Abstract
Er zijn veel verschillende dierlijke modellen voor het bestuderen van de pathogenese van menselijke inflammatoire darmziekten (IBD), elk met zijn eigen voor- en nadelen. We beschrijven hier een experimentele colitis model dat wordt geïnitieerd door adoptieve overdracht van syngenetische milt CD4 + CD45RB- hoge T-cellen in de T- en B-cel deficiënte muizen ontvanger. De CD4 + CD45RB high T-celpopulatie die grotendeels uit naïeve effectorcellen kan induceren chronische darmontsteking, sterk lijken belangrijke aspecten van menselijke IBD. Deze methode kan worden gemanipuleerd om aspecten van de ziekte ontstaan en de progressie bestuderen. Daarnaast kan het worden gebruikt om de functie van aangeboren, adaptief en regelgevende immuuncel populaties en de rol van milieurisico's, dwz de microbiota in intestinale inflammatie bestuderen. In dit artikel tonen we de methode voor het induceren van colitis met een stap-voor-stap protocol. Dit includes een video demonstratie van de belangrijkste technische aspecten die nodig zijn om succesvol te ontwikkelen dit muizenmodel van experimentele colitis voor onderzoeksdoeleinden.
Protocol
OPMERKING: Zorg ervoor dat alle dieren protocollen worden goedgekeurd door en in overeenstemming met de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) regelgeving en Gids van de National Research Council voor de zorg en het gebruik van proefdieren. Donormuizen kan mannelijk of vrouwelijk zijn, maar de ontvanger muizen moet mannelijk zijn. Als vrouwelijke ontvangers worden gebruikt, moet de donor muizen vrouwelijke 5 zijn. Onderhouden kolonies met behulp van reguliere, niet-steriele beddengoed en niet-aangezuurd water, omdat deze de darmflora beïnvloeden, en dus de colitis fenotype van de muizen 5,6.
1. Experimentele Voorbereiding
- Gebruik ijskoude media en buffers. Blijf cellen op ijs gedurende het experiment.
- Voeren het experiment in steriele biohazard kap met behulp van steriele techniek.
2. Isolatie van milt T-cellen
- Euthanaseren donor muis / muizen in CO 2 kamer gevolgd door cervicale dislocation. Spray buik met 70% ethanol.
- Maak een horizontale snede in de buik en afpellen huid buikvlies bloot. Houd peritoneum uit de interne organen van de tang en een insnijding in de linker buik buikvlies bloot te leggen en uitsnijden van de milt.
- Plaats de milt in 10 ml compleet medium in een petrischaal. Verwijderen en overtollige weefsel gooi uit de milt.
- Gebruik 2 gesteriliseerde glazen dia's te verpletteren en plagen elkaar milt in single-celsuspensie. Filter celsuspensie door een 70 urn zeef in een 50 ml conische buis en spoel zeef met 5 ml compleet medium. Plaats tot 5 milt in een 50 ml conische buis.
- Centrifugeer cellen bij 450 xg gedurende 7 min. Gooi supernatant door het gieten uit of door vacuüm zuigen in afvalcontainer.
- Voorzichtig hersuspenderen cellen in 5 ml per milt lysisbuffer rode bloedcellen lyseren gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Voeg een gelijk volume compleet medium (5 ml per milt) op de buis.
- Voorzichtig resuspendeer cellen in 10 ml Labeling Buffer.
- Tellen cellen door trypan blauw exclusie.
- Verwijder 20 ul van celsuspensie en toe te voegen aan 180 ul trypaanblauw een microfugebuis en meng. Na 5 min, voeg 10 ul gelabelde cellen hemocytometer tellen niet blauwe cellen onder de microscoop. Bepaal het totale aantal levensvatbare cellen. Gooi cel / trypaanblauw mix.
- Centrifugeer cellen in 10 ml Labeling Buffer bij 450 xg gedurende 7 min. Gooi supernatant door het gieten uit of door vacuüm zuigen in afvalcontainer.
3. Verrijking van CD4 + T-cellen
OPMERKING: Volg de instructies van de fabrikant voor specifieke producten die gebruikt worden in deze sectie.
- Voorzichtig resuspendeer cellen om een eencellige suspensie van 20 x 10 6 cellen / ml in koude Labeling Buffer.
