Abstract
יש מודלים של בעלי חיים רבים ושונים זמינים ללימוד פתוגנזה של מחלות בבני אדם מעי דלקתיות (IBD), כל אחד עם יתרונות משלה וחסרונות. אנו מתארים כאן מודל קוליטיס ניסיוני שהוא ביוזמת העברת מאמצת של תאי טחול syngeneic CD4 + T CD45RB הגבוה לעכברי נמען חסרי T ו- B תא. אוכלוסיית תאי T מסוג CD4 + הגבוה CD45RB שמורכבת בעיקר של תאי מפעיל נאיביים היא מסוגלת גרימת דלקת מעיים כרונית, דומה מאוד להיבטים מרכזיים של IBD האנושי. שיטה זו ניתן להשפיע ללמוד היבטים של תחילת מחלה והתקדמות. בנוסף ניתן להשתמש בו כדי ללמוד את הפונקציה של מולדת, מסתגל, ואוכלוסיות תאים חיסוני רגולציה, ואת התפקיד של חשיפות סביבתיות, כלומר, החיידקים, בדלקת מעיים. במאמר זה אנו מדגימים את המתודולוגיה לגרימת דלקת המעי הגס עם פרוטוקול צעד-אחר-צעד. inc זהלרכב וידאו הדגמה של היבטים טכניים מפתח נדרשו לפתח מודל העכברי של קוליטיס הניסיוני למטרות מחקר בהצלחה.
Protocol
הערה: ודא שכל הפרוטוקולים של בעלי החיים שאושרו על ידי ובעמידה בבעלי חיים מוסדי טיפול ושימוש ועדת תקנות (IACUC) והמדריך של המועצה הלאומית למחקר לטיפול והשימוש בחי מעבדה. עכברי תורם יכולים להיות זכר או נקבה, אבל עכברי נמען צריכים להיות גבר. אם המקבלים נשיים הם לשמש, עכברי התורם חייבים להיות נקבה 5. לשמור על מושבות משתמשים במצעים רגילים, שאינם סטרילי ומים acidified עישון, כמו אלה עלולים להשפיע על חיידקי מעיים, ו, ובכך, את הפנוטיפ קוליטיס של העכברים 5,6.
1. ניסיוני הכנה
- להשתמש במדיה קרים כקרח ומאגרים. שמור את התאים על קרח לאורך כל הניסוי.
- לבצע את הניסוי במכסת מנוע Biohazard סטרילי באמצעות טכניקה סטרילית.
2. בידוד של תאי הטחול T
- להרדים עכבר תורם / עכברים בתא CO 2 ואחריו dislocatio צוואר הרחםn. תרסיס בטן עם אתנול 70%.
- לעשות חתך אופקי בבטן ולקלף את העור לחשוף הצפק. החזק הצפק מהאיברים הפנימיים עם המלקחיים ולעשות חתך בבטן השמאלי הצפק לחשוף ולהסיר את הטחול.
- מניחים את הטחול ב 10 מיליליטר של מדיה מלאה בצלחת פטרי. להסיר ולסלק רקמה עודפת מטחול.
- השתמש 2 שקופיות זכוכית מעוקרות למחוץ ולהפריד טחול להשעית תא בודד. תא מסנן השעיה דרך מסננת 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל ולשטוף מסננת עם 5 מיליליטר של מדיה מלאה. הנח עד 5 טחולים בצינור אחד 50 מיליליטר חרוטי.
- תאי צנטריפוגה ב 450 XG במשך 7 דקות. בטל supernatant על ידי שפיכה כבויה או על ידי שאיבת אבק למכל פסולת.
- בעדינות resuspend תאים ב5 מיליליטר לטחול של תמוגה הצפת לlyse תאי דם אדומים במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר. הוסף נפח שווה של מדיה מלאה (5 מיליליטר לטחול) לצינור.
- בעדינות resuspend תאים ב 10 מיליליטר של תיוג הצפת.
- ספירת תאים על ידי הרחקה הכחולה trypan.
- הסר 20 μl של השעיה תא ולהוסיף לtrypan כחול 180 μl לצינור microfuge ומערבבים היטב. אחרי 5 דקות, להוסיף 10 μl שכותרתו תאים לhemocytometer ולספור תאים שאינם כחולים-מתחת למיקרוסקופ. לקבוע את מספר כולל של תאי קיימא. מחק תא / trypan תערובת כחולה.
- תאי צנטריפוגה ב 10 מיליליטר של תיוג הצפת ב 450 XG במשך 7 דקות. בטל supernatant על ידי שפיכה כבויה או על ידי שאיבת אבק למכל פסולת.
