Summary
Dupuytrens sygdom (DD) er en fibroproliferativ sygdom i håndfladen. Her præsenterer vi en protokol til kultur resektion prøver fra DD i en tredimensional (3D) dyrkningssystem. Sådanne kortsigtede kultur system tillader bevarelse af 3D-struktur og molekylære egenskaber af fibrøst væv.
Introduction
Dupuytrens sygdom (DD), en godartet fiberproliferativ sygdom forårsager permanent bøjning af fingrene som følge af dannelsen af knuder og ledninger i håndfladen. Selvom sygdomsspredning er særlig høj blandt kaukasiere i Nordeuropa, det underliggende genetiske ætiologi af sygdommen er stadig ukendt 1. Den vigtigste egenskab ved DD er overskydende produktion af ekstracellulær matrix (ECM) proteiner (fx collagen), som danner en hård fibrøst væv optager rummet mellem sener og hud håndfladen og fingrene, permanent forstyrre de fine bevægelser af hånden 2, 3. Den gentagelse af sygdommen tyder underliggende genetiske ændringer som årsag til fibrose 1, 4. En effektiv behandling kunne være at målrette direkte de ukontrollable fibrotiske mekanismer på det cellulære og molekylære niveau.
Vores seneste arbejde på fibrose har ført os til at udvikle etroman 3D kultur system, der tillader kortsigtet kultur af human fibrøst væv med potentiale narkotika testning. Dette system har været med til at overvinde den begrænsende tilgang af 2D fibroblastkulturer og definere en rolle for den delvise nedreguleringen, opnået ved exon skipping, af TGF-vejen aktivering i mediering fibrose 5.
Vi har udviklet en metode til dyrkning ex vivo human resektion prøver fra DD patienter at studere interaktionen mellem myofibroblaster og den omgivende ECM 5, 6. Studiet af DD bindevæv fibrose samt andre fibrotiske sygdomme beror på histopatologisk analyse af det udskårne kirurgiske prøver, isolering af fibroblaster fra vævet og etablering af primære kulturer eller cellesortering procedurer. Disse metoder er ret statisk, da de ikke tillader eksogen manipulation af ejendomme sygdommen eller terapeutisk intervention ved forsøgslederen. Derudover kan primære cell kulturer en tendens til at tilpasse sig de dyrkningsbetingelser og deres genekspression egenskaber hovedsageligt fra in vivo situationen adskiller sig på hver passage, selv under tidlige passager (blandt passage 3 og 6) 7, 8. Det er lykkedes at fastholde affaldet kirurgisk materiale i ex vivo dyrkningsbetingelser i et tidsrum, der tillader undersøgelse af patient-specifikke egenskaber og screening af anti-fibrotiske eller antiinflammatoriske lægemiddelstoffer.
Systemet er baseret på en nitrocellulosemembran som tillader kontakt af vævet med mediet, men ikke med plast, således at forhindre ændring af vævet ved fastgørelse, som tidligere observeret, når dyrkning DD fibroblaster samt andre celletyper 9. Nr kollagen gel eller andre ECM proteinsubstrat er påkrævet, da DD væv selv producerer store mængder af disse proteiner. Dette er fordelagtigt for vedligeholdelse af native ECM mikromiljø og omsætningen since matrixsubstrater er vigtig regulator af væv arkitektur og funktion 10, 11. For eksempel ECM-proteiner, såsom fibronectin, laminin og kollagen, kan påvirke forreste-bageste polaritet af fibroblaster som tilsvarende vist for apikal-basal polaritet i epitelceller 12, 13 . polariserede celler har asymmetrisk fordeling af ekstracellulære molekyler, som bestemmer cellevandring og genekspression, f.eks α1β1 integrin tilgængelighed på membranen påvirker celleadhæsion til type I collagen 14. Da et primært mål for denne 3D-model var at bevare den indfødte mikromiljø, blev der ikke kunstig ECM matrix anvendte substrat.
Kort: resektion prøver lige skåret i et sterilt miljø og anbringes på nitrocellular membraner. Hvis behandling administreres via injektion er påkrævet væv injiceres, efter at de er blevet placeret på membranen. Hvis behandlingen ikke kræver at administreres via injfdeling derefter forbindelsen tilsættes til dyrkningsmediet (Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM), med 1% føtalt kalveserum (FCS), 1% penicillin-streptomycin (P / S)). Kulturerne opretholdes højst ti dage, hvorefter vævet fikseret i 4% paraformaldehyd (PFA), behandles gennem 30% saccharoseopløsning, indlejret i OCT-forbindelse og opbevaret ved -80 ° C, som tidligere beskrevet 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol følger LUMC og AMC retningslinjer for menneskelig videnskabsetisk komité.
1. kirurgiske indgreb og Tissue Collection
Bemærk: Selv om forskellige teknikker til kirurgisk excision af Kuskefingre findes, den nuværende guldstandarden er den delvise fasciectomy 15. De fleste patienter behandles i dag-klinik.