- Voeg 5 ul per 1 x 10 6 cellen van gebiotinyleerde CD4 T-cel verrijking antilichamen. Incubeer cellen op ijs gedurende 15 min.
- Voeg 10x volume van Labeling Buffer. Centrifugeer cellen bij 450 x g gedurende 7 min. Zuig al het supernatant met behulp van vacuüm zuigen in afvalcontainer zorgvuldig.
- Grondig vortex streptavidine-geconjugeerde magnetische deeltjes. Voeg 5 ul van deeltjes per 1 x 10 6 cellen.
- Meng grondig, maar voorzichtig. Houd mengsel bij 6-12 ° C gedurende 30 min.
- Voeg Labeling Buffer tot een concentratie van 20-80 x 10 6 cellen / ml. Transfer tot 1,0 ml gelabelde cellen per 12 x 75 mm rondbodem reageerbuis (hierna de "positieve fractie tube").
- Plaats elke positieve-fractie buis op magneet voor 6-8 min.
- Met de positieve-fractie buizen nog steeds op de magneet, zorgvuldig supernatant overbrengen van positieve-fractie buis met glazen Pasteur pipet om een nieuwe steriele 50 ml conische buis (Referred "de verrijkte fractie"). Deze verrijkte fractie bevat CD4 + T-cellen. Wees voorzichtig dat u de gelabelde cellen aangetrokken door de magneet te verstoren.
- Resuspendeer cellen nog in de positieve fractie buizen dezelfde hoeveelheid Labeling buffer als in stap 3.6 op en neer te pipetteren krachtig. Plaats positieve-fractie buis terug op magneet voor 6-8 min.
- Met positieve-fractie buizen nog steeds op de magneet, zorgvuldig overdragen supernatant (verrijkte fractie, CD4 +) van de positieve-fractie buis met glazen Pasteur pipet 50 ml steriel conische buis vanaf stap 3.8 zonder verstoring van de cellen verbonden aan de magneet.
- Herhaal stap 3,9-3,10 de opbrengst van CD4 + T-cellen verkregen verhogen. Verder protocol met verrijkte fractie (CD4 + cellen).
4. Etikettering en sorteren Cellen 7
- Centrifugeer verrijkte cellen bij 450 xg gedurende 7 min. Gooi supernatant door het gieten uit of vacuum Zuignap Houderion in de afvalcontainer.
- Resuspendeer cellen in 1 ml Labeling Buffer. Verwijder monster van cellen te tellen en te beoordelen voor levensvatbaarheid van de cellen door trypanblauwexclusie zoals in stap 2.9.
- Voeg een volume van Labeling Buffer tot 10 x 10 6 cellen / ml; Als cellen zijn reeds <10 x 10 6, centrifuge bij 450 xg gedurende 7 minuten, verwijder het supernatant door het gieten uit of vacuüm zuigen in afvalcontainer, en voeg volume van Labeling Buffer tot 10 x 10 6 cellen / ml.
- Het opzetten van aparte porties van ongeveer 5-10 x 10 5 cellen elk voor ongekleurd, isotype- gekleurd, en single-gekleurde controle cellen in microfugebuisjes.
- Voeg 5 ug / ml CD4-FITC en 1 ug / ml CD45RB-PE aan cellen. Voeg isotype controle vlekken en enkele vlekken op dezelfde concentratie monsters in microfugebuizen passende. Meng goed maar voorzichtig en incubeer op ijs beschermd tegen licht gedurende 30 min.
- Voeg 10x volume van Labeling Buffer aan cellen en controles. Centrifugeer 450 xg gedurende 7 min. Gooi supernatant door afzuiging in afvalcontainer.
- Resuspendeer in Labeling Buffer om het volume in stap 4.5. Centrifugeer 450 xg gedurende 7 min. Gooi supernatant door afzuiging in afvalcontainer.
- Resuspendeer in Labeling Buffer tot 10 x 10 6 cellen / ml. Passeren cellen door 70 micrometer zeef in FACS buis. Houd op ijs beschermd tegen licht tot klaar voor FACS.
- Opzetten en bepalen passende vergoeding aan de celsorteerder met ongekleurde cellen en single-gekleurd controles.
