Summary
Doença de Dupuytren (DD) é uma doença fibroproliferativa da palma da mão. Aqui, apresentamos um protocolo para espécimes cultura de ressecção de DD em um (3D) sistema de cultura tridimensional. Tal sistema de cultura de curto prazo permite a preservação da estrutura 3D e propriedades moleculares do tecido fibrótico.
Introduction
Doença de Dupuytren (DD), uma doença benigna fibroproliferativa provoca a flexão permanente dos dedos, devido à formação de nódulos e os cabos de na palma da mão. Embora a propagação da doença é particularmente elevado entre os caucasianos do norte da Europa, a etiologia genética subjacente da doença permanece desconhecida 1. A principal característica do DD o excesso de produção de proteínas da matriz extracelular (ECM) (por exemplo, colagénio), que formam um tecido fibroso resistente que ocupa o espaço entre os tendões e pele da palma da mão e dos dedos, interromper permanentemente os movimentos finos da mão 2, 3. A recorrência da doença sugere alterações genéticas subjacentes como causa da fibrose 1, 4. Um tratamento eficaz pode ser de alvejar diretamente os mecanismos fibróticas incontroláveis a nível celular e molecular.
Nosso trabalho recente sobre a fibrose nos levou ao desenvolvimento de umnovo sistema de cultura 3D que permite a cultura de curto prazo de tecido fibrótico humano com o potencial de teste de drogas. Este sistema tem ajudado a superar a abordagem limitante de culturas de fibroblastos em 2D e para definir um papel para a regulação para baixo parcial, conseguida por exon skipping, de TGF ativação da via na mediação fibrose 5.
Desenvolvemos um método para a cultura ex vivo a partir de amostras de ressecção humano doentes DD para estudar a interacção entre miofibroblastos e a ECM circundante 5, 6. O estudo de DD fibrose do tecido conjuntivo bem como outras doenças fibróticas baseia-se na análise histopatológica do cirúrgico excisado espécimes, o isolamento de fibroblastos a partir do tecido e estabelecimento de culturas primárias ou de procedimentos de separação de células. Estas abordagens são completamente estática, uma vez que não permitem a manipulação exógena das propriedades de doença ou intervenção terapêutica por parte do experimentador. Além disso, ce primárioll culturas tendem a adaptar-se às condições de cultura e suas propriedades de expressão de genes diferem essencialmente da situação in vivo em cima de cada passagem, mesmo durante os primeiros trechos (entre passagem 3 e 6) 7, 8. Conseguimos manter o material cirúrgico resíduos em ex vivo condições de cultivo para um período de tempo que permite o estudo das características específicas do paciente e de triagem de compostos de drogas anti-fibróticas ou anti-inflamatórios.
O sistema baseia-se numa membrana de nitrocelulose, que permite o contacto do tecido com o suporte, mas não com o plástico, assim, evitar a alteração do tecido após a fixação, como observado anteriormente, quando a cultura de fibroblastos DD, bem como outros tipos de células 9. Não é necessário um gel de colagénio ou outro substrato de proteína da MEC, desde o próprio tecido DD produz grandes quantidades dessas proteínas. Isto é vantajoso para a manutenção do microambiente ECM nativa e pecado rotatividadesubstratos de matriz ce são importante regulador da arquitetura e da função 10, 11 tecido. Por exemplo, proteínas da MEC como a fibronectina, laminina e colágeno, podem influenciar polaridade traseira e dianteira de fibroblastos como semelhante mostrados para polaridade apical-basal em células epiteliais 12, 13 . células polarizadas têm uma distribuição assimétrica de moléculas extracelulares, que determina a migração celular e a expressão do gene, por exemplo, acessibilidade integrina α1β1 na membrana afecta a adesão das células ao colagénio do tipo I 14. Desde um objetivo primário deste modelo 3D era preservar o microambiente nativa, não foi utilizado nenhum substrato matriz ECM artificial.
Em resumo: as amostras de ressecção são igualmente cortar em um ambiente estéril e colocadas em membranas nitrocellular. Se for necessário um tratamento administrado por via de injecção os tecidos são injectadas após terem sido colocados sobre a membrana. Se o tratamento não necessita de ser administrado via injec ç ã o, em seguida, o composto é adicionado ao meio de cultura (Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), com 1% de soro fetal de vitelo (FCS), 1% de penicilina-estreptomicina (P / S)). As culturas são mantidas durante um período máximo de 10 dias, após o que o tecido é fixado em paraformaldeído a 4% (PFA), processados através de uma solução de sacarose a 30%, embebidos em composto PTU e armazenado a -80 ° C, como descrito anteriormente 5.
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Protocol
Este protocolo segue as diretrizes LUMC e AMC do comitê de ética em pesquisa humana.
1. Procedimento Cirúrgico e Cobrança Tissue
Nota: Apesar de existirem várias técnicas para a excisão cirúrgica da contratura de Dupuytren, o padrão ouro atual é a facectomia parcial 15. A maioria dos doentes são tratados no dia-a cirurgia clínica.
