Abstract
Hay muchos modelos diferentes de animales disponibles para el estudio de la patogénesis de las enfermedades humanas inflamatorias del intestino (IBD), cada uno con sus propias ventajas y desventajas. Se describe aquí un modelo de colitis experimental que se inicia por la transferencia adoptiva de células de alta T CD4 + CD45RB singeneicos bazo en ratones receptores deficientes de células T y B. La población de células de alta T CD4 + CD45RB que consiste en gran parte de las células efectoras no tratados previamente es capaz de inducir la inflamación intestinal crónica, muy parecidas a aspectos clave de la EII humana. Este método puede ser manipulado para estudiar aspectos de la aparición de la enfermedad y la progresión. Además, puede ser utilizado para estudiar la función de innato y adaptativo, y las poblaciones de células inmunes reguladoras, y el papel de la exposición ambiental, es decir, la microbiota, en la inflamación intestinal. En este artículo se expone la metodología para la inducción de la colitis con un protocolo paso a paso. Esta incLudes un video de demostración de los aspectos técnicos clave necesarios para desarrollar con éxito este modelo murino de colitis experimental con fines de investigación.
Protocol
NOTA: Asegúrese de que todos los animales protocolos son aprobados por y en cumplimiento con el empleo Comisión (IACUC) regulaciones Institucional Cuidado de Animales y el y el Manual del Consejo Nacional de Investigación para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Los ratones donantes pueden ser ya sea hombre o mujer, pero los ratones receptores deben ser hombres. Si hembras receptoras se van a utilizar, los ratones donantes deben ser mujeres 5. Mantener colonias utilizando, ropa de cama no estéril y agua regulares no acidificado, porque éstos pueden afectar la microbiota intestinal y, por lo tanto, el fenotipo colitis de los ratones 5,6.
1. Preparación Experimental
- Utilice los medios y tampones heladas. Mantener células en hielo durante todo el experimento.
- Lleve a cabo el experimento en campana de bioseguridad estéril utilizando una técnica estéril.
2. Aislamiento de células T esplénica
- La eutanasia de ratón donante / ratones en CO 2 cámara seguidos por dislocatio cervicaln. Pulverizar abdomen con etanol al 70%.
- Haga una incisión horizontal en el abdomen y pelar la piel para exponer peritoneo. Mantenga peritoneo fuera de los órganos internos con los fórceps y hacer una incisión en el peritoneo abdominal izquierda para exponer y extirpar el bazo.
- Coloque el bazo en 10 ml de medios completos en un plato de Petri. Retire y deseche el exceso de tejido de bazo.
- Utilice 2 portaobjetos de vidrio esterilizados para aplastar y desmenuzar el bazo en la suspensión de una sola célula. Suspensión de células Filtrar a través de un colador de 70 micras en un tubo cónico de 50 ml y enjuague filtro con 5 ml de medios completos. Coloque un máximo de 5 bazos en un tubo cónico de 50 ml.
- Centrifugar las células a 450 xg durante 7 minutos. Desechar el sobrenadante vertiendo o por succión al vacío en un contenedor de residuos.
- Resuspender suavemente las células en 5 ml por bazo de tampón de lisis para lisar las células rojas de la sangre durante 10 min a temperatura ambiente. Añadir un volumen igual de completa Media (5 ml por bazo) en el tubo.
- Resuspender las células en 10 ml de Etiquetado Buffer.
- Contar las células por exclusión de azul tripán.
- Retire 20 l de suspensión celular y añadir 180 l de azul de tripano a un tubo de microcentrífuga y mezclar bien. Después de 5 min, añadir 10 l de células hemocitómetro y contar las células no azules bajo el microscopio etiquetados. Determinar el número total de células viables. Deseche celular / azul tripán mezcla.
- Centrifugar las células en 10 ml de Etiquetado Buffer a 450 xg durante 7 minutos. Desechar el sobrenadante vertiendo o por succión al vacío en un contenedor de residuos.
3. Enriquecimiento de las células T CD4 +
NOTA: Siga las instrucciones del fabricante para los productos específicos que se utilizan en esta sección.
