以通过CD3 ⁺细胞的受体小鼠的肠道免疫组织染色来监测。其他的事情要考虑，包括供体和受体小鼠和疾病渗透的正常变化的性别。当雄性受体小鼠的使用，无论是男性或女性供体小鼠是一ppropriate。但是，如果要使用的雌性受体小鼠中，供体小鼠必须是女性^5。在我们和其他人的经验，疾病在该模型的渗透是^85-90％5。因此，可以预期，一些小鼠可能不会发展肠道炎症，显着变异性给予其他原因疾病的严重程度已经被排除。请记住，没有在一个组织内设施之间的表型变异明显，外它对于小鼠胃肠菌群以及影响微生物^6,17的做法。因此，表型或疾病RAG1动力学的鲁棒性^{- / -}受体小鼠可能差异很大，根据一个人的位置。因此，为了确定用于这些实验基于从各个设施中获得的时间表和结果的最佳参数是重要的。

在这里，我们描述了良好表征的自适应传递鼠的方法慢性小肠和结肠的炎症模型类似于人类的IBD ^5。这一步一步的协议说明了关键技术的这种方法用于研究目的的成功发展。这是人类IBD的一个特别有用的动物模型，因为它允许对疾病的同步的各种细胞群的和操纵。然而，在免疫缺陷的受体小鼠进行遗传修饰以开发无成熟适应性免疫细胞，这可能影响到下游的疾病的结果。尽管这样，这里所描述的方法将在以后的研究中确定所述肠溶菌群，先天免疫细胞，和适应性免疫调节细胞在人类IBD的发病机制的影响非常有用的。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
10x PBS	Gibco	14200075
12 mm x 75 mm round-bottom tube	Falcon	352052
15 ml conical	Corning	430790
26 G x 3/8 Needle	BD Biosciences	305110
50 ml conical	Corning	430828
70 μm Cell Strainer	Fisherbrand	22363548
BD IMagnet	BD Biosciences	552311
β-mercaptoethanol	Thermo Scientific	35602
CD4-FITC IgG2b	eBioscience	11-0041
CD45RB-PE IgG2a	BD Pharminogen	553101
Complete Media			RPMI-1640, 1% Pen/Strep, 10% FBS, 0.0004% β-ME
FACS tube + strainer	BD Falcon	352235
Glass Microscope Slides	Fisherbrand	12550A3
Heat-inactivated FBS	Gemini	100-106
Labeling Buffer			1x PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA
Lysis Buffer			0.08% NH4Cl, 0.1% KHCO3, 1 mM EDTA
MoFlo XDP	Beckman Coulter
Mouse CD4 T lymphocyte Enrichment Set - DM	BD Biosciences	558131
Mouse IgG2a-PE	BD Pharminogen	553457
Mouse IgG2b-FITC	eBioscience	11-4732
Pasteur pipet	Fisherbrand	13-678-20D
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X	Corning Cellgro	30-002-CI

Name	Company	Catalog Number	Comments
Petri Dish	Fisherbrand	875713
Pure Ethanol 200 Proof	Decon Labs	2705-HC
RPMI-1640	Gibco	11-875-093
Syringe	BD Biosciences	309597
Trypan blue	Corning Cellgro	25-900-CI
Wash Media			RPMI-1640, 1% Pen/Strep, 0.0004% β-ME