- Uitsluiten levensvatbare cellen met forward en side-scatter venstertijd (Figuur 1A). Opgezet venstertijd voor CD4 + en CD45RB + cellen met isotype- gekleurd controles. Gate cellen op CD4 + populatie.
- Sorteer CD4 + cellen in CD45RB hoog en CD45RB lage populaties met een eenvoudige histogram voor PE gekleurde cellen in buisjes met 2 ml compleet medium. De CD45RB hoog + CD45RB + cellen (CD45RB hoog), en de CD45RB lage bevolking is de laagste 20% van CD4 + CD45RB + cellen (CD45RB laag Figuur 1B).
Figuur 1: Representatieve flowcytometrie stukken CD4 + CD45RB T cel populaties in FACS-analyse (A - C) CD4 FITC en PE CD45RB-gekleurde splenocyten van donor C57BL / 6 muizen werden gesorteerd door FACS in CD4 + CD45RB hoog en CD4 +. CD45RB lage T-cel populaties. (A) Doublet evenementen werden uitgesloten op de forward scatter plot. (B) lymfocyten werden gated in de voorwaartse en zijwaartse verstrooiing plot. (C) CD4 + (D) CD4 + CD45RB + T-cellen werden op een PE versus Events histogram uitgezet. CD4 + CD45RB laag cellen werden beschouwd als de laagste 20% van CD45RB + cellen. CD4 + CD45RB high cellen werden gedefinieerd als de hoogste 40% van CD45RB + cellen.
- Voer een aliquot van elke celpopulatie op de FACS machine zuiverheid van de bevolking te schatten.
- Centrifugeer gesorteerde cellen bij 450 xg gedurende 7 min. Resuspendeer in 1 ml PBS. Verwijder monster van cellen te tellen en te beoordelen voor levensvatbaarheid van de cellen door trypanblauwexclusie zoals in stap 2.9.
5. Injectie van cellen in Ontvangers
- Resuspendeer gesorteerde cellen tot 4 x 10 6 cellen / ml (CD45RB- hoog) of 2 x 10 6 cellen / ml (CD45RB laag) in PBS.
- Transfer 100 ul van CD45RB hoge cellen per ontvanger om nieuwe steriele buis. Voeg 100 ul van PBS perontvanger om deze buis. Zo totale injectie volume per dier is 200 pi, en de totale hoeveelheid cellen per ontvanger is 4 x 10 5 CD4 + CD45RB- hoge naïeve T-cellen.
- Als de experimentele groep die regulatoire T cellen gewenst is, 100 ul van CD45RB hoge cellen per ontvanger om nieuwe steriele buis. Voeg 100 ul van CD45RB laag cellen per ontvanger aan dezelfde buis. Totale injectie volume per dier is 200 pl; verhouding van CD45RB hoog: CD45RB- laag cellen is 2: 1.
- Injecteer 100 ui CD45RB hoog of CD45RB hoog / CD45RB lage CD4 + cellen intraperitoneaal in de rechter en linker zijde van de buik (totaal 200 pl) van elke ontvanger.
6. Toezicht op de progressie van de ziekte in Ontvanger Dieren
- De klinische toestand van de ontvangende dieren beoordelen toewijzen totale klinische scores voor de volgende parameters 8 op de dag van de injectie, daarna wekelijks, en op het moment van het offer:
- Bepaal verspillen door het meten van het gewichtsverlies: 0 - geen gewichtsverlies; 1 - 0,1-10% verlies van het oorspronkelijke lichaamsgewicht; 2 - meer dan 10% verlies van de oorspronkelijke lichaamsgewicht (figuur 2A).
Figuur 2: Klinische en bruto pathologische tekenen van ontsteking optreden na overdracht van de wild-type CD4 + CD45RB- hoge T-cellen in RAG1 - / - en NRDKO ontvanger muizen 11 (A) NRDKO ontvangers verloren gemiddeld 10% van hun oorspronkelijke lichaamsgewicht door 5. weken na de overdracht, terwijl RAG1- / - Ontvangers geen klinische ziektesymptomen vertonen op dit moment. Elk punt vertegenwoordigt het gemiddelde percentage oorspronkelijke lichaamsgewicht van de cohort ± SEM. **, P <0.005. (B) Een aantal muizen ontwikkelden ernstige intestinale inflammatie, zoals blijkt uit de aanwezigheid van rectale prolaps. Dit is een representatief beeld van rectale prolaps in een NRDKO ontvangende muis. (C) In grote trekken, dubbele punten uit beide RAG1 - / - en NRDKO ontvanger muizen worden ingedikt en verkort in vergelijking met dubbele punten van RAG1 - / - en NRDKO muizen zonder T-cel adoptieve overdracht. Dubbele punten uit NRDKO ontvangende muizen ernstige ontsteking en verhoogde colon gewichten (gegevens niet getoond). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
- Bepaal de kwaliteit van de ontlasting door het plaatsen van dieren in een schone container, totdat het voorbij iskrukje: 0 - geen; 1 - zachte ontlasting; 2 - waterig en / of bloederige ontlasting.