- Resuspender suavemente las células a una suspensión de una sola célula de 20 x 10 6 células / ml en frío Labeling Buffer.
- Añadir 5 l por 1 x 10 6 células T CD4 anticuerpos enriquecimiento celular con biotina. Se incuban las células en hielo durante 15 min.
- Añadir 10x volumen de Etiquetado Buffer. Centrifugar las células a 450 xg durante 7 minutos. Aspirar con cuidado todo el sobrenadante mediante aspiración al vacío en un contenedor de residuos.
- Completamente vórtice partículas magnéticas conjugadas con estreptavidina. Añadir 5 l de partículas por 1 x 10 6 células.
- Mezclar bien pero con suavidad. Mantener la mezcla a 6-12 ° C durante 30 min.
- Añadir Labeling Buffer a una concentración de 20-80 x 10 6 células / ml. Transferencia de hasta 1,0 ml células marcadas por tubo de ensayo de fondo redondo de 12 x 75 mm (en adelante, el "tubo-fracción positiva").
- Colocar cada tubo de fracción positiva en el imán durante 6-8 min.
- Con los tubos de fracción positiva fijas en el imán, transferir cuidadosamente el sobrenadante de tubo de fracción positiva con pipeta Pasteur de vidrio a un nuevo tubo cónico de 50 ml estériles (referred como la "fracción enriquecida"). Esta fracción enriquecida contiene células T CD4 +. Tenga cuidado de no romper las células marcadas atraídos por el imán.
- Resuspender las células dejan en los tubos de la fracción positiva en el mismo volumen de Etiquetado Buffer como en el paso 3.6 pipeta hacia arriba y hacia abajo con fuerza. Coloque el tubo-fracción positiva de vuelta en el imán de 6-8 min.
- Con tubos de fracción positiva fijas en el imán, transferir cuidadosamente el sobrenadante (fracción enriquecida, CD4 +) de tubo de fracción positiva con vidrio pipeta Pasteur estéril de 50 ml tubo cónico de paso 3.8 sin afectar las células unidas al imán.
- Repetir los pasos 3.9 a 3.10 para aumentar el rendimiento de las células T CD4 + obtenidos. Continuar utilizando protocolo fracción enriquecida (células CD4 +).
4. Etiquetado y ordenar celdas 7
- Centrifugar las células enriquecido a 450 xg durante 7 min. Desechar el sobrenadante vertiendo o SUCT vacíoiones en un contenedor de residuos.
- Resuspender las células en 1 ml de Etiquetado Buffer. Eliminar alícuota de células para contar y para evaluar la viabilidad celular por exclusión con azul de tripano como en el paso 2.9.
- Añadir un volumen de Etiquetado Buffer de 10 x 10 6 células / ml; si las células ya están <10 x 10 6, centrifugar a 450 xg durante 7 min, desechar el sobrenadante vertiendo o succión de vacío en el contenedor de residuos, y aumentar el volumen del etiquetado Buffer de 10 x 10 6 células / ml.
- Establecer alícuotas separadas de aproximadamente 5 a 10 × 10 5 células cada una de las células de control sin teñir, isotipo manchados, y de un solo manchado en tubos de microcentrífuga.
- Añadir 5 g / ml-CD4 FITC y 1 mg / ml CD45RB-PE a las células. Añadir manchas de control de isotipo y las manchas individuales a la misma concentración a partes alícuotas en tubos de microcentrífuga apropiarse. Mezclar bien pero suavemente y se incuba en hielo protegidas de la luz durante 30 min.
- Añadir 10x volumen de Etiquetado Buffer a las células y el controls. Centrífuga 450 xg durante 7 minutos. Desechar el sobrenadante por succión al vacío en un contenedor de residuos.
- Resuspender en Labeling Buffer de volumen en el paso 4.5. Centrífuga 450 xg durante 7 minutos. Desechar el sobrenadante por succión al vacío en un contenedor de residuos.
- Resuspender en Labeling Buffer de 10 x 10 6 células / ml. Pase células a través de 70 micras filtro en el tubo de FACS. Mantener en hielo protegido de la luz hasta el momento de FACS.
