Abstract
Det finns många olika djurmodeller tillgängliga för att studera patogenesen av mänskliga inflammatoriska tarmsjukdomar (IBD), alla med sina egna fördelar och nackdelar. Vi beskriver här en experimentell kolit modell som initieras genom adoptiv överföring av syngena mjält CD4 ^ CD45RB hög T-celler i T och B-cellsbrist mottagarmöss. CD4 + CD45RB hög T-cellpopulation som till stor del består av naiva effektorceller kan inducera kronisk tarminflammation, nära påminner viktiga aspekter av mänskligt IBD. Denna metod kan manipuleras för att studera aspekter av sjukdomsdebut och progression. Dessutom kan den användas för att studera funktionen av medfödda, adaptiv och regulatoriska immuncellpopulationer, och den roll som miljöexponeringar, dvs mikroorganismer, i tarminflammation. I denna artikel illustrerar vi metodiken för att inducera kolit med en steg-för-steg-protokoll. Denna incLudes en video demonstration av viktiga tekniska aspekter som krävs för att framgångsrikt utveckla denna musmodell av experimentell kolit för forskningsändamål.
Protocol
OBS: Se till att alla djurprotokoll är godkända av och i enlighet med Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) föreskrifter och National Research Council Handbok för vård och användning av försöksdjur. Donatormöss kan vara antingen hane eller hona, men mottagarmöss bör vara hane. Om kvinnliga mottagare ska användas, måste donatormöss vara kvinnliga 5. Upprätt kolonier med hjälp av vanlig, icke-steril sängkläder och icke-surgjort vatten, eftersom dessa kan påverka tarmens bakterieflora, och således den kolit fenotypen av mössen 5,6.
1. Försöks Framställning
- Använd iskalla medier och buffertar. Håll celler på is under experimentet.
- Utför experimentet i steril biologiskt huva med steril teknik.
2. Isolering av mjält-T-celler
- Euthanize donator mus / möss i CO2 kammare följt av livmoderhalscancer dislocation. Spray buken med 70% etanol.
- Gör ett horisontellt snitt i buken och skala bort huden att exponera bukhinnan. Håll bukhinnan bort från de inre organen med pincett och gör ett snitt i den vänstra delen av buken bukhinnan att exponera och skära mjälten.
- Placera mjälten i 10 ml Complete Media i en petriskål. Avlägsna och kassera överflödig vävnad från mjälte.
- Använd 2 steriliserade glasskivor för att krossa och retas isär mjälte i encelliga suspension. Filtercellsuspension genom en 70 ìm sil i en 50 ml koniska rör och skölj sil med 5 ml Complete Media. Placera upp till 5 mjälte i en 50 ml koniska rör.
- Centrifugera cellerna vid 450 xg under 7 min. Kassera supernatanten genom att hälla ut eller vakuumsug i avfallsbehållare.
- Försiktigt resuspendera cellerna i 5 ml per mjälte av lyseringsbuffert för att lysera röda blodkroppar under 10 min vid rumstemperatur. Tillsätt en lika volym av komplett medium (5 ml per mjälte) till röret.
- Försiktigt resuspendera celler i 10 ml Labeling Buffer.
- Räkna celler genom trypanblåttuteslutning.
- Avlägsna 20 pl cellsuspension och lägga till 180 l trypanblått till ett mikrofugrör och blanda väl. Efter 5 minuter, tillsätt 10 pl märkta celler att hemocytometer och räkna icke-blå celler i mikroskop. Bestäm totala antalet viabla celler. Kassera cell / trypanblått mix.
- Centrifugera cellerna i 10 ml Labeling-buffert vid 450 xg under 7 min. Kassera supernatanten genom att hälla ut eller vakuumsug i avfallsbehållare.
3. Anrikning av CD4 + T-celler
OBS: Följ tillverkarens instruktioner för specifika produkter som används i det här avsnittet.
- Försiktigt resuspendera cellerna till en enkelcellsuspension av 20 x 10 6 celler / ml i kall EtikettIng buffert.