- Bepaal de algemene gezondheid van de dieren door de aanwezigheid van de volgende symptomen van de ziekte: 0 - geen gebogen houding, haren bont, of huidletsels; 1 - een van de volgende aanwezig: gebogen houding, haren bont, of huidletsels.
- Bepaal aanwezigheid van rectale prolaps: 0 - afwezig; 1 - heden (Figuur 2B).
- Offeren dieren door CO 2 inademing, gevolgd door cervicale dislocatie als ze 20% van hun startpositie lichaamsgewicht hebben verloren of op gewenst tijdstip, wat het eerst komt. Klinische ziekte is meestal zichtbaar vanaf week 5 post-repletie.
- Beoordelen voor ernst van de ziekte, zoals eerder beschreven 5,7.
- Wijs klinische scores als in stap 6.1 8.
- Meet colon lengte en gewicht (Figuur 2C).
- Voer histologische analyse van ontsteking5.
- Bepaal spontane cytokine expressie in darmweefsel explantkweken 9, mesenteriale lymfeklieren 10 en / of 11 serum.
- Kortom, voor explantkweken 9, verwijder dubbele punten na offer, geopend in de lengte, en schoon met PBS. Incubeer zuilen op een orbitale schudder bij 250 rpm in compleet medium gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Hak weefsel in kleine stukjes en geïncubeerd bij 37 ° C in compleet medium gedurende 24 uur. Verzamel de bovenstaande vloeistof en gebruik voor kwantificering van cytokines per 100 mg weefsel door ELISA.
- Voer ex vivo karakterisering van T cel fenotypes en / of functie 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ongeveer 10 x 10 6 CD4 + CD45RB- hoge T-cellen van 10 milt van volwassen C57BL / 6 donormuizen zijn betrouwbaar geïsoleerd. Dit aantal zal variëren afhankelijk van de leeftijd en het type van de donor muis en de vaardigheid van de onderzoeker. Wanneer 4 x 10 5 C57BL / 6 CD4 + CD45RB- hoge T-cellen worden overgebracht naar C57BL / 6 RAG1 - / - ontvanger muizen, klinische ziekteverschijnselen ontstaan rond week 5 post-repletie of eerder als muizen zijn genetisch vatbaar voor meer ernstige ziekte ( Figuur 2, 3) 11,12. CD3 + T-cellen worden gezien ophopen in dikke darmen van RAG1 - / - ontvangers reeds op 3 weken (figuur 3A) 12.
Figuur 3: Overdracht van wild-type CD4 + CD45RB hoge T-cellen in RAG1 - / - en RKO / δ KD ontvangers induceert chronische darmontsteking 12 (A) (Original vergroting 10X, H & E en CD3 immunohistochemie).. H & E kleuring (bovenste panelen) illustreert epitheliale hyperplasie, inflammatoire celinfiltraten en crypte abcessen (pijl) aanwezig in RKO / δ KD ontvangers, maar niet RAG1 - / - ontvangers. Colons van RKO / δ KD ontvangende muizen toonde duidelijke accumulatie van CD3 + T-cellen door CD3 IHC (onderste panelen) vergeleken met zuilen van RAG1 - / - ontvangers. (B) Colons van RKO / δ KD ontvanger muizen aangetoond meer ernstige ontsteking in vergelijking met dubbele punten frOM RAG1 - / - ontvanger muizen zoals bepaald door histologie scoren. (C, D) Colonic explantkweken van RKO / δ KD ontvanger muizen uitgescheiden minder IL-10 (C) en meer IL-12p40 (D) dan deed colon explantkweken van RAG1 - / -. Ontvangermuizen Klik hier om een foto grotere versie van deze figuur.
