Abstract
Der er mange forskellige dyremodeller til rådighed til at studere patogenesen af humane inflammatoriske tarmsygdomme (IBD), hver med sine egne fordele og ulemper. Vi beskriver her en eksperimentel colitis model, der er initieret af adoptiv overførsel af syngene milt CD4 + CD45RB høj T-celler i T og B-celle-mangel recipientmus. CD4 + CD45RB high T-cellepopulation, der i vid udstrækning består af naive effektorceller er stand til at inducere kronisk intestinal inflammation, der ligner vigtige aspekter af human IBD. Denne metode kan manipuleres til at studere aspekter af sygdommen indtræden og progression. Derudover kan den bruges til at studere funktionen af medfødte, adaptive, og regulatoriske immuncellepopulationer, og den rolle, miljømæssige eksponeringer, dvs. mikrobiota i tarmbetændelse. I denne artikel illustrerer vi metoden til at inducere colitis med en trin-for-trin-protokol. Denne incLudes en video demonstration af vigtig tekniske aspekter, der er nødvendige til at udvikle denne musemodel af eksperimentel colitis til forskningsformål.
Protocol
BEMÆRK: Sørg for, at alle animalske protokoller godkendes af og i overensstemmelse med Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) regler og National Research Council Guide til pleje og anvendelse af forsøgsdyr. Donor-mus kan være enten mand eller kvinde, men recipientmus bør være hankøn. Hvis kvindelige modtagere skal anvendes, skal donormus være kvinde 5. Oprethold kolonier ved hjælp af regelmæssig, ikke-sterile strøelse og ikke-syrnet vand, da disse kan påvirke tarmens mikroflora, og dermed colitis fænotype af musene 5,6.
1. Eksperimentel Forberedelse
- Brug iskolde medier og buffere. Hold celler på is under hele forsøget.
- Udfør eksperimentet i steril biohazard hætte hjælp steril teknik.
2. Isolering af milt-T-celler
- Aflive donor mus / mus i CO 2 kammer efterfulgt af cervikal dislocation. Spray maven med 70% ethanol.
- Lav en vandret snit i maven og skræl væk huden for at blotlægge peritoneum. Hold bughinden væk fra de indre organer med pincet og foretage et snit i venstre abdominale peritoneum at afsløre og udskære milten.
- Placer milten i 10 ml komplette medier i en petriskål. Fjern og kassér overskydende væv fra milt.
- Brug 2 steriliserede objektglas at knuse og drille hinanden milt i encellede suspension. Filter cellesuspension gennem en 70 um si i en 50 ml konisk rør og skyl si med 5 ml komplette medier. Placer op til 5 milten i en 50 ml konisk rør.
- Centrifuger cellerne ved 450 xg i 7 min. Supernatanten kasseres ved at hælde ud eller ved vakuumsugning i affaldsbeholder.
- Forsigtigt resuspender celler i 5 ml pr milt lysisbuffer at lysere røde blodlegemer i 10 minutter ved stuetemperatur. Tilføj et tilsvarende volumen komplette medier (5 ml pr milt) til røret.
- Forsigtigt resuspender celler i 10 ml Mærkning Buffer.
- Tæl celler ved trypan blå udelukkelse.
- Fjern 20 pi cellesuspension og tilføje til 180 pi trypanblåt til et mikrofugerør og blandes. Efter 5 minutter tilsættes 10 pi mærkede celler at hæmocytometer og tælle ikke-blå celler under mikroskopet. Bestem antallet af levedygtige celler. Kassér celle / trypanblåt mix.
- Centrifuger cellerne i 10 ml Mærkning buffer ved 450 xg i 7 min. Supernatanten kasseres ved at hælde ud eller ved vakuumsugning i affaldsbeholder.
3. Berigelse af CD4 + -T-celler
BEMÆRK: Følg producentens anvisninger for bestemte produkter, der anvendes i dette afsnit.
- Forsigtigt resuspender celler til en enkelt-cellesuspension af 20 x 10 6 celler / ml i kold LabelING Buffer.