3. העשרה של תאי CD4 + T
הערה: בצע את ההוראות של היצרן למוצרים ספציפיים בשימוש בסעיף זה.
- בעדינות resuspend תאים להשעית תא בודד של 20 x 10 6 תאים / מיליליטר בתווית קרהing מאגר.
- הוסף 5 μl לכל 1 x 10 6 תאים של נוגדני העשרת תאי CD4 T biotinylated. דגירה תאים על קרח במשך 15 דקות.
- להוסיף 10x נפח של תיוג הצפת. תאי צנטריפוגה בg × 450 במשך 7 דקות. בזהירות לשאוב את כל supernatant באמצעות שאיבת ואקום למכל פסולת.
- ביסודיות מערבולת חלקיקים מגנטיים streptavidin מצומדות. הוסף 5 μl של חלקיקים לכל 1 x 10 6 תאים.
- מערבבים היטב אך בעדינות. שמור תערובת ב6-12 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- הוספת תיוג הצפת לריכוז של 20-80 x 10 6 תאים / מיליליטר. להעביר עד 1.0 מיליליטר שכותרתו תאים לכל 12 x 75 מ"מ מבחנה מסביב לתחתית (המכונה "הצינור חיובי-חלק").
- מניחים כל צינור חיובי-שבריר על מגנט במשך 6-8 דקות.
- עם הצינורות החיובי-שבריר עדיין על המגנט, בזהירות להעביר supernatant מצינור חיובי-חלק עם pipet פסטר זכוכית לצינור חרוטי 50 מיליליטר סטרילי חדש (referreד כל" שבריר המועשר "). חלק מועשר זה מכיל תאי CD4 + T. היזהר שלא לשבש את התאים שכותרתו נמשכים אל המגנט.
- תאי Resuspend נותרו בצינורות החיובי-החלק באותו הנפח של תיוג הצפת כמו בשלב 3.6 ידי pipetting למעלה ולמטה במרץ. מניחים צינור חיובי-חלק אחורי על מגנט במשך 6-8 דקות.
- עם צינורות חיובי-שבריר עדיין על המגנט, בזהירות להעביר supernatant (מועשרת שבריר, CD4 +) מצינור חיובי-חלק עם pipet פסטר זכוכית לסטרילי 50 מיליליטר צינור חרוטי מצעד 3.8 מבלי לשבש תאים מצורפים למגנט.
- חזור על שלבים 3.9-3.10 להגדיל את התשואה של תאי CD4 + T שהושגו. המשך פרוטוקול באמצעות שבריר מועשר (CD4 + תאים).
4. תאי תיוג ומיון 7
- צנטריפוגה מועשרת תאים ב 450 XG במשך 7 דקות. בטל supernatant על ידי שפיכה כבויה או suct ואקוםיון למכל פסולת.
- תאי Resuspend ב 1 מיליליטר של תיוג הצפת. הסר aliquot של תאים לספור ולהעריך כדאיויות תא על ידי הרחקה הכחולה trypan כמו בשלב 2.9.
- הוספת נפח של תיוג הצפת עד 10 x 10 6 תאים / מיליליטר; אם תאים כבר <10 x 10 6, צנטריפוגות ב 450 XG במשך 7 דקות, להשליך supernatant על ידי שפיכה כבויה או שאיבת אבק למכל פסולת, ולהוסיף נפח של תיוג הצפת עד 10 x 10 6 תאים / מיליליטר.
- הגדר את aliquots הנפרד של × 10 5 תאים כ 5-10 כל לתאי שליטה בלא כתם, מוכתם אלוטיפ, ומוכתם יחידים בצינורות microfuge.
- הוסף 5 מיקרוגרם CD4-FITC ו1 מיקרוגרם / מיליליטר CD45RB-PE / מיליליטר לתאים. להוסיף כתמי שליטת אלוטיפ וכתמים בודדים באותו הריכוז לנכס aliquots בצינורות microfuge. מערבבים היטב אך בעדינות ולדגור על הקרח המוגן מפני אור למשך 30 דקות.
- להוסיף 10x נפח של תיוג מאגר לתאים ובקרהs. צנטריפוגה XG 450 במשך 7 דקות. בטל supernatant על ידי שאיבת אבק למכל פסולת.
- Resuspend בתיוג הצפת הנפח בשלב 4.5. צנטריפוגה XG 450 במשך 7 דקות. בטל supernatant על ידי שאיבת אבק למכל פסולת.
- Resuspend בתיוג הצפת עד 10 x 10 6 תאים / מיליליטר. עובר תאים דרך מסננת 70 מיקרומטר לתוך צינור FACS. שמור על הקרח המוגן מפני אור עד מוכן לFACS.