- Udføre kirurgi under generel eller regional anæstesi efter patientens og anæstesilægen præferencer og patientens co-morbiditet. Disse overvejelser er uden for rammerne af dette papir. Før indsnit røre huden med en skarp genstand til at kontrollere, at anæstesi er tilfredsstillende. Brug en årepresse for at lette kirurgisk visualisering i et blodløst felt.
- Efter steril Prepping og draperinger, afmærke den forventede snit med en pen. Incise huden med en skalpel under lup forstørrelse enten på langs or ved hjælp af zig snit til at forhindre yderligere kontrakturer og også for at give mulighed for tilstrækkelig eksponering.
- Ved hjælp af saks dissektion, befri huden og subkutane lag fra de underliggende kontrakt fascia palmaris. Identificere og beskytte nerveforgrening af fingeren, fordi den syge ledningen kan fortrænge det mod midterlinjen. Når fibrøst væv (knude og / eller ledning) er skitseret, udskære det skarpt og regionalt (subtotal) med en skalpel. Udfør omhyggelig hæmostase under tourniquet kontrol ved afslutningen af proceduren for at forhindre hæmatomdannelse.
- For at lukke huden, bruge ekstra Z-plasties til at opnå delvis forlængelse af huden.
- Til disse undersøgelser kun bruge knuden del af den fibrotiske ledning, den mest aktive og cellulær del af sygdommen. Har kirurgen udføre makroskopiske identifikation. De isolerede knuder i håndfladen er ofte forstadier eller en snor, men er næsten aldrig reseceret, da de normalt ikke forårsage symptomer.Dem vi resektion var de knuder, der var en del af en snor af kontraheret finger. Identificere disse knuder af den hårde tykke del af ledninger i handpalm (figur 1A).
- Når kirurgen fjerner vævet, straks overføre det ved hjælp af steril pincet til et 50 ml rør indeholdende DMEM-medium suppleret med 10% FCS og 1% (P / S). Hold væv til maksimalt 2 timer i dette medium på en kasse af våd is (4 ° C) (f.eks transport af vævet fra driften rum til cellekulturen facilitet).
- Hold prøverne på våd is (4 ° C), mens forberedelserne til det næste trin. Forberedelse af materialer og celledyrkningskamret kræver 10-20 min.
2. Fremstilling af instrumenter, dyrkningsmedium og kultur Indsætter
Bemærk: Alle procedurer udføres ved stuetemperatur, medmindre andet specifikt er angivet.
- Forbered 500 ml DMEM suppleret med 10% FCS og 1% (P / S) og filter sterilize. Forvarm mediet ved 37 ° C.
- Autoklave pincet, et par krumme-bladet Mayo saks (150-170 mm i længden) og et par Metzenbaum saks og opbevares i en steril beholder.
- Under laminar strømning, åbne en steril 12-brønds kultur plade. Placer en kultur insert (0,45 um porestørrelse, diameter 12 mm) i hver brønd af 12-brønds plade (figur 1B, nederste panel).
- Fyld 12-brønds plade med 600 ul forvarmet (37 ° C) dyrkningsmedier ved pipettering på godt og ikke direkte på membranen af indsatsen. Pladen anbringes i inkubatoren (37 ° C, 5% CO 2) (figur 1B, øvre panel).
- Alternativt bruge en plade med 24 brønde, og der tilsættes 300 pi medium per brønd. Mængden af medium per brønd er optimal, når en menisk lag dannes mellem væsken og den nedre del af membranen indsatsen.
Bemærk: medium i bunden af brønden diffunderer gennem nitrocellulose MembrAne danner menisken lag som afbildet i skema i figur 1B (nederste panel).
- Alternativt bruge en plade med 24 brønde, og der tilsættes 300 pi medium per brønd. Mængden af medium per brønd er optimal, når en menisk lag dannes mellem væsken og den nedre del af membranen indsatsen.
3. Tissue Forberedelse og ex vivo Tissue Culture Setup
Bemærk: Alle procedurer udføres ved stuetemperatur, medmindre andet specifikt er angivet.
- Overfør knuden del af ledningen fra 50 ml rør på en 100 mm petriskål og tilsættes 10 ml forvarmet (37 ° C) medium. Sikre, at vævet er i kontakt med væsken under hele proceduren.
- Fjern perinodular fedtlag hjælp af Metzenbaum saks. Kassér fedtvæv. Med brugen af pincet og de krumme-bladet saks, skåret på tværs vævet i mindre stykker (maksimal tykkelse på 200 um).
- Overfør 12-brønds plade fra inkubatoren i laminar hood. Kontroller, at membranen af indsatsen er blevet transparent (våd), og derfor er i kontakt med mediet.