- Tillsätt 5 l per 1 x 10 6 celler av biotinylerade CD4 T-antikroppar cellanriknings. Inkubera cellerna på is under 15 min.
- Lägg 10x volym Labeling Buffer. Centrifugera cellerna vid 450 × g under 7 min. Aspirera Försiktigt alla supernatanten med hjälp vakuumsug i avfallsbehållare.
- Grundligt Vortexa streptavidin-konjugerade magnetiska partiklar. Tillsätt 5 pl partiklar per 1 x 10 6 celler.
- Blanda noggrant men försiktigt. Håll mix vid 6-12 ° C i 30 minuter.
- Lägg Labeling Buffer till en koncentration av 20-80 x 10 6 celler / ml. Överför upp till 1,0 ml märkta celler per 12 x 75 mm rundbottnade provrör (kallad den "positiva-fraktion tub").
- Placera varje positivt-fraktion röret på magnet för 6-8 minuter.
- Med de positiva-fraktionen rör fortfarande på magneten, försiktigt överföra supernatanten från motorfordon fraktionen rör med glas Pasteur-pipett till en ny steril 50 ml koniska rör (referred till som "anrikade fraktionen"). Denna anrikade fraktionen innehåller CD4 + T-celler. Var noga med att inte störa de märkta cellerna attraheras till magneten.
- Resuspendera cellerna kvar i positivt-fraktionen rören i samma volym Labeling Buffer som i steg 3.6 genom att pipettera upp och ner kraftigt. Placera positiv-fraktionen röret tillbaka på magnet för 6-8 minuter.
- Med positiv-fraktionsrören fortfarande på magneten, försiktigt överföra supernatanten (fraktion, CD4 +) från motorfordon fraktionen rör med glas Pasteur-pipett till sterila 50 ml koniska rör från steg 3,8 utan att störa celler kopplade till magneten.
- Upprepa steg från 3,9 till 3,10 för att öka utbytet av CD4 + T-celler som erhållits. Fortsätt protokollet använder fraktion (CD4 + celler).
4. Märkning och Sorterings celler 7
- Centrifugera berikade celler vid 450 xg under 7 min. Kassera supernatanten genom att hälla ut eller vakuum suction i avfallsbehållare.
- Resuspendera cellerna i 1 ml Labeling buffert. Ta delmängd av celler att räkna och bedöma om cellviabiliteten genom trypanblåttexklusion som i steg 2.9.
- Lägg en volym av Labeling Buffer till 10 x 10 6 celler / ml; Om celler är redan <10 x 10 6, centrifugera vid 450 xg under 7 min, kassera supernatanten genom att hälla ut eller vakuumsug i avfallsbehållare, och lägga volym Labeling Buffer till 10 x 10 6 celler / ml.
- Ställ in separata portioner av ca 5-10 x 10 5 celler vardera för ofärgade, isotyp-färgade, och enkel färgade kontrollceller i mikrofugrör.
- Lägg 5 | ig / ml CD4-FITC och 1 | ig / ml CD45RB-PE till celler. Lägg isotyp kontroll fläckar och enstaka fläckar vid samma koncentration till lämpliga portioner i mikrofugrör. Blanda väl men försiktigt och inkubera på is i skydd från ljus under 30 minuter.
- Lägg 10x volym Labeling Buffer till celler och kontrolls. Centrifugera 450 xg under 7 min. Kassera supernatanten genom vakuumsug i avfallsbehållare.
- Resuspendera i Labeling Buffer volym i steg 4.5. Centrifugera 450 xg under 7 min. Kassera supernatanten genom vakuumsug i avfallsbehållare.
- Resuspendera i Labeling Buffer till 10 x 10 6 celler / ml. Passera celler genom 70 ^ m sil i FACS-rör. Håll på is skyddas från ljus tills redo för FACS.
- Ställ in och bestämma lämplig ersättning på cellsorterare med ofärgade celler och enstaka fläckade kontroller.