We hebben eerder gepubliceerd dat adoptieve T cel overdracht in Nfil3 - / - / RAG1 - / - dubbele knockout ontvangers (NRDKO) ontwikkelen van meer ernstige colitis vergelijking met RAG1 - / - ontvanger muizen (figuur 2) 11. NFIL3 negatief reguleert IL-12p40 in muriene dikke macrofagen onafhankelijk van de IL-10-inducerende effecten 13. Ontregeling van IL-12p40 en IL-10 is betrokken bij de baanogenesis van menselijke IBD 1. Aldus ongecontroleerde IL-12p40 productie adoptieve overdracht NDRKO ontvangende muizen resulteert in snellere progressie van de ziekte, zoals getoond door gewichtsverlies (Figuur 2A). Sommige NRDKO ontvanger muizen ontwikkelden ernstige ziekte resulteert in rectale prolaps (Figuur 2B). Grovelijk, dubbele punten uit NRDKO ontvanger muizen worden ingedikt en ingekort, wat neerkomt op een grote toestroom van ontstekingscellen in de dikke darm, vergeleken met RAG1 - / - ontvanger muizen (figuur 2C).
Relatief, in RAG1 - / - muizen met een functioneel PI3K katalytische subeenheid p110δ in niet-lymfocyt populaties (RKO / δ KD), CD4 + CD45RB high T cel verzadiging induceert even snel en ernstige klinische verloop van de ziekte vergeleken met NRDKO muizen (Fig 3) 12. Histologische analyse na 3 weken demonstreert colonweefsel hypertrofie, inflammatory celinfiltraten en crypte abcessen (pijl) in RKO / δ KD ontvangers in vergelijking met RAG1 - / - ontvangers (Figuur 3A). Ontvanger muizen in dit experiment werden gedood na 3 weken als gevolg van een groot aantal die verloren 20% van hun aanvankelijke gewicht. Histologische scores, zoals bepaald door een patholoog geblindeerd voor de experimentele groepen aan specifieke criteria ontwikkeld in ons laboratorium 12, was hoger in RKO / δ KD ontvangende muizen vergeleken RAG1 - / - ontvangende muizen (Figuur 3B). Daarnaast spontane cytokine productie uit colon explantkweken aangetoond verlaagde IL-10 en IL-12p40 verbeterde productie van RKO / δ KD ontvangende muizen vergeleken RAG1 - / - ontvangende muizen (Figuur 3C, D) 12. Wederom verhoogde IL-12p40 en verminderde IL-10-productie wordt geïmpliceerd bij de pathogenese van menselijke IBD 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we een stap-voor-stap protocol inducerende darm ontsteking bij muizen door adoptieve overdracht van CD4 + CD45RB + T-cellen in immuun deficiënte muizen. We gebruikten C57BL / 6 donor milt en syngene RAG1 - / - ontvangende muizen, hoewel andere stammen (zoals BALB / c, 129S6 / SvEv, non-obese diabetische (NOD)) en genetische modellen van immunodeficiëntie (bijvoorbeeld SCID, RAG2 - / -) kan ook worden gebruikt 4,14-16. Het staat vast dat de achtergrond stam treft experimentele colitis ernst bij muizen 1. Bovendien is de enterische microbiota in een muizen bevolking varieert sterk tussen de faciliteiten, zelfs tussen die binnen dezelfde instelling 6,17. Terwijl de figuren 2 en 3 niet voor de ontwikkeling van colitis tonen in RAG1 - / - muizen 4 weken na de overdracht, in ons en de ervaringen van anderen RAG1 - / - ontvangers ontwikkelen clinische ziekte tussen de 6 en 9 weken na de overdracht van de CD4 + CD45RB hoge T-cellen 18-23. Deze variabiliteit in klinisch beloop en de ziekte van meningsuiting en moet rekening worden gehouden bij de vaststelling van dit model van experimentele colitis aan intra- en inter-experimentele inconsistentie te minimaliseren.