- Realizar a cirurgia sob anestesia geral ou regional, de acordo com as preferências do paciente e anestesista e das comorbidades do paciente. Estas considerações estão fora do escopo deste artigo. Antes da incisão, tocar a pele com um objeto pontiagudo para verificar que a anestesia é satisfatória. Use um torniquete para facilitar a visualização cirúrgica em um campo sem derramamento de sangue.
- Após Prepping estéril e drapeados, marcar a incisão antecipada com uma caneta. Faça uma incisão na pele com um bisturi sob ampliação lupa ou longitudinalmente or utilizando incisões em ziguezague para impedir contraturas adicionais e também para permitir a exposição suficiente.
- Usando tesoura de dissecção, libertar a pele e subcutâneo dos subjacentes palmaris fáscia contratados. Identificar e proteger o feixe neurovascular do dedo, porque o cabo de doente pode deslocá-lo para a linha média. Uma vez que o tecido fibrótico (nódulo e / ou cabo) é delineada, extirpar, colocou e regionalmente (subtotal), utilizando um bisturi. Hemostasia meticulosa sob controlo torniquete no final do procedimento para evitar a formação de hematoma.
- Para fechar a pele, use-plasties Z adicionais para obter alongamento parcial da pele.
- Para estes estudos usar apenas a parte nódulo do cordão fibrótico, a parte mais ativa e celular da doença. Já o cirurgião realizar a identificação macroscópica. Os nódulos isolados na palma da mão são frequentemente precursores ou um cabo, mas quase nunca são ressecadas, como eles geralmente não causar sintomas.As que ressecados foram os nódulos que faziam parte de um cabo do dedo contratado. Identificar esses nódulos pela parte grossa duro das cordas no handpalm (Figura 1A).
- Uma vez que o cirurgião remove o tecido, imediatamente transferi-lo usando uma pinça estéril para um tubo de 50 ml contendo meio DMEM suplementado com FCS a 10% e 1% (P / S). Manter o tecido durante um período máximo de 2 horas neste meio em uma caixa de gelo triturado (4 ° C) (por exemplo, o transporte do tecido a partir da sala de operação para a instalação de cultura de células).
- Mantenha as amostras em gelo molhado (4 ° C) durante a preparação para a próxima etapa. Preparação de materiais da câmara de cultura de células e requer 10-20 min.
2. Preparação de Instrumentos, Meio de Cultura e Cultura Inserções
Nota: Todos os procedimentos são realizados à temperatura ambiente a menos que especificamente indicado.
- Preparar 500 ml de DMEM suplementado com FCS a 10% e 1% (P / S) e filtro sterilize. Pré-aquecer o meio a 37 ° C.
- Fórceps autoclave, um par de tesouras Mayo curvas de lâmina (150-170 mm de comprimento) e um par de tesouras Metzenbaum e guarde em um recipiente estéril.
- Sob fluxo laminar, aberto um estéril de 12 poços da placa de cultura. Coloque uma inserção de cultura (0,45 de tamanho de poro, 12 mm de diâmetro) em cada poço da placa de 12 poços (Figura 1B, painel inferior).
- Encher a placa de 12 poços com 600 ul de pré-aquecido (37 ° C) meio de cultura por pipetagem no bem e não directamente na membrana da pastilha. Colocar a placa na incubadora (37 ° C, 5% CO 2) (Figura 1B, painel superior).
- Em alternativa, usar uma placa de 24 poços e adicionar 300 uL de meio por poço. O volume de meio por poço é óptima quando uma camada de menisco é formado entre o líquido e a parte inferior do inserto membrana.
Nota: o meio, na parte inferior do poço difunde-se através da Membr nitroceluloseane formando a camada de menisco, como representado nos esquemas da Figura 1B (painel inferior).
- Em alternativa, usar uma placa de 24 poços e adicionar 300 uL de meio por poço. O volume de meio por poço é óptima quando uma camada de menisco é formado entre o líquido e a parte inferior do inserto membrana.
3. Tissue Setup Preparação e Ex Vivo Cultura de Tecidos
Nota: Todos os procedimentos são realizados à temperatura ambiente a menos que especificamente indicado.
- Transferir o nódulo parte do cabo a partir do tubo de 50 ml, num prato de Petri 100 milímetros e adicionar 10 ml da pré-aquecido (37 ° C) médio. Certifique-se de que o tecido está em contacto com o líquido durante todo o procedimento.
- Retirar a camada de gordura perinodular usando a tesoura Metzenbaum. Descartar o tecido adiposo. Com a utilização de fórceps e tesouras as curvas de lâmina, cortar transversalmente o tecido em pequenos pedaços (com uma espessura máxima de 200 mm).
- Transferir a placa de 12 poços da incubadora para a capa laminar. Verificar que a membrana do inserto tornou transparente (molhado) e, por conseguinte, está em contacto com o meio.