- Uteslut icke-livsdugliga celler med framåt- och sidospridning grind (Figur 1A). Ställ in gating för CD4 + och CD45RB + celler med isotyp-färgade kontroller. Gate-celler på CD4 + -populationen.
- Sortera CD4 + celler i CD45RB hög och CD45RB låga populationer med en enkel histogram för PE-färgade celler till rör med 2 ml Complete Media. Den CD45RB hög + CD45RB + celler (CD45RB hög), och CD45RB låga befolknings är den lägsta 20% av CD4 + CD45RB + celler (CD45RB låg; Figur 1B).
Figur 1: Representant flödescytometri tomter av CD4 + CD45RB T-cellspopulationer under FACS-analys (A - C) FITC CD4 och PE CD45RB-färgade splenocyter från donator C57BL / 6 möss Weaver FACS in CD4 + CD45RB hög och CD4 +. CD45RB låg T-cellpopulationer. (A) Doublet evenemang uteslöts på framåtpunktdiagrammet. (B) Lymfocyter gated i framåt- och sidospridningsdiagram. (C) CD4 ^ (D) CD4 ^ CD45RB + -T-celler plottades på en PE kontra Händelser histogram. CD4 + CD45RB låga celler anses vara den lägsta 20% av CD45RB + celler. CD4 + CD45RB höga celler definierades som den högsta 40% av CD45RB + -celler.
- Kör en alikvot av varje cellpopulation på FACS maskinen för att bedöma renhet av populationer.
- Centrifugera sorterade celler vid 450 xg under 7 min. Resuspendera i 1 ml PBS. Ta delmängd av celler att räkna och bedöma om cellviabiliteten genom trypanblåttexklusion som i steg 2.9.
5. Injektion av celler i Mottagare
- Resuspendera sorterade cellerna till 4 x 10 6 celler / ml (CD45RB hög) eller 2 x 10 6 celler / ml (CD45RB lågt) i PBS.
- Överför 100 ^ CD45RB höga celler per mottagare till nya sterilt rör. Lägg 100 ul PBS permottagare till detta rör. Således är injektion total volym per djur 200 l, och den totala mängden celler per mottagare är 4 x 10 5 CD4 + CD45RB hög naiva T-celler.
- Om försöksgrupp emot T regulatoriska celler önskas, överföra 100 pl CD45RB höga celler per mottagare till nya sterilt rör. Lägg 100 pl CD45RB låga celler per mottagare till samma rör. Injektion Total volym per djur är 200 ^; förhållande av CD45RB hög: CD45RB låga celler är 2: 1.
- Injicera 100 ^ CD45RB hög eller CD45RB hög / CD45RB låg CD4 + celler intraperitonealt in i höger och vänster sida av buken (totalt 200 pl) av varje mottagare.
6. Övervakning av sjukdomsprogression i mottagarländerna Djur
- För att bedöma den kliniska status recipientdjuren, tilldela samlade kliniska poäng för följande parameters 8 på dagen för injektionen, därefter varje vecka och vid tidpunkten för offer:
- Bestäm slösa genom att mäta viktförlust: 0 - ingen viktminskning; 1 - 0,1-10% förlust av initial kroppsvikt; 2 - mer än 10% förlust av initial kroppsvikt (Figur 2A).
Figur 2: Kliniska och patologiska tecken på inflammation uppstå efter överföring av vild typ CD4 + CD45RB hög T-celler i Rag1 - / - och NRDKO mottagarmöss 11 (A) NRDKO mottagare förlorade i genomsnitt 10% av sina ursprungliga kroppsvikt med 5. veckor efter överföring, medan Rag1- / - Mottagare inte uppvisar kliniska tecken på sjukdom vid denna tidpunkt. Varje punkt representerar medelvärdet procentandel av initial kroppsvikt för kohorten ± SEM. **, P <0,005. (B) En del möss utvecklade svår tarminflammation, vilket framgår av förekomsten av rektal prolaps. Detta är en representativ bild av rektal prolaps i en NRDKO mottagare mus. (C) Grovt, kolon från både Rag1 - / - och NRDKO mottagarmöss förtjockas och förkortas jämfört med kolon från Rag1 - / - och NRDKO möss utan T-cell adoptiv överföring. Kolon från NRDKO mottagarmöss visar allvarlig inflammation och ökad kolon vikter (data visas ej). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Bestäm kvalitet avföring genom att placera djur i ren behållare tills den har passeratpall: 0 - none; 1 - mjuk avföring; 2 - vattniga och / eller blodig avföring.