Een cruciale stap voor de reproduceerbaarheid van dit experiment is FACS isolatie van zuivere populaties van CD4 + CD45RB hoge cellen zonder blijvende geactiveerd / geheugen / regulatoire T-cellen. Dit houdt een bekwaam begrip flowcytometrie. Het is belangrijk om eerst negatief geselecteerde niet-levensvatbare en CD4 cellen. Vervolgens selecteert met een eenvoudige histogram voor CD45RB-PE cellen de hoogste 40% van cellen CD45RB hoge T-cellen en de laagste 20% als CD45RB laag T cellen zijn. Andere markers overwegen om voor isolatie van naïeve CD4 + T-cellen worden CD62L en CD25, hoewel onze ervaring CD45RB high lage scheiding is voldoende en reproduceerbare 5. Daarnaast is het mogelijk om de verhouding van CD45RB hoog variëren naar laag T-cellen overgebracht in ontvangers het effect van regulerende T-celpopulaties op ziekte fenotype bestuderen CD45RB. Werken met iemand die vertrouwd is met flowcytometrie in eerste instantie voor het opzetten van de FACS-protocol en vervolgens met behulp van dit protocol in toekomstige experimenten. Bovendien, een stap waar significante variatie resultaten van invloed kunnen zijn in dit protocol is de intraperitoneale injectie van T-cellen in de ontvangende muizen. Hier kunnen de intra- en inter-onderzoeker variabiliteit sterk van invloed op de uitkomst van het experiment. Voorgesteld wordt dat de persoon die deze stap comfortabel hanteren muizen en de injectietechniek om variabiliteit te minimaliseren in kwaliteit en kwantiteit cellen adoptief overgedragen. Bovendien is het belangrijk om naalden tussen muizen wijzigen, zoals naald dof de werkzaamheid van invloed kande intraperitoneale injectie.
Stappen van het protocol dat optimalisatie vereisen onder artikel 3: Verrijking van CD4 + T-cellen en Deel 4: sorteren en labels Cellen. Optimalisatie van de CD4 + T-cel verrijking afhankelijk van het magnetische systeem gebruikt en moeten de instructies van de fabrikant te volgen. Opties voor magnetische celscheiding systemen zijn opgenomen in de tabel van specifieke reagentia / Equipment. Het is raadzaam om te verrijken voor CD4 + T-cellen door negatieve selectie, rechtstreeks labelen deze populatie kan het fenotype van de cellen beïnvloeden. Er zijn veel antilichaam klonen beschikbaar voor het labelen van cellen voor FACS. De concentratie antilichaam (stap 4.4) moet worden geoptimaliseerd om specifieke kleuring te waarborgen en een adequate scheiding van CD4 + CD45RB T cel populaties te verkrijgen tijdens FACS.
Ontwikkeling van dit protocol kan het oplossen van problemen vereisen. Ten eerste, het succes van elk experimentafhankelijk van de vaardigheid van de onderzoeker en zal toenemen met verbeterde vaardigheid in deze werkwijzen. Echter, een eenvormige verkrijgen lage aantallen T-cellen voor adoptieve overdracht veroorzaakt door niet bij cellen op ijs gedurende isolatie, resuspenderen gecentrifugeerde cellen te agressief of het gebruik van splenocyten van jonge muizen met kleine milten. Bovendien optimaliseren de concentratie van anti-CD4 en anti-CD45RB antilichamen labeling voor het kleuren van stoornissen of aspecifieke cel kleuring te vermijden (zie hierboven). Als ontvangers ontwikkelen uiteenlopende graden van darmontsteking, de meest waarschijnlijke oorzaak is onnauwkeurig intraperitoneale injectie techniek. Dit zou verbeteren praktijk kan worden gecontroleerd door immunohistologische kleuring van CD3 + cellen in de darm van ontvangende muizen. Extra dingen te beschouwen, omvatten het geslacht van donor en ontvanger muizen en normale variaties in de ziekte van penetratie. Wanneer mannelijke ontvanger muizen worden gebruikt, mannelijk of vrouwelijk donormuizen zijn eenppropriate. Als vrouwelijke ontvangende muizen te gebruiken, de donor muizen moet vrouwelijke 5 zijn. In onze en andermans ervaringen, penetratie van de ziekte in dit model is 85-90% 5. Aldus wordt verwacht dat bepaalde muizen niet kunnen ontwikkelen darmontsteking, gegeven andere oorzaken van aanzienlijke variabiliteit in ernst van de ziekte werd uitgesloten. Houd in gedachten is er duidelijke variabiliteit in fenotypes tussen faciliteiten binnen een organisatie en daarbuiten met betrekking tot muizen gastro-intestinale microbiota en praktijken die de microbiota 6,17 beïnvloeden. Zo is de robuustheid van fenotype of kinetiek van de ziekte in RAG1 - / - ontvanger muizen kunnen variëren sterk gebaseerd op de eigen locatie. Daarom is het belangrijk om de beste parameters voor deze experimenten gebaseerd op de tijdlijn en de resultaten voor elke individuele installatie bepalen.