- Tilsæt 5 pi per 1 x 10 6 celler af biotinylerede CD4 T-celle berigelse antistoffer. Cellerne inkuberes på is i 15 min.
- Tilføj 10x volumen Mærkning Buffer. Centrifuger cellerne ved 450 x g i 7 min. Aspirere omhyggeligt alle supernatanten ved hjælp vakuumsug i affaldsbeholder.
- Grundigt vortexes streptavidin-konjugeret magnetiske partikler. Tilsæt 5 pi partikler per 1 x 10 6 celler.
- Bland grundigt, men forsigtigt. Hold mix på 6-12 ° C i 30 minutter.
- Tilføj Mærkning Buffer til en koncentration på 20-80 x 10 6 celler / ml. Overfør op til 1,0 ml mærkede celler pr 12 x 75 mm rundbundet reagensglas (benævnt "positive fraktion tube").
- Placer hver positiv-fraktion rør på magnet for 6-8 min.
- Med de positive-fraktion rør stadig på magneten, omhyggeligt overføre supernatanten fra positiv-fraktion rør med glas Pasteur-pipette til en ny steril 50 ml konisk rør (referred "den berigede fraktion"). Dette berigede fraktion indeholder CD4 + T-celler. Pas på ikke at forstyrre de mærkede celler tiltrukket til magneten.
- Resuspender cellerne tilbage i de positive-fraktion rør i det samme volumen Mærkning Buffer som i trin 3.6 ved pipettering op og ned kraftigt. Placer styret fraktion rør tilbage på magnet for 6-8 min.
- Med positiv fraktion rør stadig på magneten, omhyggeligt overføre supernatant (fraktion, CD4 +) fra positiv fraktion rør med glas Pasteur-pipette til sterile 50 ml konisk rør fra trin 3.8 uden at forstyrre celler fastgjort til magneten.
- Gentag trin 3,9-3,10 at forøge udbyttet af CD4 + T-celler opnået. Fortsæt protokol ved at anvende berigede fraktion (CD4 + -celler).
4. Mærkning og sortering Cells 7
- Centrifuge berigede celler ved 450 xg i 7 min. Supernatanten kasseres ved at hælde ud eller vakuum Suge-ion i affaldsbeholder.
- Resuspender cellerne i 1 ml Mærkning buffer. Fjern prøve af celler til at tælle og vurdere for cellernes levedygtighed ved trypanblåt udelukkelse som i trin 2.9.
- Tilføj et volumen på Mærkning Buffer til 10 x 10 6 celler / ml; hvis celler er allerede <10 x 10 6, centrifugeres ved 450 xg i 7 min, kasseres supernatanten ved at hælde eller vakuumsug i affaldsbeholderen og tilføje volumen Mærkning Buffer til 10 x 10 6 celler / ml.
- Opsætning særskilte portioner af ca. 5-10 × 10 5 celler hver for ufarvede, isotype-farves, og single-farvede kontrol celler i mikrocentrifugerør.
- Tilsæt 5 ug / ml CD4-FITC og 1 ug / ml CD45RB-PE til celler. Tilføj isotypekontrol pletter og enlige pletter i samme koncentration til passende portioner i mikrocentrifugerør. Bland godt, men forsigtigt og inkuberes på is beskyttet mod lys i 30 minutter.
- Tilføj 10x volumen Mærkning Buffer til celler og kontrols. Centrifuger 450 xg i 7 min. Supernatanten kasseres ved vakuumsugning i affaldsbeholder.
- Resuspendér i Mærkning Buffer til volumen i trin 4.5. Centrifuger 450 xg i 7 min. Supernatanten kasseres ved vakuumsugning i affaldsbeholder.
- Resuspendér i Mærkning Buffer til 10 x 10 6 celler / ml. Pass celler gennem 70 um si i FACS rør. Hold på is beskyttet mod lys, indtil klar til FACS.
- Opsætning og bestemme passende kompensation på cellesorteringsapparat med ufarvede celler og enkelte-farvede knapper.