- להגדיר ולקבוע פיצוי הולם על סדרן התא עם תאים בלא כתם ובקרות מוכתמים יחידים.
- אל תכלול תאי nonviable עם gating צופה וצד-פיזור (איור 1 א). הגדרת gating לCD4 + וCD45RB + תאים עם פקדים מוכתמים אלוטיפ. תאי שער בCD4 + אוכלוסייה.
- מיין CD4 + תאים לאוכלוסיות נמוכות CD45RB הגבוה וCD45RB באמצעות היסטוגרמה פשוטה לתאים מוכתמים PE לתוך צינורות עם 2 מיליליטר של מדיה מלאה. CD45RB הגבוה + CD45RB + תאים (CD45RB הגבוה), והאוכלוסייה הנמוכה CD45RB היא 20% הנמוכים ביותר של CD4 + CD45RB + תאים (CD45RB הנמוך; איור 1).
איור 1: תזרים נציג cytometry חלקות של אוכלוסיות תאי CD4 + T CD45RB במהלך ניתוח FACS (- C) FITC CD4- וPE CD45RB מוכתם splenocytes מהתורם C57BL / 6 עכברים מסודרים על ידי FACS ל+ גבוה וCD4 CD4 + CD45RB. אוכלוסיות תאי T הנמוך CD45RB. אירועים () כפיל לא נכללו בעלילת הפיזור קדימה. (ב) לימפוציטים היו מגודר בעלילה קדימה וצד פיזור. (C) CD4 + (D) CD4 + CD45RB + T היו זממו על היסטוגרמה אירועי PE לעומת. תאי CD4 + נמוכים CD45RB נחשבו 20% הנמוכים ביותר של CD45RB + תאים. תאי CD4 + גבוהים CD45RB הוגדרו כ-40% הגבוהים ביותר של CD45RB + תאים.
- הפעל aliquot של כל אוכלוסיית תאים במכונה FACS להעריך טוהר של אוכלוסיות.
- צנטריפוגה מסודרים תאים ב 450 XG במשך 7 דקות. Resuspend ב 1 מיליליטר PBS. הסר aliquot של תאים לספור ולהעריך כדאיויות תא על ידי הרחקה הכחולה trypan כמו בשלב 2.9.
5. הזרקה של תאים לתוך מקבלי
- Resuspend מסודרים תאים עד 4 x 10 6 תאים / מיליליטר (CD45RB גבוה) או 2 x 10 6 תאים / מיליליטר (CD45RB הנמוך) בPBS.
- העבר את תאים גבוהים CD45RB 100 μl למקבל לצינור סטרילי החדש. הוספה של כל PBS 100 μlנמען לצינור זה. לפיכך, הזרקה הכולל לבעלי חי נפח הוא 200 μl, וסכום כולל של תאים לכל נמען הוא 4 תאים נאיביים גבוהים x 10 5 CD4 + T CD45RB.
- אם קבוצת ניסוי שקיבלה תאי T רגולטורים היא רצויה, להעביר תאים גבוהים CD45RB 100 μl למקבל לצינור סטרילי החדש. הוספה של תאים נמוכים CD45RB למקבל 100 μl לאותו צינור. הזרקה הכולל לבעלי חי נפח הוא 200 μl; יחס הגבוה CD45RB: התאים נמוכים CD45RB הוא 2: 1.
- הזרק של CD45RB גבוה או CD45RB 100 μl CD4 הגבוה / הנמוך CD45RB + תאים intraperitoneally לימין וצד שמאל של הבטן (הכוללת של 200 μl) של כל אחד מנמענים.
6. ניטור של מחלת התקדמות בבעלי חיים נמען
- על מנת להעריך את המצב הקליני של בעלי החיים הנמען, להקצות עשרות קליניים מצטברים לparamete הבאrs 8 ביום ההזרקה, שבועי לאחר מכן, ובזמן של הקרבה:
- לקבוע מבזבז על ידי מדידת ירידה במשקל: 0 - אין ירידה במשקל; הפסד 0.1-10% ממשקל גוף ראשוני - 1; 2 - אובדן יותר מ -10% ממשקל גוף ראשוני (איור 2 א).
