Abstract
İnsan inflamatuar barsak hastalıklarının (IBD), kendi avantajları ve dezavantajları her patogenezi çalışmak için birçok farklı hayvan modelleri vardır. Burada T ve B hücresi eksik alıcı farelere singeneik dalak CD4 + CD45RB yüksek T hücrelerinin adoptif nakli ile başlatılır deneysel kolit modelini açıklar. Büyük ölçüde naif efektör hücrelerin oluşur CD4 + T hücre CD45RB yüksek popülasyonu yakından insan IBD'nin kilit yönlerini benzeyen, kronik bağırsak inflamasyonu uyarma yeteneğine sahiptir. Bu yöntem, hastalığın başlangıcında ve ilerlemesinde yönlerini incelemek için manipüle edilebilir. Ayrıca bağırsak iltihabı yani doğuştan gelen, adaptif fonksiyonlarını ve düzenleyici immün hücre popülasyonları ve çevresel maruziyet rolü, Mikrobiyota, incelemek için kullanılabilir. Bu yazıda, bir adım-adım protokolü ile Kolit için bir metodoloji göstermektedir. Bu incidarecisi başarıyla araştırma amaçlı deneysel kolit bu fare modeli geliştirilmesi için gerekli anahtar teknik yönlerini bir video gösterisi.
Protocol
NOT: Tüm hayvan protokolleri ile ve Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) yönetmelik ve Ulusal Araştırma Konseyi'nin Kılavuz uygun onaylanmış emin olun. Verici fareler erkek veya kadın olabilir, ancak alıcı fareler erkek olmalıdır. Dişi alıcı kullanılacak ise, verici fareler 5 kadın olmalıdır. Böylece, farelerin 5,6 kolit fenotip, bu intestinal mikrobiyota etki edilebilir, düzenli olmayan steril yatak ve asitli-olmayan su kullanılarak koloni bakımı ve.
1. Deneysel hazırlanması
- Buz soğukluğunda ortamı ve tamponlar kullanın. Deney boyunca buz üzerinde hücreleri tutun.
- Steril tekniği kullanarak steril biyolojik tehlike kaput deney yapın.
Dalak T hücrelerinin 2. izolasyonu
- Donör fare / CO fareler servikal dislocatio 2 odacık ardından euthanizen. % 70 etanol ile karın püskürtün.
- Karın yatay bir kesi yapmak ve periton maruz cilt soymaya. Uzak forseps ile iç organlardan periton tutun ve ortaya çıkarmak ve dalağı tüketim sol karın periton bir kesi yapmak.
- Petri kabındaki tam ortam, 10 ml dalak yerleştirin. Çıkarın ve dalak aşırı doku atın.
- Ezmek ve tek hücre süspansiyonu içine dalak ayrı kızdırmak için 2 steril cam slaytlar kullanın. Filtre hücresi 50 ml konik tüp içine 70 mikron süzgeç vasıtasıyla süspansiyon ve tam Medya 5 ml süzgeç durulayın. Bir 50 ml konik tüp içinde 5 dalak kadar yerleştirin.
- 7 dakika için 450 xg'de Santrifüj hücreleri. Kapalı dökerek ya da atık kabına vakum emme ile süpernatant atın.
- Yavaşça, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca, kırmızı kan hücrelerinin lize etmek için Lizis Tamponu dalak başına 5 ml süspansiyon hücrelerin. Tüpe tam ortam içinde eşit hacimde (dalak başına 5 mi) eklenir.
- Yavaşça Etiketleme Tampon, 10 ml hücreler tekrar süspansiyon.
- Tripan mavi dışlama hücreleri saymak.
- Hücre süspansiyonu 20 ul çıkarın ve bir mikrofüj tüpüne 180 ul, tripan mavisi ekleyin ve iyice karıştırın. 5 dakika sonra, hemositometrede ve mikroskop altında olmayan mavi hücreleri saymak için hücreleri etiketli 10 ul ekleyin. Canlı hücrelerin toplam sayısını belirleyin. Hücre / tripan mavi karışımı atın.
- 7 dakika boyunca 450 xg'de Etiketleme Tampon, 10 ml santrifüj hücreleri. Kapalı dökerek ya da atık kabına vakum emme ile süpernatant atın.
CD4 + T hücreleri 3. zenginleştirilmesi
NOT: Bu bölümde kullanılan belirli ürünler için üreticinin talimatlarına uyun.
- Yavaşça soğuk etiket 20 x 10 6 hücre / ml 'lik bir tek hücre süspansiyonuna hücreleri tekrar süspansiyoning Tampon.