- Brug pincetforsigtigt løfte et væv del ved at røre det ydre lag (gælder ikke spænding på væv). Placer en vævsdel på membranen af celledyrkningsinsert således at vævet forbliver i luft-medium interfasen. Kultur maksimalt to vævsdele på samme insert / godt.
- Sørg for, at vævet er placeret fladt på membranen, i langsgående kontakt med mediet, således at vævet ikke flyder ud membranen eller er helt omfattet af medium. Undgå luftbobler.
Bemærk: På dette tidspunkt er det muligt at tilføje vækstfaktorer eller inhibitorer af interesse for medierne; for eksempel testforbindelser (A, B, C, D, E) i replikater og / eller koncentration kurve. Medtag mindst 2 kontrol (ubehandlede) stykker af væv under normale vækstbetingelser for at sikre, at forsøget er blevet indstillet korrekt. Inkuberes væv i 3-7 dage i en vævskultur-inkubator. - Inficere væv med enten lentiviral eller adenovirale konstruktion, hvis overekspression eller vælte experiments af et gen af interesse skal udføres (figur 2). Overfør en vævsdel fra 12-brønds plade til en 35 mm skål ved hjælp af pincet.
- Brug en maksimal volumen på 10 pi høj titer virus.
- Udfør injektion under et dissektionsmikroskop med en insulinsprøjte fyldt med 50 pi PBS indeholdende 10 pi af den valgte virus. Placer nålen vinkelret på midten af vævet.
- Injicer langsomt indholdet af sprøjten. Du må ikke trække nålen direkte. Når punktere vævet, ikke lade nålen går gennem den anden side, men fastholde nålen i vævet selv (omkring midten af væv).
- Overfør vævet tilbage i 12-brønds plade, lukke dyrkningsplade og placere det i inkubatoren (37 ° C, 5% CO 2).
4. Hele-mount immunfluorescensfarvning og 3D-rekonstruktion
Bemærk: Alle proprocedurer udføres ved stuetemperatur, medmindre andet specifikt er angivet. Protokollen for hele mount immunfarvning og billedbehandling beskrevet nedenfor er en tilpasning af tidligere rapporterede metoder til andre væv 16-19. Puffere og materialer er beskrevet i tabel 1 og Materials List.
- Overfør væv fra kulturen pladen til 2 ml mikrocentrifugerør indeholdende PBS. Wash 2x for 5 min i PBS-opløsning på en roterende platform. Fix væv i 4% bufret PFA (1,5 ml opløsning pr væv i 2 ml mikrocentrifugerør), O / N ved 4 ° C på en roterende platform.
- Fjern PFA og vaskes 3x i PBS i 5 minutter hver.
- Dehydrer væv ved nedsænkning i en 25% methanol-opløsning i 2 timer ved stuetemperatur på en roterende platform. Forøg methanol procentdel gradvist (50%, 75%, 100%) med vævene nedsænket i hver opløsning i 2 timer ved stuetemperatur på en roterende platform.
- Overfør væv i DMSO / methanol-opløsning (permeabilisering trin) i 3 uger ved 4 ° C,som tidligere beskrevet 18.
Bemærk: På dette stadium kan væv opbevares langsigtet i 100% methanol ved -20 ° C. - Fortsæt med farvning procedure 16, 17; gradvist rehydrere væv (75% -50% -25% -0% methanol-udgaven). Udfør hver rehydratiseringstrinnet i 2 timer ved stuetemperatur eller O / N ved 4 ° C under konstant omrøring.
- Inkuber prøver med primære antistoffer i PBS indeholdende 1% bovint serumalbumin (BSA) og 20% DMSO O / N ved 4 ° C. Brug antistoffer ved følgende forhold ved hjælp af kommercielle lagre i PBS: anti-α glatmuskelactin (1: 500, mus), anti-collagen type I (1: 500, ged), anti-collagen type III (1: 500, ged).
- Vask udførligt i PBS i 48 timer ved 4 ° C (ændringen PBS-opløsning 3 til 4 gange).
- Fortyndes passende sekundære antistoffer (Alexa 555 anti-mus, Alexa 488 anti-goat) ved 1: 250 fortynding i PBS indeholdende 1% (BSA) og 20% DMSO. Inkuber O / N ved 4 ° C.
- Vask udførligt i PBS i 48 timer ved 476; C og inkuberes med nuklear kontrastfarve, TO-PRO-3 fortyndet 1: 500 i PBS ved det endelige vasketrin.
Bemærk: TO-PRO-3 er en langt rødt udsender DNA farvestof (med en He-Ne 633 nm laser linje) og kombineres til samtidig billeddannelse med andre kanaler; i dette tilfælde collagen type I / collagen type III (488 nm), α glatmuskelactin (555 nm), TO-PRO-3 (647 nm). - Overfør væv til en methanol-serien (25% -50% -75%) til langsomt dehydrere væv; udføre hver dehydrering trin i 2 timer ved stuetemperatur eller O / N ved 4 ° C under konstant omrøring.