איור 2: סימנים פתולוגיים קליניים וגולמיים של דלקת להתרחש לאחר העברת סוג בר תאי T מסוג CD4 + הגבוה CD45RB לRag1 - / - ועכברים נמען NRDKO 11 () מקבלי NRDKO איבדו בממוצע 10% ממשקל הגוף הראשוני שלהם על ידי 5. שבועות לאחר העברה-, ואילו Rag1- / - המקבלים לא מפגינים סימנים קליניים של מחלה בשלב זה. כל נקודה מייצגת את האחוז הממוצע של משקל גוף ראשוני למחזור ± SEM. ** P <0.005. (ב) עכברי חלק פיתחו דלקת מעיים חמורה, כפי שהודגם על ידי הנוכחות של צניחה של פי הטבעת. זוהי תמונה מייצגת של צניחה של פי הטבעת בעכבר נמען NRDKO. (C) באופן בוטה, נקודותיים משני Rag1 - / - ועכברים נמען NRDKO מעובה וקצרו בהשוואה למתיישבי Rag1 - / - והעכברים NRDKO ללא העברת מאמצת תא T. מתיישבי עכברי נמען NRDKO להראות דלקת חמורה ומשקולות מעי גס מוגברות (מידע לא מוצג). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
- לקבוע את האיכות של צואה על ידי הצבת בעלי חיים במכל נקי עד שעברשרפרף: 0 - אין; 1 - צואה רכה; 2 - שרפרף מימי ו / או דמים.
- לקבוע בריאות כללית של בעלי חיים על ידי נוכחות של הסימנים של המחלה הבאה: 0 - אין יציבה כפופה, זיפי פרווה, עור או נגעים; 1 - כל אחד מהנוכחים הבאים: היציבה כפופה, זיפי פרווה, או נגעים בעור.
- לקבוע נוכחות של צניחה של פי הטבעת: 0 - נעדר; 1 - הווה (איור 2).
- להקריב בעלי חיים משאיפת CO 2 ואחריו נקע בצוואר הרחם, כאשר הם איבדו 20% ממשקל גופם ההתחלתי או בנקודת זמן רצויה, לפי המוקדם מביניהם. מחלה קלינית היא בדרך כלל לכאורה מתחילה בשבוע 5 לאחר הגודש.
- להעריך את חומרת מחלה כפי שתואר בעבר 5,7.
- להקצות עשרות קליניים כמו בשלב 6.1 8.
- למדוד אורך מעי גס ומשקל (איור 2 ג).
- לבצע ניתוח היסטולוגית של דלקת5.
- לקבוע ביטוי ציטוקינים ספונטני בתרבויות explant רקמת מעי 9, הלימפה mesenteric צומת 10, ו / או בסרום 11.
- בקצרה, לתרבויות explant 9, להסיר נקודותיים לאחר הקרבה, פתוח לאורך הזמן, ונקי עם PBS. דגירה נקודותיים בייקר מסלולית נקבע על 250 סל"ד במדיה שלמה למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר.
- קוצצים רקמה לחתיכות קטנות וטופחו על 37 מעלות צלזיוס במדיה שלמה עבור 24 שעות. לאסוף את supernatant ולהשתמש כדי לכמת את ציטוקינים לכל 100 מ"ג רקמה על ידי ELISA.
- בצע vivo לשעבר אפיון של פנוטיפים תאי T ו / או פונקציה 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כ 10 x 10 6 תאי T מסוג CD4 + הגבוה CD45RB מ -10 טחולים ממבוגרי C57BL / 6 עכברים תורמים באופן מהימן מבודדים. מספר זה ישתנה בהתאם לגיל והמתח של עכבר התורם ומיומנותו של החוקר. כאשר 4 x 10 5 C57BL / 6 תאי T מסוג CD4 + הגבוה CD45RB מועברים לתוך C57BL Rag1 / 6 - / - עכברי נמען, סימנים קליניים של מחלה מופיעים ברחבי שבוע 5 הודעה גודש-או מוקדם יותר אם עכברים עם רגישות גנטית למחלה חמורה יותר ( איור 2, 3) 11,12. תאי CD3 + T נראים מצטברים בנקודותיים של Rag1 - / - המקבלים כבר 3 שבועות (איור 3 א) 12.
איור 3: העברה מסוג CD4 + פראי תאי T הגבוה CD45RB לRag1 - / - ומקבלי RKO / KD δ גורמים לדלקת מעיים כרונית 12 (א) (ההגדלה מקורית 10X, H & E ואימונוהיסטוכימיה CD3).. צביעת H & E (לוחות העליונים) ממחישה היפרפלזיה אפיתל, מחלחל תא דלקתי, ומורסות קריפטה (חץ) בהווה במקבלי KD / δ RKO אבל לא Rag1 - / - המקבלים. מתיישבי עכברי נמען KD RKO / δ הפגינו הצטברות ניכרת של תאי CD3 + T על ידי CD3 IHC (לוחות תחתון) בהשוואה למתיישבי Rag1 - / - המקבלים. (ב) המתיישבים RKO / KD δ עכברי נמען הפגינו דלקת חמורה יותר בהשוואה לfr נקודותייםאום Rag1 - / - עכברי נמען כפי שנקבע על ידי ניקוד היסטולוגיה. (C, D) תרבויות explant מעי גסות מעכברי RKO / δ נמען KD המופרשים פחות IL-10 (ג) ועוד IL-12p40 (D) מאשר תרבויות explant מעי הגס מRag1 - / -. עכברי נמען אנא לחץ כאן לצפייה גרסה גדולה יותר של דמות זו.