- Biyotinlenmiş CD4 T hücresi zenginleştirme antikor 1 x 10 6 hücre başına 5 ul ekleyin. 15 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya bırakılır.
- Etiketleme Tampon 10x hacim ekleyin. 7 dakika 450 × g Santrifüj hücreleri. Dikkatle atık kabına vakum emme kullanarak tüm süpernatant aspire.
- İyice streptavidin-konjuge manyetik parçacıklar girdap. 1 x 10 6 hücre başına parçacıkların 5 ul ekle.
- İyice fakat nazikçe karıştırın. 30 dakika boyunca, 6-12 ° C'de bir karışım tutun.
- 20-80 x 10 6 hücre / ml 'lik bir konsantrasyona kadar Etiketleme Tamponu ekleyin. 12 x 75 mm yuvarlak alt test tüpüne başına hücreleri etiketli 1.0 ml kadar aktarın ("pozitif kesir tüp" olarak anılacaktır).
- 6-8 dakika mıknatıs her olumlu-fraksiyon tüpü yerleştirin.
- Mıknatıs hala pozitif kesir tüpleri ile dikkatlice (yeni steril 50 ml konik tüp cam Pasteur pipet ile pozitif fraksiyon tüpten referre süpernatant aktarmak"zenginleştirilmiş fraksiyon") olarak d. Bu zenginleştirilmiş fraksiyon, CD4 + T hücrelerini içerir. Mıknatıs çekti etiketli hücreleri bozmak için değil dikkatli olun.
- Süspanse edin hücreleri aşağı yukarı şiddetle pipetleme ve adım 3.6 gibi Etiketleme Tampon aynı hacimde pozitif kesir tüplerde bıraktı. 6-8 dakika geri mıknatıs üzerinde pozitif kesir tüpü yerleştirin.
- Mıknatıs hala pozitif kesir tüpleri ile dikkatlice mıknatıs bağlı hücrelerin aksatmadan 50 ml Aşama 3,8 konik tüp, steril cam Pasteur pipet ile pozitif fraksiyon tüp süpernatant (zenginleştirilmiş fraksiyonu, CD4 +) aktarın.
- Tekrar Elde edilen CD4 + T hücrelerinin verimini artırmak için 3,9-3,10 adımları tekrarlayın. Zenginleştirilmiş fraksiyon (CD4 + hücreleri) kullanılarak protokolü devam edin.
4. Etiketleme ve sıralama Hücreler 7
- Santrifüj 7 dakika için 450 xg'de hücreleri zenginleştirilmiş. Veya vakum emilmesini kapalı dökerek süpernatant atınatık kabına iyon.
- Etiketleme, 1 ml tampon içinde süspanse hücreleri. Saymak ve aşama 2.9 olarak tripan mavisi eksklüzyonu ile hücre canlılığı değerlendirmek için hücreler kısım çıkarın.
- 10 x 10 6 hücre / ml Etiketleme getirme tamponunun bir hacminin ilave et; hücrelerin önceden ise <10 x 10 6, 7 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj, atık kabı içine dökülen ya da vakum emiş ile süpernatan atılır ve 10 x 10 6 hücre / ml Etiketleme Tamponu hacmi ekleyin.
- Mikrofüj tüplerinde izotip lekeli, boyanmadan ve tek boyanmış kontrol hücreleri için yaklaşık 5-10 x 10 5 hücre, her biri ayrı ayrı alikotları ayarlayın.
- Hücrelere 5 ug / ml CD4-FITC ve 1 ug / ml CD45RB-PE ekleyin. Mikrofüj tüplerinde alikotları mülk aynı konsantrasyonda izotip kontrol lekeleri ve tek lekeler ekleyin. Iyi bir şekilde fakat nazikçe karıştırın ve 30 dakika için ışıktan korunması buz üzerinde inkübe edilir.
- Hücre ve kontrolü Etiketleme Tampon 10x hacmi ekles. 7 dakika Santrifüj 450 xg. Atık kabına vakum emme ile süpernatant atın.
- Adım 4.5 hacme Etiketleme Tampon süspanse. 7 dakika Santrifüj 450 xg. Atık kabına vakum emme ile süpernatant atın.
- 10 x 10 6 hücre / ml Etiketleme Tamponu içinde yeniden süspanse edin. FACS tüpüne 70 mikron süzgeç vasıtasıyla hücrelere geçerler. FACS için hazır olana kadar ışıktan korunan buz üzerinde tutun.
- Set up ve boyanmamış hücreler ve tek lekeli kontrolleri ile hücre sıralayıcı uygun tazminat belirler.