- Overfør væv i polypropylen rør. Klare væv i methylsalicylat (håndtag under kemisk hætte) 18 eller som et alternativ anvendelse Babb løsning 19. Inkuber ved stuetemperatur under konstant omrøring, indtil vævet bliver gennemsigtig. Mount mellem et dias og et dækglas forseglet med hård sæt montering medium (figur 1C, øvre panel).
- Billede prøverne på en omvendt konfokal microomfang udstyret med høj NA 63X og / eller 100X olie nedsænkning mål (Figur 1C).
- Rengør objektivet med rengøring løsning, som mikroskopet producenten.
- Påfør en dråbe olie på objektivlinsen. Placer dias med modellen på mikroskop scenen og fokus på prøven.
- Sæt konfigurationerne på mikroskopet til samtidig billeddannelse af tre-kanals fluorescens med laserlinjer 488 nm, 514 nm og 633 nm.
- Anskaf single XY billeder eller flere fokalplan billeder (Z stack) (figur 3A). Brug øget bredde af Z stak til udførelse 3D-rekonstruktion. For at opnå et billede i høj opløsning anvender lav scanningshastighed, antal gennemsnitlige scanninger (≥ 3) og erhverve 16-bit-billeder af 1.024 x 1.024 pixel opløsning.
- Analyser Z stack erhvervede billeder: først omdøbe og gemme billedfil (xyz). Brug af softwaren program konfokalt mikroskop, konfigurere en maksimal intensitet PROJEktion af Z stak billeder i en 3D rekonstruerede billede.
- Vælg xyz-fil, i "Process Funktioner", klik under "Visualisering" og "3D-projektion". Enter "Maksimum" i fremgangsmåden fremspring (eller "Gennemsnit", hvis det fluorescerende signal er mættet). For en enkelt fremspring ikke ændrer X, Y og Z fly, og anvende fremspringet værktøjet (figur 3B, r1).
- Brug Z stak billeder for at skabe en 3D-projektion med animation (konfokal software) til visning formål. Vælg xyz-fil, i processen Funktioner, klik under "Visualisering" og "3D-projektion".
- Klik på "Opret film". Indtast Start Rotation vinkel i grader (fx 0 ° som udgangspunkt i filmen, Y-akse), og klik på "Set Start". Indtast End Rotation i grader (Y-aksen) som slutpunkt af filmen (fx 180 ° eller 3606; for en komplet rotation) og klik på "Set End".
- Vælg "Maksimum" som en metode til fremspring (eller "Gennemsnit", hvis det fluorescerende signal er mættet). Indtast "Antal Frames" til rotation af 3D-rekonstruktion (f.eks 20 rotationer eller højere for at nedsætte hastigheden på rotation). Klik på "Anvend". Eksporter filmen som visuelle fil (fx "avi") (Supplerende Movie 1) eller eksport som "tiff" fil, som skaber en billedfil for hver rotation vinkel (figur 3B, rotation r4, R10, R18).
5. Kombineret anden harmoniske Generation (Collagen) og to-foton Spændt fluorescens (Elastin) Imaging på Ex Vivo væv under Kultur
Bemærk: Alle procedurer udføres ved stuetemperatur, medmindre andet specifikt er angivet.
- Fjern Transwell plader fra inkubatoren og læg en enkelt (ufikseret) tissue del i en 35 mm cellekultur-plade indeholdende 500 pi medium.
- Placer væv, således at den lange akse er fladt på pladen. Hold væv våd hele tiden dog ikke flydende.
- Placer vand nedsænket mål for multifoton mikroskop direkte i kontakt med vævet (figur 1C).
- Opnå billeder med en excitationsbølgelængde på 800 nm og indsamle udsendte lys mellem 371-425 nm (SHG, collagen) og 474-532 nm (autofluorescens, elastin) (figur 3C). Udføre to-foton mikroskopi i en opretstående konfokalt mikroskop udstyret med en femtosekundlaser anvendelse af en 20X / 1.0 NA vand immersionsobjektivet. Proces konfokal stakke med producentens software.
Bemærk: Excitation med en nær-infrarød laser kollagenmolekyler skaber høj kontrast billeddannelse af native collagen strukturer i forskellige dybder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fremgangsmåden til ex vivo 3D kultur af bindevæv er en let og robust sæt op for at forstå relationen mellem ECM og andre cellebestanddele udgør DD væv og potentielt andre typer af fibrose samt. Desuden dette system gør det muligt for en pålidelig metode til at teste virkningen af forbindelser på forskellige celletyper og deres indvirkning på fibrotiske belastning 20.