פרסמנו בעבר כי העברת תא מאמצת T לNfil3 - / - / Rag1 - / - מקבלי נוקאאוט כפולים (NRDKO) לפתח קוליטיס חמור יותר בהשוואה לRag1 - / - עכברי נמען (איור 2) 11. NFIL3 מסדיר באופן שלילי IL-12p40 במקרופאגים מעי הגס העכבריים עצמאית של השפעות IL-10-גרימתה 13. אי סדיר של IL-12p40 וIL-10 מעורב בדרךogenesis של אדם 1 IBD. לפיכך, IL-12p40 ייצור לא בדוק בתוצאות מאמצת ההעברה NDRKO עכברי נמען בהתקדמות מחלה מהירה יותר, כפי שמוצגים על ידי ירידה במשקל (איור 2 א). עכברי נמען מסוימים NRDKO פיתחו מחלה קשה וכתוצאה מכך צניחה של פי הטבעת (איור 2). גס, נקודותיים מעכברי נמען NRDKO מעובות וקצרו, המייצגים את זרם גדול של תאי דלקת לתוך המעי הגס, בהשוואה לRag1 - עכברי נמען (איור 2 ג) - /.
יחסית, בRag1 - / - איור עכברים עם p110δ nonfunctional PI3K קטליטי למקטע באוכלוסיות שאינן הלימפוציטים (RKO / KD δ), גודש תא הגבוה T מסוג CD4 + CD45RB גורם מהלך קליני דומה מהיר וחמור של מחלה בהשוואה לעכברי NRDKO ( 3) 12. ניתוח היסטולוגית ב 3 שבועות מדגים היפרטרופיה רקמת מעי הגס, inflammaמחלחל טורי תא, ומורסות קריפטה (חץ) במקבלי KD / δ RKO לעומת Rag1 - / - המקבלים (איור 3 א). עכברי נמען בניסוי זה היו מורדמים בשעה 3 שבועות בשל מספר משמעותי שאיבד 20% ממשקל גופם הראשוני. ציונים היסטולוגית, כפי שנקבעו על ידי פתולוג עיוור לקבוצות ניסוי ומבוסס על קריטריונים ספציפיים שפותחו במעבדה שלנו 12, היו גבוהים יותר בעכברי נמען KD RKO / δ לעומת Rag1 - / - עכברי נמען (איור 3). בנוסף, ייצור ציטוקינים ספונטני מתרבויות explant מעי הגס הפגין ירידת IL-10 ומשופר ייצור IL-12p40 על ידי עכברי נמען KD RKO / δ לעומת Rag1 - / - עכברי נמען (איור 3 ג, ד) 12. שוב, עלה IL-12p40 וירידה בייצור IL-10 מעורב בפתוגנזה של אדם 1 IBD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנו מתארים פרוטוקול צעד-אחר-צעד גרימת דלקת במעי הגס בעכברים על ידי העברת מאמצת של תאי CD4 + CD45RB + T לעכברי immunodeficient. אנחנו השתמשנו טחולי C57BL / 6 תורם וRag1 syngeneic - / - עכברי נמען, אם כי זנים אחרים (למשל, BALB / ג, 129S6 / SvEv, סוכרת שאינן סובל מהשמנת יתר (NOD)) מודלים וגנטיים של כשל חיסוני (לדוגמא, SCID, Rag2 - / - גם) עשוי לשמש 4,14-16. היא מבוססת היטב כי לחץ משפיע על רקע חומרת קוליטיס ניסיונית בעכברי 1. יתר על כן, חיידקי מעיים באוכלוסייה עכברית משתנים מאוד בין מתקנים, אפילו בין אלה בתוך אותו המוסד 6,17. בעוד איורים 2 ו -3 לא מראים את ההתפתחות של דלקת במעי גס בRag1 - / - עכברים ב 4 שבועות לאחר העברה-, בRag1 שלנו והחוויות של אחרים - / - המקבלים לפתח CLIהמחלה nical בין 6 ל 9 שבועות לאחר העברת תאי T מסוג CD4 + הגבוה CD45RB 18-23. השתנות במהלך קליני וביטוי מחלה ואת זה צריכה להילקח בחשבון בעת הקמת מודל זה של קוליטיס הניסיון למזער חוסר עקביות התוך והבין-ניסיונית.