- Ileriye ve yan dağılım yolluk (Şekil 1A) ile cansız hücreleri hariç. Izotip-lekeli kontrolleri ile CD4 + ve CD45RB + hücreleri için yolluk ayarlayın. CD4 + nüfus Kapı hücreleri.
- Tam ortam, 2 ml tüplere PE-boyanmış hücreler için basit bir histogram kullanarak yüksek CD45RB ve CD45RB alt popülasyon kriteri CD4 + hücreleri. Yüksek CD45RB + CD45RB + hücreleri (yüksek CD45RB) en yüksek% 40 temsil eder ve CD45RB alt popülasyonu, CD4 + CD45RB + hücrelerinin en% 20 (alt CD45RB, Şekil 1B).
Şekil 1: FACS analizi sırasında, CD4 + CD45RB, T hücre popülasyonlarının sitometrisi lekeleri Örnek akımı (A - C), FITC CD4 ve PE içine FACS ile sınıflandırılmıştır verici, C57BL / 6 farelerinden alınan splenositler CD45RB lekeli CD4 + CD45RB yüksek ve CD4 +. CD45RB alt T hücresi popülasyonu. (A) Doublet olayları ileri dağılım arsa üzerinde dışı bırakıldı. (B) lenfositler ileri ve yan dağılım arsa kapılı edildi. (C), CD4 + (D) CD4 + CD45RB + T hücreleri, PE karşı etkinlikler histogram çizilmiştir. CD4 + CD45RB alt hücreler, CD45RB + hücrelerinin en% 20 olarak kabul edildi. CD4 + CD45RB, yüksek hücre CD45RB + hücrelerinin en yüksek% 40 olarak tayin edilmiştir.
- Popülasyonlarının saflığı analiz etmek üzere FACS makinede her bir hücre popülasyonunun bir kısım çalıştırın.
- Santrifüj 7 dakika için 450 xg'de hücreleri sıralanır. 1 ml PBS içinde yeniden süspanse. Saymak ve aşama 2.9 olarak tripan mavisi eksklüzyonu ile hücre canlılığı değerlendirmek için hücreler kısım çıkarın.
Alıcılar içine Hücreleri 5. Enjeksiyon
- Süspanse 4 x 10 6 hücre / ml (CD45RB yüksek) veya PBS 2 x 10 6 hücre / ml (düşük CD45RB) hücreleri sıralanır.
- Yeni steril tüpe alıcı başına CD45RB yüksek hücrelerin 100 ul aktarın. PBS Başı 100 ul ekleyinbu tüp alıcısı. Bu nedenle, hayvan başına toplam enjeksiyon hacmi 200 ul ve alıcı için hücrelerin toplam miktarı, 4 x 10 5, CD4 + CD45RB yüksek naiv T hücreleri.
- Regülatör T hücreleri alan deney grubu arzu edildiği takdirde, yeni bir steril tüpe alıcı için CD45RB, yüksek hücre 100 ul aktarın. Aynı tüp alıcı başına CD45RB düşük hücrelerin 100 ul ekleyin. Hayvan başına toplam enjeksiyon hacmi 200 ul; CD45RB yüksek oranı: CD45RB alt hücreler 2: 1 dir.
- Yüksek / düşük CD45RB CD4 + hücreleri intraperitoneal her alıcının karın (200 ul toplam) sağ ve sol tarafına CD45RB yüksek veya CD45RB 100 ul enjekte edilir.
Alıcı Hayvanlarda Hastalık ilerleme 6. İzleme
- Alıcı hayvanların klinik durumunu değerlendirmek aşağıdaki Paramete için toplam klinik skorları atamak içinEnjeksiyon gününde rs 8 haftalık sonra, ve kurban sırasında:
- Kilo kaybı ölçerek israf belirleyin: 0 - hayır kilo kaybı; 1 - İlk vücut ağırlığının% 0.1-10 kaybı; 2 - Başlangıç vücut ağırlığı (Şekil 2A), ve% 10'dan daha fazla zarar.