Trinene fra indsamling af kirurgisk affaldsmateriale stammer fra Dupuytrens fibrose, er samlingen af kulturen kammeret og eksempler på analyseværktøjer præsenteret i figur 1. Som illustreret i figur 1, tilvejebringer denne fremgangsmåde en eksperimentel værktøj til store skærme narkotika skærme, f.eks antifibrotiske lægemiddelforbindelser samt undersøgelse af ECM modellering i realtid og reproducerbar måde. Nodulær dele af den fibrotiske ledningen er lige skiver og anbringes i Transwell-plader; hvert væv side (100-200 um) er dyrket på toppen af membranen i en kultur insert (0,45 um porestørrelse, diameter 12 mm). Culture medium tilsættes nederst kammer, så kontakt med vævet gennem membranen. I gennemsnit 30-40 vævsdele kan afledes fra en enkelt resektion prøve, som giver store screening af lægemidler; forbindelser, små molekyler eller vækstfaktorer. Eksperimenter rettet koncentrationen og / eller tidsafhængige effekt af lægemidler er mulige.
Som vist i figur 2, kan genekspression manipuleres (overekspression / knock down) ved anvendelse af adeno / lentivirus injiceres direkte ind i vævet. Fluorescerende mærkede viral transduktion udføres i friske tykke vævsprøver ved injektion. Væv forbliver i kultur i 24-48 timer efter injektion, og efterfølgende fast, indlejrede og snit i 0,7 um kryosektioner. Endvidere at analysere virkningen af forskellige forbindelser eller dyrkningsbetingelser vævsdelens er faste og underkastes hele mount immunfluorescens som vist i figur 3. 3D billeddannelse af tykke væv sker ved konfokal mikroskopi (figur 3A-B). En anden metode er den levende 3D imaging om væv opretholdt i kultur; endogene collagen remodeling studeres realtid i frisk dissekeret, ikke-fikseret væv mv, anden harmonisk generation (SHG) (figur 3C). Virkningen af potentielle anti-fibrotiske lægemidler også fulgt i dele af det samme væv på forskellige tidspunkter. Kollagen strukturer tykt væv afbildes ved hjælp af SHG i en opretstående multiphoton mikroskop. Under billedbehandling, er vævsprøver placeret i medium og afbildes med et vand-immersionsobjektiv. Efter billeddannelse, kan vævene føres tilbage til dyrkningssystemet. Effekter kan studeres på niveau med cellulære og ekstracellulære miljø giver en fordel i forhold til in vitro cellebaserede assays. Der er flere muligheder for Analysis af biologiske virkninger, såsom histologi af faste vævssnit, hele mount immunofluorescens og 3D rekonstruktion billeddannelse ved konfokal mikroskopi, SHG og to-foton exciteret fluorescens billeddannelse af endogent collagen og elastin. Nogle af fordelene af SHG billeddannelse er anvendelse af friske, ikke-fikseret væv, der ikke antistoffarvning forberedelse er nødvendig, og at det samme væv kan afbildes flere gange (tidsforløb under dyrkningsbetingelser). SHG og to-foton ophidset fluorescens billeddannelse er tidligere blevet beskrevet for muskel og bindevæv 21-23 og ufarvet arterievæggen struktur 24 imidlertid her vi rapporterer en alternativ ansøgning om studiet af Dupuytrens fibrose.
Figur 1. Arrangement med ex vivo 3D vævskultur system. (A) DD permanent fleksion kontraktur i hånden af en patient før kirurgisk fjernelse. Dette tal er blevet ændret fra tidligere undersøgelse 5. (B) Eksempel på ex vivo kultur sat op. (C) Eksempler på eksperimentelle tilgange, der kan anvendes til analyse af ECM deposition. Klik her for at se en større udgave af figuren.