- Establecer y determinar la indemnización correspondiente en el clasificador de células con células sin teñir y controles individuales de colores.
- Excluir células no viables con gating a plazo y de dispersión lateral (Figura 1). Configure gating CD4 + y células CD45RB + con controles de isotipo manchados. Células Gate sobre la población CD4 +.
- Ordenar CD4 + CD45RB células en alto y CD45RB poblaciones de bajos utilizando un histograma simple para células PE-manchado en tubos con 2 ml de medios completos. El CD45RB alta + CD45RB + células (CD45RB alta), y la baja población CD45RB es el 20% más bajo de células CD4 + CD45RB + (CD45RB baja; Figura 1B).
Figura 1: Flujo de Representante citometría de parcelas de poblaciones de células CD4 + CD45RB T durante el análisis FACS (A - C) FITC y CD4 PE esplenocitos CD45RB manchada-de donantes C57BL / 6 ratones fueron ordenados por FACS en CD4 + CD45RB alta y CD4 +. CD45RB poblaciones de células T baja. Eventos (A) Doublet fueron excluidos del gráfico de dispersión hacia adelante. (B) Los linfocitos fueron cerrada en la dispersión frontal y lateral trama. (C) CD4 + (D) CD4 + CD45RB + se representaron en un PE frente Eventos histograma. Bajo las células CD4 + CD45RB se consideraron el 20% más bajo de células CD45RB +. Pilas de gran CD4 + CD45RB se definieron como la más alta 40% de las células CD45RB +.
- Ejecutar una alícuota de cada población celular en la máquina de FACS para evaluar la pureza de las poblaciones.
- Centrífuga ordenadas células a 450 xg durante 7 minutos. Resuspender en 1 ml de PBS. Eliminar alícuota de células para contar y para evaluar la viabilidad celular por exclusión con azul de tripano como en el paso 2.9.
5. La inyección de células en Destinatarios
- Resuspender las células ordenadas a 4 x 10 6 células / ml (CD45RB alta) o 2 x 10 6 células / ml (CD45RB baja) en PBS.
- Transfiera 100 l de células de alta CD45RB por destinatario al nuevo tubo estéril. Añadir 100 l de PBS pordestinatario a este tubo. Por lo tanto, el volumen total de inyección por animal es de 200 l, y la cantidad total de células por beneficiario es de 4 altos células T ingenuas x 10 5 células CD4 + CD45RB.
- Si se desea grupo experimental que recibe las células T reguladoras, transferir 100 l de células de alta CD45RB por destinatario al nuevo tubo estéril. Añadir 100 l de células de baja CD45RB por destinatario al mismo tubo. Volumen total de inyección por animal es de 200 l; relación de alta CD45RB: células de baja CD45RB es 2: 1.
- Inyectar 100 l de CD45RB alta o CD45RB células de alta CD45RB bajos CD4 / + por vía intraperitoneal en el lado derecho e izquierdo del abdomen (un total de 200 l) de cada destinatario.
6. Seguimiento de la progresión de la enfermedad en los animales receptores
- Para evaluar el estado clínico de los animales receptores, asignar puntuaciones clínicas agregadas para los siguientes Parameters 8 en el día de la inyección, después semanalmente, y en el momento del sacrificio:
- Determinar perder midiendo la pérdida de peso: 0 - sin pérdida de peso; Pérdida de 0,1 a 10% del peso corporal inicial - 1; 2 - la pérdida de más de 10% del peso corporal inicial (Figura 2A).