- Bestäm allmänna hälsan hos animaliska förekomst av följande sjukdomstecken: 0 - ingen krökt kroppshållning, pensel päls eller hud lesioner; 1 - någon av följande närvarande: krökt kroppshållning, pensel päls, eller hudskador.
- Bestäm förekomst av rektal prolaps: 0 - frånvarande; 1 - nuvarande (Figur 2B).
- Offra djur genom CO2 inandning följt av halsdislokation när de har förlorat 20% av sin start kroppsvikt eller vid önskad tidpunkt, vilket som kommer först. Klinisk sjukdom är oftast uppenbart börjar vid vecka 5 efter repletion.
- Bedöm för sjukdomens svårighetsgrad som tidigare beskrivits 5,7.
- Tilldela kliniska poäng som i steg 6,1 8.
- Mät kolon längd och vikt (figur 2C).
- Utför histologisk analys av inflammation5.
- Bestäm spontan cytokinexpression i tarmvävnaden Explantation kulturer 9, noder kröslymfknutor 10, och / eller serum 11.
- Kortfattat, för Explantation kulturer 9, ta bort kolon efter avlivning, öppen längs och ren med PBS. Inkubera kolon på en orbital skakanordning inställd på 250 rpm i fullständigt medium under 30 min vid rumstemperatur.
- Chop vävnad i små bitar och inkuberades vid 37 ° C i fullständigt medium under 24 h. Samla upp supernatanten och användning för kvantifiering av cytokiner per 100 mg vävnad genom ELISA.
- Utför ex vivo karakterisering av T-cells fenotyper och / eller funktion 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cirka 10 x 10 6 CD4 + CD45RB hög T-celler från 10 mjälte från vuxna C57BL / 6 donator möss är tillförlitligt isolerade. Detta antal kommer att variera beroende på ålder och stam av donator mus och kompetensen hos forskaren. När 4 x 10 5 C57BL / 6 CD4 + CD45RB hög T-celler överförs till C57BL / 6 Rag1 - / - mottagarmöss, kliniska sjukdomstecken uppstår runt vecka 5 efter repletion eller tidigare om möss är genetiskt mottagliga för allvarligare sjukdom ( Figur 2, 3) 11,12. CD3 + T-celler sett ackumuleras i kolon av Rag1 - / - mottagare så tidigt som 3 veckor (Figur 3A) 12.