- Udeluk ikke-levedygtige celler med fremadrettede og side-scatter gating (figur 1A). Opsætning gating for CD4 + og CD45RB + celler med isotype-farvede knapper. Gate celler på CD4 + -populationen.
- Sorter CD4 + celler i CD45RB høj og CD45RB lave populationer hjælp af en simpel histogram for PE-farvede celler i rør med 2 ml komplet medium. Den CD45RB høj + CD45RB + celler (CD45RB høj), og CD45RB lav befolkningstæthed er den laveste 20% af CD4 + CD45RB + -celler (CD45RB lav, figur 1B).
Figur 1: repræsentant flowcytometri afbildninger af CD4 + CD45RB T-cellepopulationer under FACS-analyse (A - C) FITC CD4- og PE CD45RB bejdset splenocytter fra donor C57BL / 6-mus blev sorteret ved FACS i CD4 + CD45RB høj og CD4 +. CD45RB lav T-celle populationer. (A) Doublet hændelser blev udelukket på forward scatter plot. (B) Lymfocytter gated i den forreste og side scatter plot. (C) CD4 + (D) CD4 + CD45RB + -T-celler blev afbildet på et PE versus Events histogram. CD4 + CD45RB lav celler blev anset for at være den laveste 20% af CD45RB + celler. CD4 + CD45RB høje celler blev defineret som den højeste 40% af CD45RB + celler.
- Kør en portion af hver cellepopulation på FACS maskine at vurdere renheden af populationer.
- Centrifuge sorteres cellerne ved 450 xg i 7 min. Resuspender i 1 ml PBS. Fjern prøve af celler til at tælle og vurdere for cellernes levedygtighed ved trypanblåt udelukkelse som i trin 2.9.
5. Injektion af celler i modtagere
- Resuspender sorterede celler til 4 x 10 6 celler / ml (CD45RB høj) eller 2 x 10 6 celler / ml (CD45RB lav) i PBS.
- Overfør 100 ul CD45RB høje celler per modtager til ny steril slange. Tilsæt 100 pi PBS prmodtager til dette rør. Således total injektionsvolumen pr dyr er 200 pi, og den samlede mængde af celler pr modtageren er 4 x 10 5 CD4 + CD45RB høje naive T-celler.
- Hvis forsøgsgruppe modtager T regulatoriske celler ønskes, overføre 100 pi CD45RB høje celler per modtager til ny steril slange. Tilsæt 100 pi CD45RB lave celler pr modtager til det samme rør. Total injektionsvolumen pr dyr er 200 pi; forholdet CD45RB high: CD45RB lav celler er 2: 1.
- Indsprøjtes 100 pi CD45RB høj eller CD45RB høj / CD45RB lav CD4 + celler intraperitonealt i højre og venstre side af maven (i alt 200 ul) af hver modtager.
6. Overvågning for sygdomsprogression i recipientdyr
- For at vurdere den kliniske status af de modtagende dyr, tildele samlede kliniske scoringer for følgende parameters 8 på dagen for injektion, derefter ugentligt og på tidspunktet for aflivning:
- Bestem spilde ved at måle vægttab: 0 - ingen vægttab; 1 - 0,1-10% tab af oprindelige kropsvægt; 2 - mere end 10% tab af kropsvægten (figur 2A).
Figur 2: Kliniske og makropatologiske tegn på inflammation opstår efter overførsel af vildtype CD4 + CD45RB høj T-celler i RAG1 - / - og NRDKO recipientmus 11 (A) NRDKO modtagere mistede i gennemsnit 10% af deres oprindelige kropsvægt med 5. uger efter indsættelse, mens RAG1- / - Modtagere udviste ikke kliniske tegn på sygdom på dette tidspunkt. Hvert punkt repræsenterer den gennemsnitlige procentdel af kropsvægten for kohorten ± SEM. **, P <0,005. (B) Nogle mus udviklede alvorlige tarmbetændelse, hvilket fremgår af tilstedeværelsen af rektal prolaps. Dette er et repræsentativt billede af rektal prolaps i en NRDKO modtager mus. (C) Groft, koloner fra både RAG1 - / - og NRDKO recipientmus er fortykket og forkortet i forhold til koloner fra RAG1 - / - og NRDKO mus uden T-celle adoptiv overførsel. Koloner fra NRDKO recipientmus viser alvorlig betændelse og øget kolon vægte (data ikke vist). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
- Bestem kvaliteten af afføring ved at placere dyr i ren beholder, indtil den har passerettaburet: 0 - ingen; 1 - blød afføring; 2 - vandig og / eller blodig afføring.