Figura 2: signos patológicos y clínicos graves de inflamación se producen después de la transferencia de tipo salvaje células de alta T CD4 + CD45RB en Rag1 - / - y ratones receptores NRDKO 11 (A) los receptores NRDKO perdieron en promedio el 10% de su peso corporal inicial en un 5. semanas después de la transferencia, mientras que Rag1- / - Receptores no mostraron signos clínicos de la enfermedad en este momento. Cada punto representa la media del porcentaje de peso corporal inicial para la cohorte ± SEM. **, P <0,005. (B) algunas ratones desarrollaron inflamación intestinal grave, como se demuestra por la presencia de prolapso rectal. Esta es una imagen representativa de prolapso rectal en un ratón receptor NRDKO. (C) Grueso, dos puntos, tanto de Rag1 - / - y ratones receptores NRDKO se espesan y acortan en comparación con los dos puntos de Rag1 - / - y ratones NRDKO sin transferencia adoptiva de células T. Los dos puntos de los ratones receptores NRDKO muestran inflamación severa y aumento del peso de los dos puntos (datos no mostrados). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Determinar la calidad de las heces mediante la colocación de los animales en un recipiente limpio hasta que haya pasadotaburete: 0 - ninguno; 1 - heces blandas; 2 - heces acuosas y / o con sangre.
- Determinar la salud general de los animales por la presencia de los siguientes signos de enfermedad: 0 - sin postura encorvada, erizado la piel, o la piel lesiones; 1 - cualquiera de los siguientes presente: encorvado postura, cerdas de piel o lesiones en la piel.
- Determinar la presencia de prolapso rectal: 0 - ausente; 1 - presente (Figura 2B).
- Sacrificar animales por inhalación de CO 2 seguido por dislocación cervical cuando han perdido el 20% de su peso corporal inicial o en el punto de tiempo deseado, lo que ocurra primero. La enfermedad clínica suele ser evidente a partir de las 5 semanas después de la reposición.
- Valorar la gravedad de la enfermedad a lo descrito previamente 5,7.
- Asignar puntuaciones clínicas como en el paso 6.1 8.
- Medir la longitud del colon y el peso (Figura 2C).
- Realizar el análisis histológico de la inflamación5.
- Determinar la expresión de citoquinas espontánea en cultivos de explantes de tejido intestinal 9, nódulos linfáticos mesentéricos 10, y / o suero 11.
- En pocas palabras, para cultivos de explantes 9, quitar dos puntos después del sacrificio, abierta longitudinalmente, y limpia con PBS. Incubar dos puntos en un agitador orbital fijado en 250 rpm en medios completos de 30 min a temperatura ambiente.
- Picar el tejido en trozos pequeños y se incubaron a 37 ° C en medios completos para 24 hr. Recoger el sobrenadante y usar para la cuantificación de citoquinas por 100 mg de tejido por ELISA.
- Realizar ex vivo caracterización de fenotipos de células T y / o la función 10.
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Representative Results
Aproximadamente 10 x 10 6 células de alta T CD4 + CD45RB de 10 bazos de adultos C57BL / 6 ratones donantes son confiablemente aislado. Este número variará dependiendo de la edad y la cepa del ratón donante y el dominio del investigador. Cuando 4 x 10 5 C57BL / 6 celdas de alta T CD4 + CD45RB se transfieren a C57BL / 6 Rag1 - / - ratones receptores, los signos clínicos de la enfermedad surgen alrededor de la semana 5 después de la reposición o antes si los ratones son genéticamente susceptibles a la enfermedad más grave ( La Figura 2, 3) 11,12. Las células T CD3 + se ven acumulando en dos puntos de Rag1 - / - receptores ya en 3 semanas (Figura 3A) 12.