Figur 2. Proof-of-principle ex vivo viral-medieret genekspression graduering i hele mount væv. (A) Kerner visualiseret med TO-PRO-3 farvestof (blå). Bars 75 um. (B) Direkte visualisering af fluorescerendefarvestof DsRed (rød), post-injektion med adenovirus, der udtrykker-DsRed. Barer 75 um. (C) flettede billede (kernefarvning i blå, dsRed i rødt). Cytoplasmatisk lokalisering af DsRed indikerer adenoviral levering i cellerne inden 24 timer. Bars 75 um. (DF) Lentiviral transduktion. (D) Kerner visualiseret med TO-PRO-3 farvestof (blå). Barer 25 um. (E) direkte visualisering af GFP i vævssnit (grøn), efter injektion med Lenti-GFP partikler. Barer 25 um. (F) flettede billede af D og E, der angiver intracellulær lokalisering af Lenti-GFP. Barer 25 pm (GH) Eksempel på lentivirus-medieret knockdown mod gen af interesse (betegnet som "A"). (G) Lentivirus bærer scrambled shRNA sekvensblev injiceret ex vivo ind i vævet. Immunfluorescensfarvning for protein af interesse (betegnet som "A"), der er vist i rødt. Bars 75 um. (H) Lentivirus bærer genet A-shRNA sekvens blev injiceret ex vivo ind i vævet. Immunofluorescens-farvning for protein "A". Kerner farves med TO-PRO-3 farvestof. Barer 75 um. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3. 3D rekonstruktion billeddannelse, anden harmoniske generation og to-foton exciteret fluorescens billeddannelse. (A) 3D imaging ved konfokal mikroskopi. Single (XY) billeder i fokusplaner langs forskellige væv dybder (z = 50-200 um). Hele mount IMMUnofluorescence farvning; myofibroblastlignende markør α-glatmuskelactin (αSMA, rød), kernefarvning (TO-PRO-3, blå). Barer:. 500 um (B) 3D rekonstruerede billede (Z stak 389 um) af rå billeder som angivet i panel A ved forskellige 3D rotationer angivet som "r1", "r4", "R10", "R18". Barer 500 um. (C) Endogen kollagenindhold modellering af anden harmoniske generation (SHG) billeddannelse i friske, tykke væv dele (venstre panel, grøn). To-foton exciteret fluorescens (TPF) af elastin strukturer ECM blev fanget af multifoton mikroskopi (midterste panel, rød). Sammenflettede billede af collagen (grøn) og elastin (rød) (højre panel). Barer:. 100 um Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Supplerende Movie 1. repræsentant 3D rekonstruktion film af Dupuytrens hele mount væv Konfokal billeddannelse af DD væv blev udført efter syv-dages ex vivo dyrkning og forarbejdning til hele mount immunfluorescensfarvning.; myofibroblastlignende markør α-glatmuskelactin (αSMA, rød), kernefarvning (TO-PRO-3, blå). Scale bar = 500 um. Rammer = 20. Z = 389 um. Klik her for at se denne video.
| PBS (phosphatpufret saltvand) | 8,00 g NaCl (0,137 M) 0,20 g KCl (2,7 mM) 0,20 g KH 2 PO 4 (1,1 mM) 0,10 g MgCl2 · 6H 2 O (0,5 mM) 2,16 g Na 2 HPO 4 · 7H 2 O (8,1 mM) 0,10 g vandfrit CaCl2 (0,9 mM) H 2 O til 1 L |
| 4 g paraformaldehyd opløses i en kolbe indeholdende 100 ml phosphatbufret saltvand (PBS) i stinkskab, dække kolben. Anbring kolben på en varme / omrøring blok og forsigtigt omrøre opløsningen. Overvåg temperaturen så er når et maksimum 65 ° C. Undgå overophedning. Når paraformaldehyd er opløst, og opløsningen synes klar, slukke for varmen, men lad det røre. Rør ikke af sikkerhedsmæssige årsager. Tillad afkøling. Når afkølet, aliquot opløsningen og gemme langsigtet -20 ° C fryser eller i en 4 ° C køleskab for maksimal ugen. | |
| BSA (bovint serumalbumin), 10% (w / v) | Opløs 10 g BSA i 100 ml H 2 O. Filtersteriliser ved anvendelse af en lav proteinbinding 0,22 um filter. Opbevares ved 4 ° C. |
| DMSO / methanol (20%) permeabilisering opløsning | Bland dimethylsulfoxid medMethanol (1: 4 analogier, samlet volumen 100 ml). |
Tabel 1. Bufferoploesninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mest kritiske trin i dyrkning ex vivo humane bindevæv er den umiddelbare anvendelse af vævet efter kirurgisk fjernelse for at sikre levedygtighed vævet bør forblive i medium eller saltvandsopløsning på alle tidspunkter; opretholde en steril kultur; tværsnit af væv skal have maksimalt 200 um tykkelse; opsætning af ex vivo kultur system er optimal, når vævet er i kontakt med mediet, men ikke fuldt neddykket. Medium bør tilføjes kun på ydersiden kammer transwell i et lille volumen (f.eks 500-600 pi per 12-brønds plade overfladeareal).
Bindevæv er afledt af Dupuytrens er viklet ind i en hård struktur med højt indhold af ECM-proteiner, såsom collagen, proteoglycaner og elastin; på grund af disse egenskaber, og derudover på grund af myofibroblastdifferentiering kontraktur det kan være en udfordring at skære gennem vævet. Det er vigtigt at anvende passende kirurgiske redskaber; buet blbelastes Mayo saks til udskæring af større dele i samme tykkelse og mindre kirurgiske sakse til skæring mindre vævsdele (f.eks hvis flere væv dele er nødvendige brug plader med 24 brønde).