Figur 3: Överföring av vildtyp CD4 + CD45RB hög T-celler in i Rag1 - / - och RKO / δ KD mottagare inducerar kronisk tarminflammation 12 (A) (Ursprunglig förstoring 10X, H & E och CD3 immunohistokemi).. H & E färgning (toppanelerna) illustrerar epitelial hyperplasi, inflammatoriska cellinfiltrat och crypt abscesser (pil) som finns i RKO / δ KD mottagare men inte Rag1 - / - mottagare. Kolon från RKO / δ KD mottagarmössen visade markant ansamling av CD3 + T-celler genom CD3 IHC (bottenpaneler) jämfört med kolon från Rag1 - / - mottagare. (B) Kolon från RKO / δ KD mottagarmössen visade mer allvarlig inflammation jämfört med kolon frOm Rag1 - / - recipientmöss som bestäms av histologi scoring. (C, D) Kolon Explantation kulturer från RKO / δ KD mottagarmöss utsöndrade mindre IL-10 (C) och mer IL-12p40 (D) än gjorde kolon Explantation kulturer från Rag1 - / -. Mottagarmöss Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Vi har tidigare publicerats som adoptiv cellöverföring T in Nfil3 - / - / Rag1 - / - dubbel knockout mottagare (NRDKO) utveckla en svårare kolit jämfört med Rag1 - / - mottagarmöss (Figur 2) 11. NFIL3 reglerar negativt IL-12p40 i murina kolonmakrofager oberoende av dess IL-10-inducerande effekter 13. Dysreglering av IL-12p40 och IL-10 är inblandad i bananogenesis av humant IBD 1. Sålunda okontrollerad IL-12p40 produktion i adoptiv överföring NDRKO mottagande möss resulterar i en snabbare sjukdomsutveckling, såsom visas genom viktförlust (Figur 2A). Vissa NRDKO mottagarmössen utvecklade svår infektion med rektal prolaps (Figur 2B). Grovt är kolon från NRDKO mottagarmöss förtjockade och förkortas, och representerar ett stort inflöde av inflammatoriska celler i kolon, jämfört med Rag1 - / - mottagarmöss (figur 2C).
Jämförelsevis, i Rag1 - / - möss med en icke fungerande PI3K katalytisk subenhet p110δ i icke-lymfocytpopulationer (RKO / δ KD), inducerar CD4 + CD45RB hög T-cells en lika snabb och svår klinisk sjukdomsförlopp jämfört med NRDKO möss (Figur 3) 12. Histologisk analys vid 3 veckor visar kolonvävnad hypertrofi, inflammatory cellinfiltrat och crypt abscesser (pil) i RKO / δ KD mottagare jämfört med Rag1 - / - mottagare (Figur 3A). Mottagare möss i detta experiment avlivades vid 3 veckor på grund av att ett betydande antal som hade förlorat 20% av sin ursprungliga kroppsvikt. Histologiska poäng, som bestäms av en patolog blind för experimentgrupperna och utifrån specifika kriterier som utvecklats i vårt labb 12, var högre i RKO / δ KD mottagarmöss jämfört med Rag1 - / - mottagarmöss (Figur 3B). Dessutom spontan cytokinproduktion från colonic Explantation kulturer visade minskad IL-10 och förbättrade IL-12p40-produktion genom RKO / δ KD mottagarmöss jämfört med Rag1 - / - mottagarmöss (figur 3C, D) 12. Återigen, ökade IL-12p40 och minskad IL-10 produktion är inblandad i patogenesen av human IBD 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi en steg-för-steg-protokoll inducerande colonic inflammation hos möss genom adoptiv överföring av CD4 + CD45RB + T-celler in i möss med immunbrist. Vi använde C57BL / 6 donator mjältar och syngena Rag1 - / - mottagarmöss, även om andra stammar (t.ex. BALB / c, 129S6 / SvEv, icke-feta diabetiska (NOD)) och genetiska modeller av immunbrist (t.ex. SCID, Rag2 - / -) kan också användas 4,14-16. Det är väl etablerat att bakgrundsstammen påverkar experimentell kolit svårighetsgrad hos möss 1. Dessutom enterfloran i en mus varierar stort mellan anläggningar, även mellan de inom samma institution 6,17. Medan figurerna 2 och 3 inte visar utvecklingen av kolit i Rag1 - / - möss vid 4 veckor efter överföring, i vårt och andras erfarenheter Rag1 - / - mottagare utvecklar cliniska sjukdomar mellan 6 och 9 veckor efter överföring av CD4 + CD45RB hög T-celler 18-23. Denna variation i klinisk kurs och sjukdomsuttryck och bör beaktas vid upprättande denna modell av experimentell kolit att minimera inom och mellan experimentell inkonsekvens.