Şekil 2: inflamasyonun klinik ve toptan patolojik işaretler Rag1 içine yabani tip CD4 + CD45RB yüksek T hücrelerinin transferinden sonra meydana - / - 11 (A) 'NRDKO alıcıları 5 ile başlangıç vücut ağırlıkları 10 ortalama% kayıp NRDKO alıcı fareler. haftalar sonrası transfer, Rag1 ise- / - Alıcıları, şu anda, hastalığın klinik belirtilerini göstermemiştir. Her nokta ± SEM kohort için başlangıç vücut ağırlığının ortalama yüzdesini temsil eder. ** P <0.005. Rektal prolapsus varlığı ile gösterildiği gibi (B) Bazı fareler, şiddetli bağırsak iltihabı geliştirdi. Bu NRDKO alıcı fare rektal prolapsus temsili resim. (C) Büyük oranda, gelen iki nokta üst üste, hem Rag1 - / - ve NRDKO alıcı fareler Rag1 gelen iki nokta üst üste ile karşılaştırıldığında kalınlaşmış ve kısaltılmış - / - ve T hücre evlatlık transferi olmadan NRDKO fareler. NRDKO alıcı farelerin kolonlar şiddetli inflamasyon ve artan kolon ağırlıkları (veriler gösterilmemiştir) gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
- O geçene kadar temiz bir kaba hayvan yerleştirerek dışkı kalitesini belirleyinDışkı: 0 - yok; 1 - yumuşak dışkı; 2 - sulu ve / veya kanlı dışkı.
- Hastalığın belirtileri aşağıdaki varlığı ile hayvanın genel sağlık belirleyin: 0 - hayır kambur duruş, kürk, ya da cilt lezyonları kıllı; 1 - Aşağıdaki mevcut herhangi bir: kambur duruş, kürk, deri lezyonları veya kıllı.
- Rektal prolapsus varlığı belirleyin: 0 - devamsızlık; 1 - Mevcut (Şekil 2B).
- Bu, başlangıç vücut ağırlığına göre% 20 kayıp ya da hangisi daha önce arzu edilen bir zaman noktasında, var olduğunda CO, sonra servikal dislokasyon 2 inhalasyon hayvanlar kurban. Klinik hastalık haftada 5 sonrası dolgunluk başlayan tipik açıktır.
- Daha önce açıklandığı gibi 5,7 hastalık şiddeti değerlendirmek.
- Adım 6.1 8 gibi klinik skorları atayın.
- Kolon uzunluğu ve ağırlığı (Şekil 2C) ölçün.
- Inflamasyon histolojik analiz gerçekleştirin5.
- Bağırsak doku eksplant kültürlerinde 9 spontan sitokin ifadesini belirleyin, mezenterik lenf düğümleri 10, ve / veya serum 11.
- Kısaca, eksplant kültürler 9, uzunlamasına açık, kurban sonrası iki nokta üst üste kaldırmak ve PBS ile temiz. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca tam ortam içinde 250 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde iki nokta üst üste inkübe edin.
- Küçük parçalar halinde doku doğranır ve 24 saat süre ile tam ortam içinde, 37 ° C'de inkübe edildi. Süpernatan toplamak ve ELISA ile 100 mg doku başına düşen sitokinlerin miktarının belirlenmesi için kullanılır.
- T hücre fenotipleri ve / veya fonksiyon 10 ex vivo karakterizasyonu gerçekleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yaklaşık yetişkin, C57BL / 6 verici fareden 10 dalaklarından 10 x 10 6, CD4 + T hücreleri, CD45RB yüksek güvenilir izole edilir. Bu sayı yaşla ve gerginlik verici fare ve araştırmacı yeterliliğine bağlı olarak değişecektir. Ne zaman 4 x 6 CD4 + T hücreleri CD45RB yüksek C57BL / 6 Rag1 aktarılır / 10 5 C57BL - / - alıcı fareler, hastalığın klinik belirtileri hafta 5 sonrası dolgunluk etrafında ortaya veya fareler (daha ağır hastalığa genetik olarak duyarlı olan er ise Şekil 2, 3) 11,12. - / - CD3 + T hücreleri Rag1 kolonları biriken görülür alıcıları gibi erken 3 hafta (Şekil 3A) 12 gibi.
Şekil 3: vahşi tip CD4 Transferi + Rag1 içine CD45RB yüksek T hücreleri - / - ve RKO / δ KD alıcıları kronik intestinal inflamasyonu 12 uyarmaktadır (A) (Orijinal büyütme 10X, H & E ve CD3 immünhistokimya).. / - - Alıcıları H & E boyama (üst paneller) epitel hiperplazi, iltihabi hücre infiltrasyon ve RKO / δ KD alıcılarında mevcut kript apseleri (ok) değil Rag1 göstermektedir. - / - Alıcıya RKO / δ KD alıcı fareler Kolonlar Rag1 gelen iki nokta üst üste göre CD3 IHC (alt paneller) ile CD3 + T hücrelerinin belirgin birikimi görüldü. Kolonlar fr kıyasla (B) Kolonlar RKO dan / δ KD alıcı fareler daha şiddetli inflamasyon gösterdiom Rag1 - / - histoloji puanlaması tarafından belirlenen alıcı fareler. (C, D) kolon eksplant kültürleri yaptım daha az IL-10 (C) salgılanan RKO / δ KD alıcı fareler ve daha fazla IL-12p40 (D) Kolon eksplant kültürler Rag1 - / -. Alıcı fareler bir görüntülemek için buraya tıklayınız Bu rakamın büyük versiyonu.