צעד קריטי לשחזור של ניסוי זה הוא בידוד FACS של אוכלוסיות טהורות של תאי CD4 + גבוהים CD45RB ללא / זיכרון / תאי T שיורית מופעלים רגולציה. זה כרוך הבנה מיומנת של הזרימה cytometry. חשוב לבחור ראשון באופן שלילי תאים שאינם בר-קיימא וCD4-. לאחר מכן, באמצעות היסטוגרמה פשוטה לתאי CD45RB-PE, בחר 40% הגבוהים ביותר של תאים לייצג את תאי T הגבוה CD45RB ו -20% הנמוכים ביותר כמו תאי T הנמוכים CD45RB. סמנים אחרים לשקול שימוש לבידוד של תאי CD4 + T נאיביים הם CD62L וCD25, אם כי בCD45RB הניסיון שלנו גבוה נמוכה> וCD45RB מספיקה לשחזור 5. בנוסף, ניתן לשנות את היחס של CD45RB הגבוה לCD45RB תאי T נמוכים הועברו לנמענים כדי לחקור את ההשפעות של אוכלוסיות תאי T רגולטורים על פנוטיפ מחלה. לעבוד עם מישהו שמכיר את הזרימה cytometry תחילה להגדיר את פרוטוקול FACS ולאחר מכן באמצעות פרוטוקול שבניסויים עתידיים. בנוסף, צעד שבו וריאציה משמעותית עשויה להשפיע על תוצאות בפרוטוקול זה הוא זריקת intraperitoneal של תאי T לעכברי נמען. כאן, התוך וההשתנות הבין-הנסיין יכולים להשפיע באופן משמעותי את תוצאות הניסוי. הוא הציע כי אדם ביצוע שלב זה הוא מרגיש בנוח עם עכברי טיפול ועם טכניקת ההזרקה כדי למזער שונות באיכות ובכמות של תאים הועברו adoptively. בנוסף, חשוב לשנות את המחטים בין עכברים, כטמטום מחט יכול להשפיע על היעילות שלהזרקת intraperitoneal.
צעדים של הפרוטוקול הדורשים אופטימיזציה כוללים סעיף 3: העשרה של תאי CD4 + T וסעיף 4: תיוג ותאי מיון. אופטימיזציה של ההעשרה של תאי CD4 + תלויה במערכת המגנטית המשמשת וצריכה לעקוב אחרי ההוראות של היצרנים. אפשרויות למערכות הפרדת תא מגנטי מפורטות בטבלה של חומרים כימיים / ציוד ספציפי. מומלץ להעשיר עבור CD4 + T תאים על ידי סלקציה שלילית, כמו סימון ישירות אוכלוסייה זו יכולה להשפיע על הפנוטיפ של התאים. יש הרבה שיבוטים נוגדן זמינים לתיוג תאים לFACS. ריכוז הנוגדן (שלב 4.4) צריך להיות מותאם על מנת להבטיח מכתים ספציפי ולהשיג הפרדה נאותה של אוכלוסיות תאי CD4 + T CD45RB במהלך FACS.
פיתוח של פרוטוקול זה עשוי לדרוש פתרון בעיות. , ההצלחה הראשונה של כל ניסויתלוי במיומנותו של החוקר ויגדל עם מיומנות משופרת בשיטות אלה. עם זאת, מספרים נמוכים באופן עקבי קבלת של תאי T להעברת מאמצת עלולים להיגרם על ידי לא שומר על תאים על קרח בבידוד, resuspending תאי centrifuged אגרסיווי מדי, או השימוש בsplenocytes מעכברים צעירים עם טחולים קטנים. בנוסף, לייעל את הריכוז של אנטי-CD4 ונוגדני תיוג אנטי-CD45RB למכתים להימנע מכתים תא לקוי או שאינו ספציפי (ראה לעיל). אם המקבלים לפתח דרגות שונות נרחבת של דלקת מעיים, הסיבה הסבירה ביותר היא טכניקת הזרקת intraperitoneal לא מדויקת. זה אמור לשפר עם תרגול ויכול להיות במעקב על ידי צביעת immunohistologic של CD3 + תאים במעיים של עכברי נמען. דברים נוספים שיש לשקול לכלול את המין של עכברי תורם ומקבל ווריאציות נורמליות בחדירת מחלה. כאשר עכברי נמען גבריים משמשים, או עכברי תורם זכר או נקבה הםppropriate. עם זאת, אם הם לשמש עכברי נמען נקבה, עכברי התורם חייבים להיות נקבה 5. בחוויות שלנו ושל אחרים, חדירה של מחלה במודל זה היא 85-90% 5. לפיכך צפוי כי חלק מעכברים לא יכולים לפתח דלקת במעיים, בהתחשב גורמים אחרים לשונות ניכרה בחומרת מחלה נפסלו. זכור יש שונות ניכרה בפנוטיפים בין מתקנים בתוך ארגון ומחוצה לו בכל קשורים לחיידקים במערכת העיכול עכבריים ושיטות עבודה המשפיעות על החיידקים 6,17. לפיכך, על חוסנו של פנוטיפ או קינטיקה של מחלה בRag1 - / - עכברי נמען עשויים להשתנות בהתאם נרחב על מיקומו של אדם. לכן, חשוב לקבוע את הפרמטרים הטובים ביותר לניסויים אלה בהתבסס על ציר הזמן והתוצאות שהתקבל מכל מתקן אדם.