Ett kritiskt steg för reproducerbarhet detta experiment är FACS isolering av rena populationer av CD4 + CD45RB höga celler utan rest aktiverade / minne / regulatoriska T-celler. Detta involverar en skicklig förståelse av flödescytometri. Det är viktigt att välja icke livskraftiga och CD4-celler först negativt. Sedan, med hjälp av en enkel histogram för CD45RB-PE celler markerar den högsta 40% av cellerna att representera CD45RB höga T-celler och lägst 20% som CD45RB låga T-celler. Andra markörer för att överväga att använda för isolering av naiva CD4 + T-celler CD62L och CD25, men i vår erfarenhet CD45RB hög låg separation är tillräcklig och reproducerbar 5. Dessutom är det möjligt att variera förhållandet CD45RB hög att CD45RB låga T-celler som överförs till mottagare för att studera effekterna av regel T-cellspopulationer på sjukdomsfenotyp. Arbeta med någon som är bekant med flödescytometri initialt att ställa in FACS-protokollet och sedan använda det protokollet i framtida experiment. Dessutom kan ett steg där signifikant variation kan påverka resultaten i detta protokoll är den intraperitoneala injektionen av T-celler in i mottagarmöss. Här kan inom och mellan försöks variabilitet kraftigt påverka resultatet av försöket. Det föreslås att den som utför detta steg är bekväm med hanteringsmöss och med injektionsteknik för att minimera variabiliteten i kvalitet och kvantitet av celler adoptivt överförda. Dessutom är det viktigt att byta nålar mellan möss, eftersom nålen Avtrubbning kan påverka effekten avintraperitoneal injektion.
Steg i protokollet som kräver optimering inkluderar Avsnitt 3: Anrikning av CD4 + T-celler och Avsnitt 4: Märkning och Sorterings celler. Optimering av cell anrikning CD4 + T beror på magnetsystem som används och bör följa tillverkarens instruktioner. Alternativ för magnetisk cellseparationssystem listas i Tabell över specifika reagenser / utrustning. Det är lämpligt att anrika CD4 + T-celler genom negativ selektion, som direkt märkning denna befolkning kan påverka fenotypen av cellerna. Det finns många antikroppskloner finns tillgängliga för märkning av celler för FACS. Koncentrationen antikropp (steg 4.4) bör optimeras för att säkerställa specifik färgning och för att erhålla en lämplig uppdelning av CD4 + CD45RB T-cellspopulationer under FACS.
Utveckling av detta protokoll kan kräva felsökning. Först, framgången för varje experimentberor på kompetensen hos forskaren och kommer att öka med ökad färdighet i dessa metoder. Dock kan konsekvent erhålla lågt antal T-celler för adoptiv överföring orsakas av att inte hålla cellerna på is under isoleringen, resuspending centrifuge celler för aggressivt, eller användning av splenocyter från unga möss med små mjälte. Dessutom optimerar koncentrationen av anti-CD4 och anti-CD45RB-antikroppar märknings för färgning för att undvika bristfällig eller icke-specifik cellfärgning (se ovan). Om mottagarna utvecklar mycket varierande grader av tarminflammation, är den troligaste orsaken oprecisa intraperitoneal injektionsteknik. Detta bör förbättra med träning och kan övervakas genom immunohistologic färgning av CD3 + celler i tarmen hos mottagande möss. Ytterligare saker att tänka inkludera kön givar- och mottagarländerna möss och normala variationer i penetrationssjukdom. När manliga mottagarmöss används, antingen manliga eller kvinnliga donator möss är enppropriate. Men om kvinnliga mottagarmöss skall användas, måste donatormöss vara kvinnliga 5. I våra och andras erfarenheter, är penetrationen av sjukdom i denna modell 85-90% 5. Det är alltså troligt att vissa möss inte kan utvecklas tarminflammation, har gett andra orsaker till markant variabilitet i sjukdomens svårighetsgrad uteslutits. Tänk på det finns påtaglig variation i fenotyper mellan anläggningar inom en organisation och utanför den med avseende på murina mag floran och praxis som påverkar mikroorganismer 6,17. Således robusthet fenotyp eller kinetik sjukdomen i Rag1 - / - mottagarmöss kan variera mycket utifrån sin plats. Därför är det viktigt att bestämma de bästa parametrarna för dessa experiment baserade på tidslinjen och resultat som erhållits från varje enskild anläggning.