/ - - / Rag1 - / - çift nakavt alıcıları (NRDKO) Rag1 göre daha şiddetli kolit geliştirmek - Biz daha önce Nfil3 içine evlatlık T hücre transferi yayınlanmıştır / - alıcı fareler (Şekil 2) 11. NFIL3 olumsuz bağımsız olarak, IL-10-inducing etkileri 13 murin kolon makrofajlar IL-12p40 düzenler. IL-12p40 ve IL-10 düzensizliği yolu karıştığıinsan ogenesis İBH 1. Bu nedenle, kilo kaybı (Şekil 2A) ile gösterildiği gibi, daha hızlı bir hastalığın ilerlemesinde adoptif transfer NDRKO alıcı farelerde, kontrolsüz IL-12p40 üretimi. Bazı NRDKO alıcı fareler rektal prolapsus (Şekil 2B) sonuçlanan şiddetli hastalık gelişti. - / - Alıcı farelere (Şekil 2C) fena halde Rag1 göre, NRDKO alıcı fareler iki nokta incelmiş ve kolon, inflamatuar hücrelerin büyük bir akın eden, kısaltılmış.
Nispeten, Rag1 içinde - / - olmayan lenfosit toplumlarda bir işlevsiz PI3K katalitik alt birim p110δ (RKO / δ KD), CD4 + T hücre CD45RB yüksek doyurma NRDKO fareler ile karşılaştırıldığında hastalığın benzer hızlı ve ağır klinik seyir uyarır fareler (Şekil 3) 12. 3 hafta histolojik analiz kolon doku hipertrofisi, inflamasyonu gösterirtory hücre infiltrasyon ve kript apseleri Rag1 kıyasla RKO / δ KD alıcılarında (ok) - / - alıcıları (Şekil 3A). Bu deneyde alıcı farenin dolayı başlangıç vücut ağırlığına göre% 20 kaybetmiş bir önemli sayıda 3. haftada kurban edilmiştir. Deney gruplarına kör ve bizim laboratuvarda 12 geliştirilen belirli ölçütlere dayalı bir patolog tarafından belirlenen histolojik puanları, Rag1 kıyasla RKO / δ KD alıcı farelerde yüksek olduğu - / - alıcı fareler (Şekil 3B). Buna ek olarak, kolon eksplant kültürlerinde kendiliğinden sitokin üretimi göstermiştir Rag1 göre RKO / δ KD alıcı farelere IL-10 ve geliştirilmiş IL-12p40 üretimi azalır - / - alıcı fareler (Şekil 3C, D), 12. Yine IL-12p40 artış ve IL-10 üretiminin insan patogenezinde İBH 1 karıştığı azalmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada bağışıklık yetersizliği olan farelere, CD4 + CD45RB + T hücrelerinin adoptif nakli ile farelerde kolon inflamasyonu yol açan bir adım adım protokol açıklar. Alıcı fareler başka soybaşları rağmen (örneğin, BALB / c, 129S6 / SvEv, obez olmayan diyabetik (NOD)) immün yetmezlik ve genetik modelleri (örneğin, SCID, Rag2 - / - Bu, C57BL / 6 verici dalak ve genetik olarak özdeş Rag1 kullanılan - / -) da 4,14-16 kullanılabilir. İyi plan suşu farelerde 1 deneysel kolit şiddetini etkilediği bilinmektedir. Ayrıca, bir fare popülasyonunda enterik Mikrobiyota hatta aynı kurumda 6,17 içinde olanlar arasında, tesisler arasında büyük farklılıklar gösterir. Şekil 2 ve 3 Rag1 içinde kolit gelişimini göstermek yok iken - / - 4 hafta sonrası transfer de fareler, bizim ve başkalarının deneyimler Rag1 içinde - / - alıcılar cli geliştirmekCD4 + T hücrelerinin CD45RB yüksek 18-23 transferinden sonra 6 ve 9 hafta arasında nical hastalık. Içi ve arası deneysel tutarsızlığı en aza indirmek için deneysel kolit bu modeli kurarken klinik seyri ve hastalık ifade ve bu değişkenlik dikkate alınmalıdır.