Metoder til undersøgelse af DD er histopatologiske analyser af det udskårne fibrotiske prøve eller afledning af primære fibroblaster. Celleafledningsstedet fra patienten materiale er gjort, er to måder; i en af de metoder, vævsdele dyrkes i plast dyrkningsplader til et antal uger, indtil der er udvækst af fibroblaster. Den anden metode er enzymatisk behandling af væv med collagenase og trypsin. Den første metode er tidskrævende, er fibroblast egenskaber ændres som følge af dyrkningsbetingelser, og der er passage-afhængig variabilitet blandt passager i den samme cellelinje. Den enzymatiske fremgangsmåde er hurtigere og det kan anvendes til cellesortering assays imidlertid in vitro opretholdelse af disse celler ud af medfødte ECM ikke afspejler in vivo 25 (nemlig mechanoregulation og mechanotransduction). Tab af spænding resulterer i adskillelse af αSMA fibre i MFBs i kort tid 26. Den overflod af αSMA i ex vivo 27, 28. Med hensyn til teknisk og biologisk variabilitet vores metode er reproducerbar (levedygtighed ECM netværk) og mindre tilbøjelige til vævsændring følge af den korte tid af kulturen. For eksempel fremgangsmåden fibroblast udvækst kræver flere uger, hvilket kan forårsage biokemiske ændringer (f.eks akkumulering af genetiske mutationer, replikativ senescens). Men patientspecifikke genetiske karakteristika og biologisk variation er per se udfordringer i DD forskningsfelt og ikke kan løses med de nuværende metoder.
Som det fremgår af denne protokol, fibrotiske DD prøver efter kirurgisk fjernelse er direkte dyrket i ex vivo 3D-system og / eller hurtigt nedfrosset. Afhængigt af videnskabelige spørgsmål modifikation af væv er mulig ved tilsætning af vækstfaktorer, kemiske forbindelser, VIrus-medieret genlevering, antisense-oligonukleotider og miRNA. Forbindelser kan leveres i medierne eller med lokale mikroinjektioner i vævet i 3D kultur kammeret. Efter 3 og op til 7 dages dyrkning vævet kan enten homogeniseret i celleisolering og FACS-analyse eller isolering af total RNA og proteiner til ekspression profil analyse samt forarbejdet til histologisk analyse. Udtrykket status fibrøse proteiner (αSMA, collagen type I og II, fibronectin), væv arkitektur knuden del af ledningen og sammenhængen i det fibrøse netværk vurderes før og efter behandlingerne. For at overvåge ECM omlejringer under dyrkningen kombinerede vi SHG (collagen), og to-foton exciteret fluorescens (elastin) billeddannelse.
De ekstracellulære rearrangementer kan derefter kvantificeres eller modelleret ved brug billede kvantificering software. Disse parametre giver en indikation af virkningen af stoffet på fibrose eller Molecgelmæssige ændringer, der er blevet induceret i kulturen. Endvidere ECM arrays kan også udføres på enkelte skiver til at generere et bedre overblik over de virkninger. Samlet har vi etableret et robust system, der tillader undersøgelse af fibrose ex vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har indgivet en patentansøgning for Dupuytrens sygdom: 3D orgel kultur. # GB1307200. Kommerciel licens og servicekontrakter er tilgængelige.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 11965-084 | |
| fetal calf serum (FCS) | Gibco | high glucose, heat inactivated | |
| penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Cell culture inserts | Millicell | PIHA01250 | 0.45 μm pore size, 12 mm diameter |
| anti-collagen type I | Southern Biotech | 1310-08 | |
| anti-α smooth muscle actin | Sigma | A2547 | |
| anti-collagen type III | Southern Biotech | 1330-01 | |
| Alexa Fluor555 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A-31570 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody | Invitrogen | A-11055 | |
| TOPRO-3 | Invitrogen | T3605 | |
| methylsalicylate | Sigma | M6752 | |
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Tissue Tek OCT | Sakura | 25608-930 | |
| Microsccope glass coverslips | Menzel-Glaser | BB024060A1 | 24 x 60 mm |
| Microscope SuperFrost slides | Menzel-Glaser | AA00000102E | 76 x 26 mm |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium | Vector laboratories | H-1400 | |
| Leica TCS SP5 II confocal microscope | Leica Microsystems | Argon-488, 514 nm and HeNe-633 nm laser lines | |
| Zeiss 710 NLO upright confocal microscope | Jena, Germany | Equipped with femtosecond Spectra - Physics Deep See MP laser (Santa Clara, United States) using a Plan-Apochromat 20X/1.0 NA water-immersion objective. |
References
- Shih, B., Bayat, A. Scientific understanding and clinical management of Dupuytren disease. Nat Rev Rheumatol. 6 (12), 715-726 (2010).
- Bisson, M. A., McGrouther, D. A., Mudera, V., Grobbelaar, A. O. The different characteristics of Dupuytren's disease fibroblasts derived from either nodule or cord: expression of α-smooth muscle actin and the response to stimulation by TGF-β1. The Journal of Hand Surgery. 28 (4), 351-356 (2003).
- Brickley-Parsons, D., Glimcher, M. J., Smith, R. J., Albin, R., Adams, J. P. Biochemical changes in the collagen of the palmar fascia in patients with Dupuytren's disease. The Journal of Bone & Joint Surgery. 63 (5), 787-797 (1981).