Figura 3: Transferencia de tipo salvaje CD4 + CD45RB células T alto en Rag1 - / - y receptores RKO / δ KD induce la inflamación intestinal crónica 12 (A) (Aumento original 10X, H & E y CD3 inmunohistoquímica).. H & E tinción (paneles superiores) ilustra la hiperplasia epitelial, infiltrados de células inflamatorias, y abscesos de las criptas (flecha) presentes en los receptores de KD / δ RKO pero no Rag1 - / - destinatarios. Los dos puntos de los ratones receptores KD RKO / δ demostraron una marcada acumulación de células T CD3 + CD3 por IHC (paneles inferiores) en comparación con los dos puntos de Rag1 - / - destinatarios. (B) Los dos puntos de RKO / δ KD ratones receptores demostró inflamación más severa en comparación con colones from Rag1 - / - ratones receptores según lo determinado por la puntuación histología. (C, D) los cultivos de explantes de colon / δ ratones RKO receptores KD secretadas menos IL-10 (C) y más IL-12p40 (D) que los cultivos de explantes de colon Rag1 - / -. Ratones receptores Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
Hemos publicado previamente que la transferencia de células T adoptiva en Nfil3 - / - / Rag1 - / - destinatarios knockout dobles (NRDKO) desarrollar colitis más grave en comparación con Rag1 - / - ratones receptores (figura 2) 11. NFIL3 regula negativamente la IL-12p40 en los macrófagos colónicos murinos independientemente de sus efectos IL-10 inducen 13. La desregulación de IL-12p40 y IL-10 está implicada en la rutaogenesis de EII humana 1. Por lo tanto, sin control IL-12p40 producción en la transferencia adoptivos NDRKO resultados ratones receptores en progresión de la enfermedad más rápida, como se muestra por la pérdida de peso (Figura 2A). Algunos ratones receptores NRDKO desarrollaron enfermedad grave con resultado de prolapso rectal (Figura 2B). Macroscópicamente, dos puntos de los ratones receptores NRDKO se espesan y acortados, lo que representa una gran afluencia de células inflamatorias en el colon, en comparación con Rag1 - ratones receptores (Figura 2C) - /.
Comparativamente, en Rag1 - / - ratones con un no funcional PI3K p110δ catalítica subunidad en poblaciones no de linfocitos (RKO / δ KD), CD4 + CD45RB la repleción de células T induce una alta curso clínico de manera similar rápida y grave de la enfermedad en comparación con los ratones (Figura NRDKO 3) 12. El análisis histológico a las 3 semanas demuestra hipertrofia del tejido del colon, inflammainfiltrados de células tory y abscesos de las criptas (flecha) en los receptores de KD / δ RKO en comparación con Rag1 - / - receptores (Figura 3A). Los ratones receptores en este experimento fueron sacrificados a las 3 semanas debido a un número significativo que había perdido el 20% de su peso corporal inicial. Resultados histológicos, según lo determinado por un patólogo que desconocía los grupos experimentales y en base a criterios específicos desarrollados en nuestro laboratorio de 12, fueron mayores en los ratones receptores KD RKO / δ en comparación con Rag1 - / - ratones receptores (Figura 3B). Además, la producción de citoquinas espontánea a partir de cultivos de explantes de colon demostró disminución de IL-10 y el aumento de IL-12p40 producción por ratones receptores KD RKO / δ en comparación con Rag1 - / - ratones receptores (Figura 3C, D) 12. Una vez más, el aumento de IL-12p40 y la disminución de IL-10 está implicada en la patogénesis de la EII humana 1.
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Discussion
Aquí se describe un protocolo paso a paso la inducción de la inflamación del colon en ratones mediante la transferencia adoptiva de células T CD4 + CD45RB + en ratones inmunodeficientes. Se utilizó bazo C57BL / 6 donantes y Rag1 singénico - / - ratones receptores, aunque otras cepas (por ejemplo, BALB / c, 129S6 / SvEv, diabético no obeso (NOD)) modelos y genéticos de la inmunodeficiencia (por ejemplo, SCID, Rag2 - / -) también se pueden usar 4,14-16. Está bien establecido que la cepa de fondo afecta gravedad de la colitis experimental en ratones 1. Por otra parte, la microbiota intestinal en una población murina varía ampliamente entre las instalaciones, incluso entre los que están dentro de la misma institución 6,17. Mientras que las figuras 2 y 3 no muestran el desarrollo de colitis en Rag1 - / - ratones a las 4 semanas después de la transferencia, en nuestra experiencia y la de otros Rag1 - / - receptores desarrollan clienfermedad nica entre 6 y 9 semanas después de la transferencia de CD4 + CD45RB células T alta 18-23. Esta variabilidad en el curso clínico y la expresión de la enfermedad y debe ser tomado en cuenta para establecer este modelo de colitis experimental para minimizar inconsistencia intra e inter-experimental.