Bu deneyin tekrarlanabilirliği için kritik bir adım kalıntı aktif / bellek / düzenleyici T hücreleri olmadan CD4 + CD45RB yüksek hücrelerin saf popülasyonlarının FACS izolasyon olduğunu. Bu akış sitometri bir yetkin bir anlayış gerektirir. İlk olumsuz cansız ve CD4 hücreleri seçmek önemlidir. Ardından, CD45RB-PE hücreleri için basit bir histogram kullanarak, CD45RB yüksek T hücrelerini ve CD45RB düşük T hücreleri olarak en düşük% 20 temsil hücrelerin en yüksek% 40 seçin. Diğer belirteçler, CD62L ve CD25 naif CD4 + T hücrelerinin izolasyonu için vardır kullanmayı düşünün yüksek bizim deneyim CD45RB olmasına rağmen düşük ayırma yeterli ve 5 tekrarlanabilir. Ayrıca, hastalığın fenotip üzerindeki düzenleyici T hücre popülasyonlarının etkilerini incelemek için alıcıların aktarılır düşük T hücrelerini CD45RB yüksek CD45RB oranını değiştirmek mümkündür. Gelecek deneylerde bu protokolü kullanarak daha sonra FACS protokolü kurmak ve başlangıçta akış sitometri ile tanıdık biriyle çalışın. Buna ek olarak, önemli bir değişiklik bu protokolde sonuçları etkileyebilecek bir adım alıcı farelere T hücrelerinin intraperitonal enjeksiyondur. Burada, içi ve arası deneyci değişkenlik büyük ölçüde deney sonucunu etkileyebilir. Bu adoptively transfer hücrelerin nitelik ve nicelik değişkenliği en aza indirecek şekilde bu adımı gerçekleştiren kişi taşıma fareler ve enjeksiyon tekniği ile rahat olduğunu ileri sürülmektedir. Ayrıca, iğne matlaşma etkinliğini etkileyebilir olarak, fareler arasındaki iğneler değiştirmek için önemlidirintraperitoneal enjeksiyon.
Etiketleme ve sıralama Hücreleri: CD4 + T hücreleri ve Bölüm 4 Zenginleştirme: optimizasyonu gerektiren protokol Adımlar Bölüm 3 içerir. CD4 + T hücre zenginleştirme optimizasyonu kullanılan manyetik sisteme bağlıdır ve üreticilerin talimatları takip etmelidir. Manyetik hücre ayırma sistemleri için seçenekler Belirli Reaktifler / Ekipman Tablo listelenmiştir. Bu doğrudan hücrelerin fenotipini de etkiler, bu nüfus etiketleme, negatif seçim ile CD4 + T hücreleri zenginleştirmek için tavsiye edilir. FACS için hücrelerin etiketlenmesi için birçok antikor klonlar vardır. Antikor konsantrasyonu (adım 4.4) seçici boyanmasını sağlamak ve FACS sırasında CD4 + CD45RB, T hücre popülasyonlarının yeterli ayırma elde etmek için optimize edilmelidir.
Bu protokolün geliştirilmesi sorunsuz çekim gerektirebilir. Her bir deneyde ilk başarıaraştırmacı yeterlilik bağlıdır ve bu yöntemlerin gelişmiş beceri ile artacaktır. Bununla birlikte, adoptif transfer için T hücrelerinin sürekli elde düşük sayılar, izolasyon sırasında hücreleri buz üzerinde tutarak çok rahatsız edici bir santrifüj hücreler tekrar süspansiyon haline getirerek ya da küçük dalak genç farelerden elde edilen splenositlerin kullanımı olup neden olabilir. Buna ek olarak, (yukarıya bakınız), eksik ya da spesifik olmayan hücre lekelenmenin engellenmesi için boyama için, anti-CD4 ve anti-CD45RB etiketleme antikor konsantrasyonunun optimize. Alıcıların bağırsak iltihabı yaygın değişen derecelerde ortaya çıkarsa, en muhtemel nedeni belirsiz intraperitoneal enjeksiyon tekniğidir. Bu uygulama ile geliştirmek gerekir ve alıcı farelerin bağırsak CD3 + hücrelerinin immünohistolojik boyama ile izlenebilir. Dikkate alınacak ek şeyler donör ve alıcı fareler ve hastalık penetrasyonu normal varyasyonları cinsiyetini içerir. Erkek alıcı fareler kullanıldığında, erkek veya kadın donör fareler ya vardırppropriate. Dişi alıcı fareler kullanılacak olan, ancak donör fareler 5 kadın olmalıdır. Bizim ve diğerleri 'deneyimleri, bu modelde hastalığın penetrasyonu% 85-90 5'tir. Böylece bazı fareler bağırsak iltihabı gelişebilir olmayabilir beklenen, hastalık şiddeti belirgin değişkenlik verilen diğer nedenleri ekarte edilmiştir. Kemirgen gastrointestinal Mikrobiyota ve Mikrobiyota 6,17 etkileyen uygulamalar konusunda orada bir organizasyon içinde tesisleri arasında fenotipleri belirgin farklılıklar olduğunu ve bunun dışında aklınızda bulundurun. Böylece, fenotip veya Rag1 hastalık kinetik sağlamlığı - / - alıcı fareler yaygın kişinin konumuna göre değişebilir. Bu nedenle, her bir tesisten elde edilen zamana ve sonuçlara göre, bu deneyler için en iyi parametreleri belirlemek için önemlidir.