כאן אנו מתארים את המתודולוגיה של עכברי ההעברה מסתגלת היטב מאופיינתמודל של מעי דק כרוני ודלקת מעי הגס דומה IBD אדם 5. פרוטוקול צעד-אחר-צעד זה ממחיש טכניקות מפתח לפיתוח המוצלח של שיטה זו למטרות מחקר. זהו מודל חיה שימושי במיוחד של IBD אדם, שכן היא מאפשרת לסנכרון של מחלה ומניפולציה של אוכלוסיות תאים שונות. עם זאת, עכברי נמען immunodeficient הם מהונדסים גנטיים לפתח ללא תאים חיסוניים אדפטיבית בוגרים, אשר צפוי להשפיע על תוצאות מחלה במורד הזרם. למרות זאת, בשיטה המתוארת כאן תהיה מאוד שימושית במחקרים עתידיים קביעת ההשפעה של חיידקי מעיים, תאי מערכת חיסון מולדים, ותאי רגולציה חיסוניים אדפטיבית בפתוגנזה של מחלת מעי דלקתי אנושית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי אמריקאי Gastroenterological Association (AGA) מחקר חוקרי פרס וקרוהן וקוליטיס קרן של אמריקה (CCFA) פיתוח קריירה פרס (לSZS), DK089692 F30 NIH NIDDK (לECS), ואוניברסיטת צפון מרכז קרוליינה לביולוגיה במערכת העיכול וDK34987 P30 מחלת גרנט (היסטולוגיה Core). מתקן UNC cytometry זרימת Core נתמך בחלקו על ידי NCI מרכז Core תמיכת גרנט (P30CA016086) למרכז לסרטן UNC Lineberger. אנו מודים ללוק B. Borst מState College אוניברסיטת צפון קרוליינה לרפואת וטרינרית על עזרתו עם ניתוח ואימונוהיסטוכימיה histopathological.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 10x PBS | Gibco | 14200075 | |
| 12 mm x 75 mm round-bottom tube | Falcon | 352052 | |
| 15 ml conical | Corning | 430790 | |
| 26 G x 3/8 Needle | BD Biosciences | 305110 | |
| 50 ml conical | Corning | 430828 | |
| 70 μm Cell Strainer | Fisherbrand | 22363548 | |
| BD IMagnet | BD Biosciences | 552311 | |
| β-mercaptoethanol | Thermo Scientific | 35602 | |
| CD4-FITC IgG2b | eBioscience | 11-0041 | |
| CD45RB-PE IgG2a | BD Pharminogen | 553101 | |
| Complete Media | RPMI-1640, 1% Pen/Strep, 10% FBS, 0.0004% β-ME | ||
| FACS tube + strainer | BD Falcon | 352235 | |
| Glass Microscope Slides | Fisherbrand | 12550A3 | |
| Heat-inactivated FBS | Gemini | 100-106 | |
| Labeling Buffer | 1x PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA | ||
| Lysis Buffer | 0.08% NH4Cl, 0.1% KHCO3, 1 mM EDTA | ||
| MoFlo XDP | Beckman Coulter | ||
| Mouse CD4 T lymphocyte Enrichment Set - DM | BD Biosciences | 558131 | |
| Mouse IgG2a-PE | BD Pharminogen | 553457 | |
| Mouse IgG2b-FITC | eBioscience | 11-4732 | |
| Pasteur pipet | Fisherbrand | 13-678-20D | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100X | Corning Cellgro | 30-002-CI |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri Dish | Fisherbrand | 875713 | |
| Pure Ethanol 200 Proof | Decon Labs | 2705-HC | |
| RPMI-1640 | Gibco | 11-875-093 | |
| Syringe | BD Biosciences | 309597 | |
| Trypan blue | Corning Cellgro | 25-900-CI | |
| Wash Media | RPMI-1640, 1% Pen/Strep, 0.0004% β-ME |
References
- Xavier, R. J., Podolsky, D. K. Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 448 (7152), 427-434 (2007).