- Bestem generelle sundhed af animalske tilstedeværelse af følgende tegn på sygdom: 0 - ingen krumrygget stilling, strittede pels, eller hudlæsioner; 1 - en af følgende nuværende: krum stilling, strittede pels, eller hudlæsioner.
- Bestem tilstedeværelse af rektal prolaps: 0 - fraværende; 1 - til stede (figur 2B).
- Sacrifice dyr af CO 2 inhalation efterfulgt af cervikal dislokation, når de har mistet 20% af deres udgangspunkt kropsvægt eller på ønsket tidspunkt, hvad der kommer først. Klinisk sygdom er typisk tydeligt begyndende ved uge 5 efter genopfyldning.
- Vurdere om sygdommens sværhedsgrad som tidligere beskrevet 5,7.
- Tildel kliniske scoringer som i trin 6.1 8.
- Mål kolon længde og vægt (Figur 2C).
- Udfør histologisk analyse af inflammation5.
- Bestem spontan cytokin-ekspression i intestinale væv eksplantatkulturer 9, mesenteriske lymfeknuder 10, og / eller serum 11.
- Kort fortalt for eksplantatkulturer 9, fjerne koloner efter aflivningen åben på langs, og ren med PBS. Inkuber koloner på en orbitalryster indstillet på 250 rpm i komplette medier i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Hak væv i små stykker og inkuberet ved 37 ° C i komplette medier i 24 timer. Opsaml supernatanten og bruge til kvantificering af cytokiner per 100 mg væv ved ELISA.
- Udfør ex vivo karakterisering af T-celle-fænotyper og / eller funktion 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ca. 10 x 10 6 CD4 + CD45RB high T-celler fra 10 milt fra voksne C57BL / 6 donormus er pålideligt isoleret. Dette antal vil variere afhængig af alder og stammen af donor mus og færdighed af forskeren. Når 4 x 10 5 C57BL / 6 CD4 + CD45RB høj T-celler overføres til C57BL / 6 RAG1 - / - recipientmus, kliniske sygdomstegn opstår omkring uge 5 post-repletion eller tidligere, hvis mus er genetisk modtagelige for mere alvorlig sygdom ( Figur 2, 3) 11,12. CD3 + T-celler ses akkumulere i koloner af RAG1 - / - modtagere så tidligt som 3 uger (figur 3a) 12.
Figur 3: Overførsel af vildtype CD4 + CD45RB high T-celler i RAG1 - / - og RKO / δ KD modtagere inducerer kronisk intestinal inflammation 12 (A) (Original forstørrelse 10X, H & E og CD3 immunhistokemi).. H & E-farvning (øverste paneler) viser epitel-hyperplasi, inflammatoriske celle- infiltrater og kryptabscesser (pil) er til stede i RKO / δ KD modtagere, men ikke RAG1 - / - modtagere. Koloner fra RKO / δ KD recipientmus demonstreret markant ophobning af CD3 + T-celler ved CD3 IHC (nederst paneler) sammenlignet med koloner fra RAG1 - / - modtagere. (B) Colons fra RKO / δ KD recipientmus demonstrerede mere alvorlig betændelse i forhold til kolon from RAG1 - / - recipientmus som bestemt ved histologi scoring. (C, D) Colon eksplantatkulturer fra RKO / δ KD recipientmus udskilles mindre IL-10 (C) og mere IL-12p40 (D) end gjorde colon eksplantatkulturer fra RAG1 - / -. Recipientmus Klik her for at se en større version af denne figur.