Burada iyi karakterize adaptif transferi murin metodolojisini açıklamakİnsan IBD 5 benzeyen kronik ince barsak ve kolon iltihabı modeli. Bu adım adım protokolü araştırma amaçlı bu yöntemin başarılı gelişimi için anahtar teknikler göstermektedir. Çeşitli hücre popülasyonlarının hastalığı senkronizasyon ve manipülasyon için olanak sağladığı için bu, insan IBD özellikle yararlı bir hayvan modelidir. Ancak, bağışıklık yetersizliği alıcı fareler genetik olasılıkla mansap hastalık sonuçlarını etkileyen, olgun adaptif bağışıklık hücreleri olmadan geliştirmek için modifiye edilmiştir. Buna rağmen, burada anlatılan yöntem, insan patogenezde enterik Mikrobiyota, doğuştan gelen bağışıklık hücreleri, ve adaptif bağışıklık düzenleyici hücrelerin etkisini belirleyen gelecekteki çalışmalarda çok yararlı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma, Amerikan Gastroenteroloji Derneği (AGA) Araştırma Alimler Ödülü ve Crohn ve Amerika (CCFA) (ECS) (SZS için) Kariyer Geliştirme Ödülü NIH NIDDK F30 DK089692 Kolit Vakfı ve Gastrointestinal Biyoloji Kuzey Carolina Merkezi'nin Üniversitesi tarafından desteklenen ve Hastalık Hibe P30 DK34987 (Histoloji Çekirdek). UNC Sitometrisi Çekirdek Tesisi UNC Lineberger Kapsamlı Kanser Merkezi'nde bir NCI Merkezi Çekirdek Desteği Grant (P30CA016086) tarafından kısmen desteklenmektedir. Biz histopatolojik analiz ve immunohistokimyasal ile yaptığı yardım için Veteriner North Carolina State University College Luke B. Borst teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 10x PBS | Gibco | 14200075 | |
| 12 mm x 75 mm round-bottom tube | Falcon | 352052 | |
| 15 ml conical | Corning | 430790 | |
| 26 G x 3/8 Needle | BD Biosciences | 305110 | |
| 50 ml conical | Corning | 430828 | |
| 70 μm Cell Strainer | Fisherbrand | 22363548 | |
| BD IMagnet | BD Biosciences | 552311 | |
| β-mercaptoethanol | Thermo Scientific | 35602 | |
| CD4-FITC IgG2b | eBioscience | 11-0041 | |
| CD45RB-PE IgG2a | BD Pharminogen | 553101 | |
| Complete Media | RPMI-1640, 1% Pen/Strep, 10% FBS, 0.0004% β-ME | ||
| FACS tube + strainer | BD Falcon | 352235 | |
| Glass Microscope Slides | Fisherbrand | 12550A3 | |
| Heat-inactivated FBS | Gemini | 100-106 | |
| Labeling Buffer | 1x PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA | ||
| Lysis Buffer | 0.08% NH4Cl, 0.1% KHCO3, 1 mM EDTA | ||
| MoFlo XDP | Beckman Coulter | ||
| Mouse CD4 T lymphocyte Enrichment Set - DM | BD Biosciences | 558131 | |
| Mouse IgG2a-PE | BD Pharminogen | 553457 | |
| Mouse IgG2b-FITC | eBioscience | 11-4732 | |
| Pasteur pipet | Fisherbrand | 13-678-20D | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100X | Corning Cellgro | 30-002-CI |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri Dish | Fisherbrand | 875713 | |
| Pure Ethanol 200 Proof | Decon Labs | 2705-HC | |
| RPMI-1640 | Gibco | 11-875-093 | |
| Syringe | BD Biosciences | 309597 | |
| Trypan blue | Corning Cellgro | 25-900-CI | |
| Wash Media | RPMI-1640, 1% Pen/Strep, 0.0004% β-ME |
References
- Xavier, R. J., Podolsky, D. K. Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 448 (7152), 427-434 (2007).