Här beskriver vi den metod för väldefinierad adaptiv överföring murinamodell av kronisk tunntarm och kolon inflammation som liknar människans IBD 5. Detta steg-för-steg-protokollet visar nyckeltekniker för en framgångsrik utveckling av denna metod för forskningsändamål. Detta är en särskilt användbar djurmodell av human IBD, eftersom den tillåter för synkronisering av sjukdom och manipulation av olika cellpopulationer. Men de immundefekta mottagarmössen genetiskt modifierade utvecklas utan mogna adaptiva immunceller, vilket sannolikt påverkar nedströms sjukdomsutfall. Trots detta kommer den metod som beskrivs här vara mycket användbara i framtida studier som bestämmer effekten av den enter mikrobiota, medfödda immunceller, och adaptiva immun regulatoriska celler i patogenesen av human IBD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av amerikanska Gastroenterological Association (AGA) Forskning Scholars Award och Crohns och kolit Foundation of America (CCFA) Career Development Award (till ENS), NIH NIDDK F30 DK089692 (till ECS) och University of North Carolina Center for Gastrointestinal Biologi och sjukdom Grant P30 DK34987 (Histologi Kärna). UNC flödescytometri Core Facility stöds delvis av en NCI Center Kärna Support Grant (P30CA016086) till UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center. Vi tackar Luke B. Borst från North Carolina State University College of Veterinary Medicine för hans hjälp med histopatologisk analys och immunohistokemi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 10x PBS | Gibco | 14200075 | |
| 12 mm x 75 mm round-bottom tube | Falcon | 352052 | |
| 15 ml conical | Corning | 430790 | |
| 26 G x 3/8 Needle | BD Biosciences | 305110 | |
| 50 ml conical | Corning | 430828 | |
| 70 μm Cell Strainer | Fisherbrand | 22363548 | |
| BD IMagnet | BD Biosciences | 552311 | |
| β-mercaptoethanol | Thermo Scientific | 35602 | |
| CD4-FITC IgG2b | eBioscience | 11-0041 | |
| CD45RB-PE IgG2a | BD Pharminogen | 553101 | |
| Complete Media | RPMI-1640, 1% Pen/Strep, 10% FBS, 0.0004% β-ME | ||
| FACS tube + strainer | BD Falcon | 352235 | |
| Glass Microscope Slides | Fisherbrand | 12550A3 | |
| Heat-inactivated FBS | Gemini | 100-106 | |
| Labeling Buffer | 1x PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA | ||
| Lysis Buffer | 0.08% NH4Cl, 0.1% KHCO3, 1 mM EDTA | ||
| MoFlo XDP | Beckman Coulter | ||
| Mouse CD4 T lymphocyte Enrichment Set - DM | BD Biosciences | 558131 | |
| Mouse IgG2a-PE | BD Pharminogen | 553457 | |
| Mouse IgG2b-FITC | eBioscience | 11-4732 | |
| Pasteur pipet | Fisherbrand | 13-678-20D | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100X | Corning Cellgro | 30-002-CI |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri Dish | Fisherbrand | 875713 | |
| Pure Ethanol 200 Proof | Decon Labs | 2705-HC | |
| RPMI-1640 | Gibco | 11-875-093 | |
| Syringe | BD Biosciences | 309597 | |
| Trypan blue | Corning Cellgro | 25-900-CI | |
| Wash Media | RPMI-1640, 1% Pen/Strep, 0.0004% β-ME |
References
- Xavier, R. J., Podolsky, D. K. Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 448 (7152), 427-434 (2007).
- Cho, J. H., Brant, S. R. Recent insights into the genetics of inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 140 (6), 1704-1712 (2011).
- Jostins, L., et al. Host-microbe interactions have shaped the genetic architecture of inflammatory bowel disease. Nature. 491 (7422), 119-124 (2012).