Vi har tidligere udgivet, at adoptiv T-celle overførsel til Nfil3 - / - / RAG1 - / - dobbelt knockout modtagere (NRDKO) udvikle mere alvorlig colitis forhold til RAG1 - / - recipientmus (figur 2) 11. NFIL3 negativt regulerer IL-12p40 i murine colon makrofager uafhængigt af IL-10-fremkaldende virkninger 13. Dysregulering af IL-12p40 og IL-10 er impliceret i stienogenesis af human IBD 1. Således ukontrolleret IL-12p40 produktionen i adoptiv overførsel NDRKO recipientmus resulterer i hurtigere sygdomsprogression som vist ved vægttab (figur 2A). Nogle NRDKO recipientmus udviklede svær sygdom resulterer i rektalprolaps (figur 2B). Groft, er koloner fra NRDKO recipientmus fortykket og forkortes, der repræsenterer en stor tilstrømning af inflammatoriske celler ind i tyktarmen, sammenlignet med RAG1 - / - recipientmus (figur 2C).
Forholdsvis, i RAG1 - / - mus med en nonfunctional PI3K katalytisk subunit p110δ i ikke-lymfocytpopulationer (RKO / δ KD), CD4 + CD45RB høj T-celle repletion inducerer et lige så hurtigt alvorlige kliniske sygdomsforløb sammenlignet med NRDKO mus (figur 3) 12. Histologisk analyse efter 3 uger viser colonvæv hypertrofi, inflammastillende celleinfiltrater og kryptabscesser (pil) i RKO / δ KD modtagere sammenlignet med RAG1 - / - modtagere (figur 3A). Recipient mus i dette forsøg blev aflivet efter 3 uger på grund af et betydeligt antal, der havde mistet 20% af deres oprindelige legemsvægt. Histologiske scores, som bestemt ved en patolog blindet for de eksperimentelle grupper og ud fra bestemte kriterier, der er udviklet i vores laboratorium 12, var højere i RKO / δ KD recipientmus sammenlignet med RAG1 - / - recipientmus (figur 3B). Derudover demonstrerede spontan cytokin produktion fra colon eksplantatkulturer faldt IL-10 og forøget IL-12p40 produktionen af RKO / δ KD recipientmus forhold til RAG1 - / - recipientmus (figur 3C, D) 12. Igen forøget IL-12p40 og faldt IL-10-produktion er impliceret i patogenesen af human IBD 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en trin-for-trin-protokollen inducere colon inflammation i mus ved adoptiv overførsel af CD4 + CD45RB + -T-celler i immunsvækkede mus. Vi brugte C57BL / 6 donor milt og syngene RAG1 - / - recipientmus, selv om andre stammer (fx BALB / c, 129S6 / SvEv, ikke-fede diabetiske (NOD)) og genetiske modeller af immundefekt (fx SCID, rag2 - / -) kan også anvendes 4,14-16. Det er velkendt, at baggrunden stammen påvirker eksperimentel colitis sværhedsgraden i mus 1. Desuden den enteriske mikrobiota i en murine population varierer meget mellem anlæg, selv mellem dem, der i den samme institution 6,17. Mens figur 2 og 3 ikke viser udviklingen af colitis i RAG1 - / - mus 4 uger efter indsættelse, i vores og andres erfaringer RAG1 - / - modtagere udvikle clinisk sygdom mellem 6 og 9 uger efter overdragelsen af CD4 + CD45RB høj T-celler 18-23. Denne variation i kliniske forløb og sygdom udtryk og bør tages i betragtning ved fastlæggelsen af denne model for eksperimentel colitis at minimere inden for og mellem eksperimenterende inkonsekvens.