- Cho, J. H., Brant, S. R. Recent insights into the genetics of inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 140 (6), 1704-1712 (2011).
- Jostins, L., et al. Host-microbe interactions have shaped the genetic architecture of inflammatory bowel disease. Nature. 491 (7422), 119-124 (2012).
- Powrie, F., Leach, M. W., Mauze, S., Caddle, L. B., Coffman, R. L. Phenotypically distinct subsets of CD4+ T cells induce or protect from chronic intestinal inflammation in C. B-17 scid mice. Int Immunol. 5 (11), 1461-1471 (1993).
- Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: concepts, considerations, and tricks of the trade. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296 (2), 135-146 (2009).
- Ma, B. W., et al. Routine habitat change: a source of unrecognized transient alteration of intestinal microbiota in laboratory mice. PLoS One. 7 (10), e47416 (2012).
- Read, S., Powrie, F. Induction of inflammatory bowel disease in immunodeficient mice by depletion of regulatory T cells. Curr Protoc Immunol. Chapter 15 (Unit 15 13), (1999).
- Maillard, M. H., et al. The Wiskott-Aldrich syndrome protein is required for the function of CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) regulatory T cells. J Exp Med. 204 (2), 381-391 (2007).
- Hegazi, R. A., et al. Carbon monoxide ameliorates chronic murine colitis through a heme oxygenase 1-dependent pathway. J Exp Med. 202 (12), 1703-1713 (2005).
- Kole, A., et al. Type I IFNs regulate effector and regulatory T cell accumulation and anti-inflammatory cytokine production during T cell-mediated colitis. J Immunol. 191 (5), 2771-2779 (2013).
- Kobayashi, T., et al. NFIL3-deficient mice develop microbiota-dependent, IL-12/23-driven spontaneous colitis. J Immunol. 192 (4), 1918-1927 (2014).
- Steinbach, E. C., et al. Innate PI3K p110delta Regulates Th1/Th17 Development and Microbiota-Dependent Colitis. J Immunol. 192 (8), 3958-3968 (2014).
- Kobayashi, T., et al. NFIL3 is a regulator of IL-12 p40 in macrophages and mucosal immunity. J Immunol. 186 (8), 4649-4655 (2011).
- Leach, M. W., Bean, A. G., Mauze, S., Coffman, R. L., Powrie, F. Inflammatory bowel disease in C.B-17 scid mice reconstituted with the CD45RBhigh subset of CD4+ T cells. Am J Pathol. 148 (5), 1503-1515 (1996).
- Powrie, F., et al. Inhibition of Th1 responses prevents inflammatory bowel disease in scid mice reconstituted with CD45RBhi CD4. T cells. Immunity. 1 (7), 553-562 (1994).
- Read, S., Malmstrom, V., Powrie, F. Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 plays an essential role in the function of CD25(+)CD4(+) regulatory cells that control intestinal inflammation. J Exp Med. 192 (2), 295-302 (2000).
- Rogers, G. B., et al. Functional divergence in gastrointestinal microbiota in physically-separated genetically identical mice. Sci Rep. 4, 5437 (2014).
- Fukata, M., et al. The myeloid differentiation factor 88 (MyD88) is required for CD4+ T cell effector function in a murine model of inflammatory bowel disease. J Immunol. 180 (3), 1886-1894 (2008).
- Kurtz, C. C., et al. Extracellular adenosine regulates colitis through effects on lymphoid and nonlymphoid cells. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 307 (3), 338-346 (2014).
- Naganuma, M., et al. Cutting edge: Critical role for A2A adenosine receptors in the T cell-mediated regulation of colitis. J Immunol. 177 (5), 2765-2769 (2006).
- Ranatunga, D. C., et al. A protective role for human IL-10-expressing CD4+ T cells in colitis. J Immunol. 189 (3), 1243-1252 (2012).
- Srikrishna, G., et al. Carboxylated glycans mediate colitis through activation of NF-kappa. B. J Immunol. 175 (8), 5412-5422 (2005).
- Wang, F., et al. IFN-gamma-induced TNFR2 expression is required for TNF-dependent intestinal epithelial barrier dysfunction. Gastroenterology. 131 (4), 1153-1163 (2006).