- Powrie, F., Leach, M. W., Mauze, S., Caddle, L. B., Coffman, R. L. Phenotypically distinct subsets of CD4+ T cells induce or protect from chronic intestinal inflammation in C. B-17 scid mice. Int Immunol. 5 (11), 1461-1471 (1993).
- Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: concepts, considerations, and tricks of the trade. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296 (2), 135-146 (2009).
- Ma, B. W., et al. Routine habitat change: a source of unrecognized transient alteration of intestinal microbiota in laboratory mice. PLoS One. 7 (10), e47416 (2012).
- Read, S., Powrie, F. Induction of inflammatory bowel disease in immunodeficient mice by depletion of regulatory T cells. Curr Protoc Immunol. Chapter 15 (Unit 15 13), (1999).
- Maillard, M. H., et al. The Wiskott-Aldrich syndrome protein is required for the function of CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) regulatory T cells. J Exp Med. 204 (2), 381-391 (2007).
- Hegazi, R. A., et al. Carbon monoxide ameliorates chronic murine colitis through a heme oxygenase 1-dependent pathway. J Exp Med. 202 (12), 1703-1713 (2005).
- Kole, A., et al. Type I IFNs regulate effector and regulatory T cell accumulation and anti-inflammatory cytokine production during T cell-mediated colitis. J Immunol. 191 (5), 2771-2779 (2013).
- Kobayashi, T., et al. NFIL3-deficient mice develop microbiota-dependent, IL-12/23-driven spontaneous colitis. J Immunol. 192 (4), 1918-1927 (2014).
- Steinbach, E. C., et al. Innate PI3K p110delta Regulates Th1/Th17 Development and Microbiota-Dependent Colitis. J Immunol. 192 (8), 3958-3968 (2014).
- Kobayashi, T., et al. NFIL3 is a regulator of IL-12 p40 in macrophages and mucosal immunity. J Immunol. 186 (8), 4649-4655 (2011).
- Leach, M. W., Bean, A. G., Mauze, S., Coffman, R. L., Powrie, F. Inflammatory bowel disease in C.B-17 scid mice reconstituted with the CD45RBhigh subset of CD4+ T cells. Am J Pathol. 148 (5), 1503-1515 (1996).
- Powrie, F., et al. Inhibition of Th1 responses prevents inflammatory bowel disease in scid mice reconstituted with CD45RBhi CD4. T cells. Immunity. 1 (7), 553-562 (1994).
- Read, S., Malmstrom, V., Powrie, F. Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 plays an essential role in the function of CD25(+)CD4(+) regulatory cells that control intestinal inflammation. J Exp Med. 192 (2), 295-302 (2000).
- Rogers, G. B., et al. Functional divergence in gastrointestinal microbiota in physically-separated genetically identical mice. Sci Rep. 4, 5437 (2014).
- Fukata, M., et al. The myeloid differentiation factor 88 (MyD88) is required for CD4+ T cell effector function in a murine model of inflammatory bowel disease. J Immunol. 180 (3), 1886-1894 (2008).
- Kurtz, C. C., et al. Extracellular adenosine regulates colitis through effects on lymphoid and nonlymphoid cells. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 307 (3), 338-346 (2014).
- Naganuma, M., et al. Cutting edge: Critical role for A2A adenosine receptors in the T cell-mediated regulation of colitis. J Immunol. 177 (5), 2765-2769 (2006).
- Ranatunga, D. C., et al. A protective role for human IL-10-expressing CD4+ T cells in colitis. J Immunol. 189 (3), 1243-1252 (2012).
- Srikrishna, G., et al. Carboxylated glycans mediate colitis through activation of NF-kappa. B. J Immunol. 175 (8), 5412-5422 (2005).
- Wang, F., et al. IFN-gamma-induced TNFR2 expression is required for TNF-dependent intestinal epithelial barrier dysfunction. Gastroenterology. 131 (4), 1153-1163 (2006).