Et afgørende skridt for reproducerbarheden af dette eksperiment er FACS isolation af rene populationer af CD4 + CD45RB høje celler uden resterende aktiverede / hukommelse / regulatoriske T-celler. Dette indebærer en dygtig forståelse af flowcytometri. Det er vigtigt at vælge først negativt ikke-levedygtige og CD4-celler. Så ved hjælp af en simpel histogram for CD45RB-PE-celler, vælges den højeste 40% af cellerne til at repræsentere CD45RB high T-celler og den laveste 20% som de CD45RB lave T-celler. Andre markører overveje at bruge til isolering af naive CD4 + T-celler CD62L og CD25, men i vores erfaring CD45RB høj lav adskillelse er tilstrækkeligt og reproducerbar 5. Derudover er det muligt at variere forholdet mellem CD45RB høj til CD45RB lav T-celler overført til modtagerne til at undersøge virkningerne af regulatoriske T-cellepopulationer på sygdom fænotype. Arbejde med en person, der er fortrolig med flowcytometri i første omgang at oprette FACS-protokollen og derefter bruge denne protokol i fremtidige forsøg. Derudover en trin hvor signifikant variation kan påvirke resultater i denne protokol er den intraperitoneal injektion af T-celler i recipientmus. Her kan inden for og mellem forsøgslederen variabilitet i høj grad påvirke resultatet af forsøget. Det foreslås, at den person, der udfører dette trin er komfortabel med håndtering mus og med injektionsteknik for at minimere variation i kvaliteten og kvantiteten af celler adoptivt overført. Derudover er det vigtigt at ændre nåle mellem mus, som nålen dulling kan påvirke effekten afintraperitoneal injektion.
Trin af den protokol, der kræver optimering omfatter Afsnit 3: Berigelse af CD4 + T-celler og Afsnit 4: Mærkning og sortering celler. Optimering af CD4 + T-celle berigelse er afhængig af det magnetiske system, der anvendes, og skal følge producentens anvisninger. Indstillinger for magnetisk celleseparation systemer er anført i tabellen i specifikke reagenser / udstyr. Det er tilrådeligt at berige for CD4 + -T-celler ved negativ selektion, som direkte mærkning denne population kan påvirke fænotypen af cellerne. Der er mange antistof kloner tilgængelige til mærkning af celler til FACS. Koncentrationen af antistof (trin 4.4) bør optimeres for at sikre specifik farvning og for at opnå en tilstrækkelig adskillelse af CD4 + CD45RB T-celle populationer under FACS.
Udvikling af denne protokol kan kræve fejlfinding. Først succes hvert eksperimentafhænger af beherskelse af forskeren og vil stige med forbedret færdighed i disse metoder. Kan imidlertid konsekvent opnår lave antal af T-celler til adoptiv overførsel være forårsaget af ikke holder cellerne på is under isolering, resuspendering centrifugerede celler for aggressivt eller anvendelse af splenocytter fra unge mus med små milte. Derudover optimere koncentrationen af anti-CD4 og anti-CD45RB mærkning af antistoffer til farvning for at undgå mangelfuld eller ikke-specifik celle-farvning (se ovenfor). Hvis modtagerne udvikler meget forskellig fra tarmbetændelse, den mest sandsynlige årsag er upræcis intraperitoneal injektion teknik. Dette skulle forbedre med praksis og kan overvåges ved immunohistologiske farvning af CD3 + celler i tarmene af recipientmus. Yderligere ting at overveje omfatte køn donor- og modtagerlande mus og normale variationer i penetration sygdom. Når der anvendes mandlige recipientmus, enten donor mus er enppropriate. Hvis der imidlertid skal anvendes kvindelige recipientmus skal donormus være kvinde 5. I vores og andres erfaringer, penetration af sygdom i denne model er 85-90% 5. Det forventes således, at nogle mus ikke kan udvikle tarmbetændelse, har givet andre årsager til markant variation i sygdommens sværhedsgrad blevet udelukket. Husk der er markant variation i fænotyper mellem anlæg i en organisation, og uden det med hensyn til murine gastrointestinal mikrobiota og praksis, der påvirker mikrobiota 6,17. Således robustheden af fænotype eller kinetik sygdom i RAG1 - / - recipientmus kan variere meget baseret på en placering. Derfor er det vigtigt at bestemme de bedste parametre for disse eksperimenter baseret på tidslinjen og de opnåede resultater fra hver enkelt facilitet.