Hier beschrijven we de methodologie van de goed gekarakteriseerde adaptieve overdracht van muizenmodel van chronische dunne darm en dikke darm ontsteking die de menselijke IBD 5 lijkt. Deze stap voor stap protocol geeft de belangrijkste technieken voor de succesvolle ontwikkeling van deze methode voor onderzoeksdoeleinden. Dit is een bijzonder nuttig diermodel van menselijke IBD, omdat het zorgt voor synchronisatie van ziekten en manipulatie van verschillende celpopulaties. Echter, de immunodeficiënte ontvangende muizen genetisch gemodificeerd ontwikkelen zonder rijpe adaptieve immuunsysteem cellen, die waarschijnlijk invloed stroomafwaarts ziekte resultaten. Desondanks zal de hier beschreven werkwijze zeer nuttig toekomstige studies naar het effect van de enterische microbiota, aangeboren immuuncellen en adaptieve immuun regulerende cellen in de pathogenese van menselijke IBD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Amerikaanse Gastroenterological Association (AGA) Onderzoek Scholars Award en de Crohn en Colitis Foundation of America (CCFA) Career Development Award (tot SZS), NIH NIDDK F30 DK089692 (ECS), en de Universiteit van North Carolina Centrum voor Gastro-intestinale Biologie en de ziekte van Grant P30 DK34987 (histologie Core). De UNC flowcytometrie Core Facility wordt gedeeltelijk ondersteund door een NCI Center Core ondersteuning Grant (P30CA016086) aan de UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center. Wij danken Luke B. Borst uit North Carolina State University College of Veterinary Medicine voor zijn hulp met histopathologische analyse en immunohistochemie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 10x PBS | Gibco | 14200075 | |
| 12 mm x 75 mm round-bottom tube | Falcon | 352052 | |
| 15 ml conical | Corning | 430790 | |
| 26 G x 3/8 Needle | BD Biosciences | 305110 | |
| 50 ml conical | Corning | 430828 | |
| 70 μm Cell Strainer | Fisherbrand | 22363548 | |
| BD IMagnet | BD Biosciences | 552311 | |
| β-mercaptoethanol | Thermo Scientific | 35602 | |
| CD4-FITC IgG2b | eBioscience | 11-0041 | |
| CD45RB-PE IgG2a | BD Pharminogen | 553101 | |
| Complete Media | RPMI-1640, 1% Pen/Strep, 10% FBS, 0.0004% β-ME | ||
| FACS tube + strainer | BD Falcon | 352235 | |
| Glass Microscope Slides | Fisherbrand | 12550A3 | |
| Heat-inactivated FBS | Gemini | 100-106 | |
| Labeling Buffer | 1x PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA | ||
| Lysis Buffer | 0.08% NH4Cl, 0.1% KHCO3, 1 mM EDTA | ||
| MoFlo XDP | Beckman Coulter | ||
| Mouse CD4 T lymphocyte Enrichment Set - DM | BD Biosciences | 558131 | |
| Mouse IgG2a-PE | BD Pharminogen | 553457 | |
| Mouse IgG2b-FITC | eBioscience | 11-4732 | |
| Pasteur pipet | Fisherbrand | 13-678-20D | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100X | Corning Cellgro | 30-002-CI |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri Dish | Fisherbrand | 875713 | |
| Pure Ethanol 200 Proof | Decon Labs | 2705-HC | |
| RPMI-1640 | Gibco | 11-875-093 | |
| Syringe | BD Biosciences | 309597 | |
| Trypan blue | Corning Cellgro | 25-900-CI | |
| Wash Media | RPMI-1640, 1% Pen/Strep, 0.0004% β-ME |
References
- Xavier, R. J., Podolsky, D. K. Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 448 (7152), 427-434 (2007).