Un paso crítico para la reproducibilidad de este experimento es el aislamiento FACS de poblaciones puras de células de alta CD4 + CD45RB sin activados / / células T reguladoras de memoria residuales. Esto implica un conocimiento competente de la citometría de flujo. Es importante seleccionar primero negativamente células no viables y CD4-. Luego, utilizando un histograma simple para células CD45RB-PE, seleccione la más alta 40% de las células para representar las células T CD45RB alta y el 20% más bajo que las células T CD45RB bajos. Otros marcadores considerar el uso para el aislamiento de células T CD4 + vírgenes se CD62L y CD25, aunque en nuestra experiencia CD45RB alta bajo separación es suficiente y reproducible 5. Además, es posible variar la relación de CD45RB alta a baja T CD45RB células transferidas a receptores para estudiar los efectos de las poblaciones de células T reguladoras en fenotipo de la enfermedad. Trabajar con alguien que esté familiarizado con la citometría de flujo inicialmente para configurar el protocolo de FACS y luego usar ese protocolo en futuros experimentos. Además, un paso en el que una variación significativa puede afectar los resultados de este protocolo es la inyección intraperitoneal de células T en ratones receptores. Aquí, la variabilidad intra e inter-experimentador pueden afectar en gran medida el resultado del experimento. Se sugiere que la persona que realiza este paso es cómodo con ratones de manipulación y con la técnica de inyección a fin de minimizar la variabilidad en la calidad y cantidad de células transferidas de forma adoptiva. Además, es importante cambiar agujas entre los ratones, como embotamiento de la aguja puede afectar a la eficacia dela inyección intraperitoneal.
Pasos del protocolo que requiere la optimización incluyen Sección 3: El enriquecimiento de las células T CD4 + y de la Sección 4: Etiquetado y clasificación de celdas. Optimización del enriquecimiento de células T CD4 + depende del sistema magnético utilizado y debe seguir las instrucciones de los fabricantes. Las opciones para los sistemas de separación magnética de células se enumeran en la Tabla de específico Reactivos / Equipo. Es aconsejable para enriquecer en células T CD4 + por selección negativa, etiquetado como directamente esta población puede afectar el fenotipo de las células. Hay muchos clones de anticuerpos disponibles para el etiquetado de las células para FACS. La concentración de anticuerpo (paso 4.4) debe ser optimizado para asegurar la tinción específica y para obtener una separación adecuada de las poblaciones de células CD4 + CD45RB T durante FACS.
El desarrollo de este protocolo puede requerir la resolución de problemas. En primer lugar, el éxito de cada experimentodepende de la habilidad del investigador y se incrementará con una mejor habilidad en estos métodos. Sin embargo, obtener consistentemente bajo número de células T para la transferencia adoptiva pueden ser causados por no mantener las células en hielo durante el aislamiento, la resuspensión de células centrifugadas demasiado agresiva, o el uso de esplenocitos de ratones jóvenes con pequeñas bazos. Además, optimizar la concentración de anticuerpos anti-CD45RB de etiquetado anti-CD4 y para la tinción para evitar la tinción de las células deficientes o no específica (véase más arriba). Si los destinatarios desarrollan ampliamente variables grados de inflamación intestinal, la causa más probable es la técnica de inyección intraperitoneal impreciso. Esto debería mejorar con la práctica y puede ser monitoreado por tinción immunohistologic de células CD3 + en el intestino de los ratones receptores. Las cosas adicionales a considerar incluyen el género de donantes y receptores ratones y las variaciones normales en la penetración de la enfermedad. Cuando se utilizan ratones receptores masculinos, ya sea ratones donantes masculinos o femeninos son unappropriate. Sin embargo, si se van a utilizar ratones receptores femeninos, los ratones donantes deben ser mujeres 5. En nuestras experiencias y las de otros, la penetración de la enfermedad en este modelo es del 85-90% 5. Así, se espera que algunos ratones no se desarrolle la inflamación intestinal, dadas otras causas de la variabilidad marcada en la gravedad de la enfermedad se han descartado. Ten en cuenta que es marcada variabilidad de fenotipos entre instalaciones dentro de una organización y fuera de ella con respecto a la microbiota y prácticas que influyen en la microbiota gastrointestinal 6,17 murino. Por lo tanto, la robustez del fenotipo o cinética de la enfermedad en Rag1 - / - ratones receptores puede variar ampliamente según la ubicación de uno. Por lo tanto, es importante para determinar los mejores parámetros para estos experimentos basados en la línea de tiempo y los resultados obtenidos a partir de cada instalación individual.