Her beskriver vi den metode af velkarakteriserede adaptive transfer murinemodel af kronisk tyndtarm og colon inflammation, der ligner human IBD 5. Dette trin-for-trin-protokol illustrerer vigtige teknikker til en vellykket udvikling af denne metode til forskningsformål. Dette er en særlig nyttig dyremodel for human IBD, da det giver mulighed for synkronisering af sygdom og manipulation af forskellige cellepopulationer. Imidlertid er immundefekte recipientmus genetisk modificeret til at udvikle sig uden modne adaptive immunceller, som sandsynligvis påvirker downstream sygdom resultater. På trods af dette, vil den her beskrevne fremgangsmåde være meget nyttig i fremtidige undersøgelser bestemmer virkningen af det enteriske mikrobiota, medfødte immunceller, og adaptive immune regulatoriske celler i patogenesen af human IBD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af American Gastroenterologisk Association (AGA) Forskning Scholars Award og Crohns og Colitis Foundation of America (CCFA) Karriereudvikling Award (til SZS), NIH NIDDK F30 DK089692 (ECS), og University of North Carolina Center for Gastrointestinal Biologi og Sygdom Grant P30 DK34987 (Histologi Core). UNC Flowcytometri Core Facility støttes delvist af et NCI center Core Support Grant (P30CA016086) til UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center. Vi takker Luke B. Borst fra North Carolina State University College of Veterinary Medicine for hans hjælp med histopatologisk analyse og immunhistokemi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 10x PBS | Gibco | 14200075 | |
| 12 mm x 75 mm round-bottom tube | Falcon | 352052 | |
| 15 ml conical | Corning | 430790 | |
| 26 G x 3/8 Needle | BD Biosciences | 305110 | |
| 50 ml conical | Corning | 430828 | |
| 70 μm Cell Strainer | Fisherbrand | 22363548 | |
| BD IMagnet | BD Biosciences | 552311 | |
| β-mercaptoethanol | Thermo Scientific | 35602 | |
| CD4-FITC IgG2b | eBioscience | 11-0041 | |
| CD45RB-PE IgG2a | BD Pharminogen | 553101 | |
| Complete Media | RPMI-1640, 1% Pen/Strep, 10% FBS, 0.0004% β-ME | ||
| FACS tube + strainer | BD Falcon | 352235 | |
| Glass Microscope Slides | Fisherbrand | 12550A3 | |
| Heat-inactivated FBS | Gemini | 100-106 | |
| Labeling Buffer | 1x PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA | ||
| Lysis Buffer | 0.08% NH4Cl, 0.1% KHCO3, 1 mM EDTA | ||
| MoFlo XDP | Beckman Coulter | ||
| Mouse CD4 T lymphocyte Enrichment Set - DM | BD Biosciences | 558131 | |
| Mouse IgG2a-PE | BD Pharminogen | 553457 | |
| Mouse IgG2b-FITC | eBioscience | 11-4732 | |
| Pasteur pipet | Fisherbrand | 13-678-20D | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100X | Corning Cellgro | 30-002-CI |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri Dish | Fisherbrand | 875713 | |
| Pure Ethanol 200 Proof | Decon Labs | 2705-HC | |
| RPMI-1640 | Gibco | 11-875-093 | |
| Syringe | BD Biosciences | 309597 | |
| Trypan blue | Corning Cellgro | 25-900-CI | |
| Wash Media | RPMI-1640, 1% Pen/Strep, 0.0004% β-ME |
References
- Xavier, R. J., Podolsky, D. K. Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 448 (7152), 427-434 (2007).
- Cho, J. H., Brant, S. R. Recent insights into the genetics of inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 140 (6), 1704-1712 (2011).