- Cho, J. H., Brant, S. R. Recent insights into the genetics of inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 140 (6), 1704-1712 (2011).
- Jostins, L., et al. Host-microbe interactions have shaped the genetic architecture of inflammatory bowel disease. Nature. 491 (7422), 119-124 (2012).
- Powrie, F., Leach, M. W., Mauze, S., Caddle, L. B., Coffman, R. L. Phenotypically distinct subsets of CD4+ T cells induce or protect from chronic intestinal inflammation in C. B-17 scid mice. Int Immunol. 5 (11), 1461-1471 (1993).
- Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: concepts, considerations, and tricks of the trade. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296 (2), 135-146 (2009).
- Ma, B. W., et al. Routine habitat change: a source of unrecognized transient alteration of intestinal microbiota in laboratory mice. PLoS One. 7 (10), e47416 (2012).
- Read, S., Powrie, F. Induction of inflammatory bowel disease in immunodeficient mice by depletion of regulatory T cells. Curr Protoc Immunol. Chapter 15 (Unit 15 13), (1999).
- Maillard, M. H., et al. The Wiskott-Aldrich syndrome protein is required for the function of CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) regulatory T cells. J Exp Med. 204 (2), 381-391 (2007).
- Hegazi, R. A., et al. Carbon monoxide ameliorates chronic murine colitis through a heme oxygenase 1-dependent pathway. J Exp Med. 202 (12), 1703-1713 (2005).
- Kole, A., et al. Type I IFNs regulate effector and regulatory T cell accumulation and anti-inflammatory cytokine production during T cell-mediated colitis. J Immunol. 191 (5), 2771-2779 (2013).
- Kobayashi, T., et al. NFIL3-deficient mice develop microbiota-dependent, IL-12/23-driven spontaneous colitis. J Immunol. 192 (4), 1918-1927 (2014).
- Steinbach, E. C., et al. Innate PI3K p110delta Regulates Th1/Th17 Development and Microbiota-Dependent Colitis. J Immunol. 192 (8), 3958-3968 (2014).
- Kobayashi, T., et al. NFIL3 is a regulator of IL-12 p40 in macrophages and mucosal immunity. J Immunol. 186 (8), 4649-4655 (2011).
- Leach, M. W., Bean, A. G., Mauze, S., Coffman, R. L., Powrie, F. Inflammatory bowel disease in C.B-17 scid mice reconstituted with the CD45RBhigh subset of CD4+ T cells. Am J Pathol. 148 (5), 1503-1515 (1996).
- Powrie, F., et al. Inhibition of Th1 responses prevents inflammatory bowel disease in scid mice reconstituted with CD45RBhi CD4. T cells. Immunity. 1 (7), 553-562 (1994).
- Read, S., Malmstrom, V., Powrie, F. Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 plays an essential role in the function of CD25(+)CD4(+) regulatory cells that control intestinal inflammation. J Exp Med. 192 (2), 295-302 (2000).
- Rogers, G. B., et al. Functional divergence in gastrointestinal microbiota in physically-separated genetically identical mice. Sci Rep. 4, 5437 (2014).
- Fukata, M., et al. The myeloid differentiation factor 88 (MyD88) is required for CD4+ T cell effector function in a murine model of inflammatory bowel disease. J Immunol. 180 (3), 1886-1894 (2008).
- Kurtz, C. C., et al. Extracellular adenosine regulates colitis through effects on lymphoid and nonlymphoid cells. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 307 (3), 338-346 (2014).
- Naganuma, M., et al. Cutting edge: Critical role for A2A adenosine receptors in the T cell-mediated regulation of colitis. J Immunol. 177 (5), 2765-2769 (2006).
- Ranatunga, D. C., et al. A protective role for human IL-10-expressing CD4+ T cells in colitis. J Immunol. 189 (3), 1243-1252 (2012).
- Srikrishna, G., et al. Carboxylated glycans mediate colitis through activation of NF-kappa. B. J Immunol. 175 (8), 5412-5422 (2005).
- Wang, F., et al. IFN-gamma-induced TNFR2 expression is required for TNF-dependent intestinal epithelial barrier dysfunction. Gastroenterology. 131 (4), 1153-1163 (2006).