Aquí se describe la metodología de la murino transferencia adaptativa bien caracterizadomodelo de intestino delgado crónica y la inflamación del colon que se asemeja a la EII humana 5. Este protocolo paso a paso ilustra técnicas clave para el desarrollo exitoso de este método para fines de investigación. Este es un modelo animal particularmente útil de la EII humana, ya que permite la sincronización de la enfermedad y la manipulación de diferentes poblaciones de células. Sin embargo, los ratones receptores inmunodeficientes son modificados genéticamente para desarrollar sin células inmunitarias adaptativas maduros, lo que probablemente afecta resultados de la enfermedad aguas abajo. A pesar de esto, el método descrito aquí será muy útil en estudios futuros determinar el impacto de la microbiota entérica, las células inmunitarias innatas y las células reguladoras inmunes adaptativas en la patogénesis de la EII humana.
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Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Asociación Americana de Gastroenterología (AGA) Investigación estudiosos Premio y la enfermedad de Crohn y Colitis Foundation of America (CCFA) Premio Desarrollo Profesional (a ENS), NIH NIDDK F30 DK089692 (ECS), y la Universidad de Carolina del Norte Centro de Biología Gastrointestinal y Grant Enfermedades P30 DK34987 (Histología Core). El Fondo para el flujo de Citometría de UNC es apoyado en parte por una subvención del NCI Core Support Center (P30CA016086) al Centro Integral del Cáncer de la UNC Lineberger. Damos las gracias a Lucas B. Borst de North Carolina State University College de Medicina Veterinaria por su ayuda con el análisis histopatológico e inmunohistoquímica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 10x PBS | Gibco | 14200075 | |
| 12 mm x 75 mm round-bottom tube | Falcon | 352052 | |
| 15 ml conical | Corning | 430790 | |
| 26 G x 3/8 Needle | BD Biosciences | 305110 | |
| 50 ml conical | Corning | 430828 | |
| 70 μm Cell Strainer | Fisherbrand | 22363548 | |
| BD IMagnet | BD Biosciences | 552311 | |
| β-mercaptoethanol | Thermo Scientific | 35602 | |
| CD4-FITC IgG2b | eBioscience | 11-0041 | |
| CD45RB-PE IgG2a | BD Pharminogen | 553101 | |
| Complete Media | RPMI-1640, 1% Pen/Strep, 10% FBS, 0.0004% β-ME | ||
| FACS tube + strainer | BD Falcon | 352235 | |
| Glass Microscope Slides | Fisherbrand | 12550A3 | |
| Heat-inactivated FBS | Gemini | 100-106 | |
| Labeling Buffer | 1x PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA | ||
| Lysis Buffer | 0.08% NH4Cl, 0.1% KHCO3, 1 mM EDTA | ||
| MoFlo XDP | Beckman Coulter | ||
| Mouse CD4 T lymphocyte Enrichment Set - DM | BD Biosciences | 558131 | |
| Mouse IgG2a-PE | BD Pharminogen | 553457 | |
| Mouse IgG2b-FITC | eBioscience | 11-4732 | |
| Pasteur pipet | Fisherbrand | 13-678-20D | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100X | Corning Cellgro | 30-002-CI |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri Dish | Fisherbrand | 875713 | |
| Pure Ethanol 200 Proof | Decon Labs | 2705-HC | |
| RPMI-1640 | Gibco | 11-875-093 | |
| Syringe | BD Biosciences | 309597 | |
| Trypan blue | Corning Cellgro | 25-900-CI | |
| Wash Media | RPMI-1640, 1% Pen/Strep, 0.0004% β-ME |
References
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