- Jostins, L., et al. Host-microbe interactions have shaped the genetic architecture of inflammatory bowel disease. Nature. 491 (7422), 119-124 (2012).
- Powrie, F., Leach, M. W., Mauze, S., Caddle, L. B., Coffman, R. L. Phenotypically distinct subsets of CD4+ T cells induce or protect from chronic intestinal inflammation in C. B-17 scid mice. Int Immunol. 5 (11), 1461-1471 (1993).
- Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: concepts, considerations, and tricks of the trade. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296 (2), 135-146 (2009).
- Ma, B. W., et al. Routine habitat change: a source of unrecognized transient alteration of intestinal microbiota in laboratory mice. PLoS One. 7 (10), e47416 (2012).
- Read, S., Powrie, F. Induction of inflammatory bowel disease in immunodeficient mice by depletion of regulatory T cells. Curr Protoc Immunol. Chapter 15 (Unit 15 13), (1999).
- Maillard, M. H., et al. The Wiskott-Aldrich syndrome protein is required for the function of CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) regulatory T cells. J Exp Med. 204 (2), 381-391 (2007).
- Hegazi, R. A., et al. Carbon monoxide ameliorates chronic murine colitis through a heme oxygenase 1-dependent pathway. J Exp Med. 202 (12), 1703-1713 (2005).
- Kole, A., et al. Type I IFNs regulate effector and regulatory T cell accumulation and anti-inflammatory cytokine production during T cell-mediated colitis. J Immunol. 191 (5), 2771-2779 (2013).
- Kobayashi, T., et al. NFIL3-deficient mice develop microbiota-dependent, IL-12/23-driven spontaneous colitis. J Immunol. 192 (4), 1918-1927 (2014).
- Steinbach, E. C., et al. Innate PI3K p110delta Regulates Th1/Th17 Development and Microbiota-Dependent Colitis. J Immunol. 192 (8), 3958-3968 (2014).
- Kobayashi, T., et al. NFIL3 is a regulator of IL-12 p40 in macrophages and mucosal immunity. J Immunol. 186 (8), 4649-4655 (2011).
- Leach, M. W., Bean, A. G., Mauze, S., Coffman, R. L., Powrie, F. Inflammatory bowel disease in C.B-17 scid mice reconstituted with the CD45RBhigh subset of CD4+ T cells. Am J Pathol. 148 (5), 1503-1515 (1996).
- Powrie, F., et al. Inhibition of Th1 responses prevents inflammatory bowel disease in scid mice reconstituted with CD45RBhi CD4. T cells. Immunity. 1 (7), 553-562 (1994).
- Read, S., Malmstrom, V., Powrie, F. Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 plays an essential role in the function of CD25(+)CD4(+) regulatory cells that control intestinal inflammation. J Exp Med. 192 (2), 295-302 (2000).
- Rogers, G. B., et al. Functional divergence in gastrointestinal microbiota in physically-separated genetically identical mice. Sci Rep. 4, 5437 (2014).
- Fukata, M., et al. The myeloid differentiation factor 88 (MyD88) is required for CD4+ T cell effector function in a murine model of inflammatory bowel disease. J Immunol. 180 (3), 1886-1894 (2008).
- Kurtz, C. C., et al. Extracellular adenosine regulates colitis through effects on lymphoid and nonlymphoid cells. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 307 (3), 338-346 (2014).
- Naganuma, M., et al. Cutting edge: Critical role for A2A adenosine receptors in the T cell-mediated regulation of colitis. J Immunol. 177 (5), 2765-2769 (2006).
- Ranatunga, D. C., et al. A protective role for human IL-10-expressing CD4+ T cells in colitis. J Immunol. 189 (3), 1243-1252 (2012).
- Srikrishna, G., et al. Carboxylated glycans mediate colitis through activation of NF-kappa. B. J Immunol. 175 (8), 5412-5422 (2005).
- Wang, F., et al. IFN-gamma-induced TNFR2 expression is required for TNF-dependent intestinal epithelial barrier dysfunction. Gastroenterology. 131 (4), 1153-1163 (2006).