- Cho, J. H., Brant, S. R. Recent insights into the genetics of inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 140 (6), 1704-1712 (2011).
- Jostins, L., et al. Host-microbe interactions have shaped the genetic architecture of inflammatory bowel disease. Nature. 491 (7422), 119-124 (2012).
- Powrie, F., Leach, M. W., Mauze, S., Caddle, L. B., Coffman, R. L. Phenotypically distinct subsets of CD4+ T cells induce or protect from chronic intestinal inflammation in C. B-17 scid mice. Int Immunol. 5 (11), 1461-1471 (1993).
- Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: concepts, considerations, and tricks of the trade. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296 (2), 135-146 (2009).
- Ma, B. W., et al. Routine habitat change: a source of unrecognized transient alteration of intestinal microbiota in laboratory mice. PLoS One. 7 (10), e47416 (2012).
- Read, S., Powrie, F. Induction of inflammatory bowel disease in immunodeficient mice by depletion of regulatory T cells. Curr Protoc Immunol. Chapter 15 (Unit 15 13), (1999).
- Maillard, M. H., et al. The Wiskott-Aldrich syndrome protein is required for the function of CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) regulatory T cells. J Exp Med. 204 (2), 381-391 (2007).
- Hegazi, R. A., et al. Carbon monoxide ameliorates chronic murine colitis through a heme oxygenase 1-dependent pathway. J Exp Med. 202 (12), 1703-1713 (2005).
- Kole, A., et al. Type I IFNs regulate effector and regulatory T cell accumulation and anti-inflammatory cytokine production during T cell-mediated colitis. J Immunol. 191 (5), 2771-2779 (2013).
- Kobayashi, T., et al. NFIL3-deficient mice develop microbiota-dependent, IL-12/23-driven spontaneous colitis. J Immunol. 192 (4), 1918-1927 (2014).
- Steinbach, E. C., et al. Innate PI3K p110delta Regulates Th1/Th17 Development and Microbiota-Dependent Colitis. J Immunol. 192 (8), 3958-3968 (2014).
- Kobayashi, T., et al. NFIL3 is a regulator of IL-12 p40 in macrophages and mucosal immunity. J Immunol. 186 (8), 4649-4655 (2011).
- Leach, M. W., Bean, A. G., Mauze, S., Coffman, R. L., Powrie, F. Inflammatory bowel disease in C.B-17 scid mice reconstituted with the CD45RBhigh subset of CD4+ T cells. Am J Pathol. 148 (5), 1503-1515 (1996).
- Powrie, F., et al. Inhibition of Th1 responses prevents inflammatory bowel disease in scid mice reconstituted with CD45RBhi CD4. T cells. Immunity. 1 (7), 553-562 (1994).
- Read, S., Malmstrom, V., Powrie, F. Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 plays an essential role in the function of CD25(+)CD4(+) regulatory cells that control intestinal inflammation. J Exp Med. 192 (2), 295-302 (2000).
- Rogers, G. B., et al. Functional divergence in gastrointestinal microbiota in physically-separated genetically identical mice. Sci Rep. 4, 5437 (2014).
- Fukata, M., et al. The myeloid differentiation factor 88 (MyD88) is required for CD4+ T cell effector function in a murine model of inflammatory bowel disease. J Immunol. 180 (3), 1886-1894 (2008).
- Kurtz, C. C., et al. Extracellular adenosine regulates colitis through effects on lymphoid and nonlymphoid cells. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 307 (3), 338-346 (2014).
- Naganuma, M., et al. Cutting edge: Critical role for A2A adenosine receptors in the T cell-mediated regulation of colitis. J Immunol. 177 (5), 2765-2769 (2006).
- Ranatunga, D. C., et al. A protective role for human IL-10-expressing CD4+ T cells in colitis. J Immunol. 189 (3), 1243-1252 (2012).
- Srikrishna, G., et al. Carboxylated glycans mediate colitis through activation of NF-kappa. B. J Immunol. 175 (8), 5412-5422 (2005).
- Wang, F., et al. IFN-gamma-induced TNFR2 expression is required for TNF-dependent intestinal epithelial barrier dysfunction. Gastroenterology. 131 (4), 1153-1163 (2006).