- Berndt, A., Kosmehl, H., Katenkamp, D., Tauchmann, V. Appearance of the myofibroblastic phenotype in Dupuytren's disease is associated with a fibronectin, laminin, collagen type IV and tenascin extracellular matrix. Pathobiology. 62 (2), 55-58 (1994).
- Karkampouna, S., et al. Novel ex vivo culture method for the study of Dupuytren's disease: effects of TGFβ type 1 receptor modulation by antisense oligonucleotides. Mol Ther Nucleic Acids. 3, e142 (2014).
- Kruithof-de Julio, M., et al. Canonical Wnt signaling regulates Nkx3.1 expression and luminal epithelial differentiation during prostate organogenesis. Developmental Dynamics. 242 (10), 1160-1171 (2013).
- Krause, C., Kloen, P., ten Dijke, P. Elevated transforming growth factor β and mitogen-activated protein kinase pathways mediate fibrotic traits of Dupuytren's disease fibroblasts. Fibrogenesis & Tissue Repair. 4 (1), 14 (2011).
- Gorman, D. B., Wu, Y., Seney, S., Zhu, R. D., Gan, B. S. Wnt expression is not correlated with beta-catenin dysregulation in Dupuytren's Disease. J Negat Results Biomed. 5, 13 (2006).
- Streuli, C. H., Schmidhauser, C., Kobrin, M., Bissell, M. J., Derynck, R. Extracellular matrix regulates expression of the TGF-beta 1 gene. The Journal of Cell Biology. 120 (1), 253-260 (1993).
- Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (4), 265-275 (2006).
- Gottrup, F., Ågren, M. S., Karlsmark, T. Models for use in wound healing research: A survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue. Wound Repair and Regeneration. 8 (2), 83-96 (2000).
- Gudjonsson, T., et al. Normal and tumor-derived myoepithelial cells differ in their ability to interact with luminal breast epithelial cells for polarity and basement membrane deposition. Journal of Cell Science. 115 (1), 39-50 (2002).
- Xu, R., Boudreau, A., Bissell, M. Tissue architecture and function: dynamic reciprocity via extra- and intra-cellular matrices. Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1-2), 167-176 (2009).
- Jokinen, J., et al. Integrin-mediated cell adhesion to type I collagen fibrils. Journal of Biological Chemistry. 279 (30), 31956-31963 (2004).
- Au-Yong, I. T. H., Wildin, C. J., Dias, J. J., Page, R. E. A review of common practice in Dupuytren surgery. Techniques in Hand & Upper Extremity Surgery. 9 (4), 178-187 (2005).
- Deries, M., Collins, J. J. P., Duxson, M. J. The mammalian myotome: a muscle with no innervation. Evolution & Development. 10 (6), 746-755 (2008).
- Deries, M., et al. Extracellular matrix remodeling accompanies axial muscle development and morphogenesis in the mouse. Developmental Dynamics. 241 (2), 350-364 (2012).
- Martins, G. G., et al. Dynamic 3D Cell Rearrangements Guided by a Fibronectin Matrix Underlie Somitogenesis. PLoS ONE. 4 (10), e7429 (2009).
- Yokomizo, T., et al. Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos. Nat. Protocols. 7 (3), 421-431 (2012).
- Karkampouna, S., de Julio, M. K. ruithof- Fibrosis: a novel approach for an old problem. Receptors & Clinical Investigation. 1 (5), (2014).
- Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Seminars in Cell & Developmental Biology. 20 (8), 931-941 (2009).
- Freund, I., Deutsch, M., Sprecher, A. Connective tissue polarity. Optical second-harmonic microscopy, crossed-beam summation, and small-angle scattering in rat-tail tendon. Biophysical Journal. 50 (4), 693-712 (1986).
- Mohler, W., Millard, A. C., Campagnola, P. J. Second harmonic generation imaging of endogenous structural proteins. Methods. 29 (1), 97-109 (2003).
- Boulesteix, T., et al. Micrometer scale ex vivo multiphoton imaging of unstained arterial wall structure. Cytometry Part A. 69A (1), 20-26 (2006).
- Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (5), 349-363 (2002).
- Hinz, B., Mastrangelo, D., Iselin, C. E., Chaponnier, C., Gabbiani, G. Mechanical tension controls granulation tissue contractile activity and myofibroblast differentiation. The American Journal of Pathology. 159 (3), 1009-1020 (2001).
- Eastwood, M., McGrouther, D. A., Brown, R. A. A culture force monitor for measurement of contraction forces generated in human dermal fibroblast cultures: evidence for cell-matrix mechanical signalling. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1201 (2), 186-192 (1994).
- Verjee, L. S., Midwood, K., Davidson, D., Eastwood, M., Nanchahal, J. Post-transcriptional regulation of α-smooth muscle actin determines the contractile phenotype of Dupuytren's nodular cells. Journal of Cellular Physiology. 224 (3), 681-690 (2010).