- Utilizando uma pinçalevantar cuidadosamente uma parte do tecido por tocar na camada exterior (não aplicar tensão no tecido). Coloque uma parte do tecido para a membrana da inserção de cultura de células de modo que o tecido permanece na interfase ar-meio. Cultura um máximo de duas peças de tecido na mesma pastilha / poço.
- Certifique-se de que o tecido é colocado plana sobre a membrana, em contacto longitudinal com o meio de tal modo que o tecido não adere à membrana nem é inteiramente coberta pela mídia. Evitar bolhas de ar.
Nota: Nesta fase, é possível adicionar fatores de crescimento ou inibidores de interesse para a mídia; por exemplo, os compostos de ensaio (A, B, C, D, E) de repetições e / ou na curva de concentração. Inclua pelo menos 2 controle (sem tratamento) peças de tecido em condições normais de crescimento para garantir que a experiência tem sido configurado corretamente. Incubar tecidos para 3-7 dias numa incubadora de cultura de tecidos. - Infectar o tecido com qualquer um lentivírus ou adenovírus construção se superexpressão ou derrubar experiments de uma necessidade gene de interesse a ser realizado (Figura 2). Transferir uma parte do tecido da placa de 12 poços numa placa de 35 mm, utilizando fórceps.
- Utilizar um volume máximo de 10 ul de vírus de título elevado.
- Realizar a injecção sob um microscópio de dissecação com uma seringa de insulina carregada com 50 ul de PBS contendo 10 ul de vírus seleccionados. Inserir a agulha perpendicular ao centro do tecido.
- Lentamente injectar o conteúdo da seringa. Não retirar a agulha diretamente. Quando a perfuração do tecido, não deixe que a agulha passar pelo outro lado, mas manter a agulha dentro do próprio tecido (em torno do centro do tecido).
- Transferir o tecido de volta para a placa de 12 poços, fechar a placa de cultura e colocá-lo na incubadora (37 ° C, 5% CO 2).
4. Whole-mount Imunofluorescência Coloração e Reconstrução 3D
Nota: Todos os proprocedimentos são realizados à temperatura ambiente a menos que especificamente indicado. O protocolo para immunostaining montagem toda e de imagem descritos a seguir é uma adaptação de métodos reportados anteriormente utilizados para outros tecidos 16-19. Tampões e materiais estão descritos na Tabela 1 e Lista de Materiais.
- Tecidos de transferência da placa de cultura a 2 ml microtubos contendo PBS. Lavar 2x durante 5 minutos em solução de PBS, numa plataforma rotativa. Fix tecidos em 4% tamponada PFA (1,5 ml de solução por tecido em 2 ml de tubos de microcentrífuga), O / N a 4 ° C numa plataforma rotativa.
- Remover e lavar 3x PFA em PBS durante 5 min cada.
- Desidratar tecidos por imersão em uma solução de metanol a 25% durante 2 horas à temperatura ambiente, numa plataforma rotativa. Aumentar gradualmente a percentagem de metanol (50%, 75%, 100%) com os tecidos imersos em cada solução durante 2 horas à temperatura ambiente, numa plataforma rotativa.
- Tecidos de transferência em DMSO / solução de metanol (passo permeabilização) durante 3 semanas a 4 ° C,como anteriormente descrito 18.
Nota: Nesta fase, os tecidos podem ser armazenadas a longo prazo em metanol a 100% a -20 ° C. - Prossiga com coloração procedimento 16, 17; gradualmente re-hidratar os tecidos (75% -50% -25% -0% série metanol). Executar cada etapa de re-hidratação durante 2 h à TA ou O / N a 4 ° C, sob agitação constante.
- Incubar as amostras com anticorpos primários em PBS contendo 1% de albumina de soro bovino (BSA) e 20% de DMSO O / N a 4 ° C. Use anticorpos nas seguintes proporções utilizando as reservas comerciais em PBS: anti-α actina de músculo liso (1: 500, rato), tipo anti-colágeno I (1: 500, de cabra), anti-colágeno tipo III (1: 500, cabra).
- Lavar extensivamente em PBS durante 48 horas a 4 ° C (solução de PBS mudança de 3 a 4 vezes).
- Diluir anticorpos secundários adequados (Alexa 555 anti-ratinho, Alexa 488 anti-cabra) a 1: 250 em PBS contendo 1% (BSA) e 20% de DMSO. Incubar O / N a 4 ° C.
- Lavar extensivamente em PBS durante 48 horas a 476; C e incubar com contraste nuclear, TO-PRO-3 diluído 1: 500 em PBS no passo de lavagem final.
Nota: TO-PRO-3 é um corante vermelho-extremo emissores de ADN (com um He-Ne linha de laser 633 nm) e é combinado para imagiologia simultânea com outros canais; neste tipo de colágeno tipo caso I / colagénio III (488 nm), α actina de músculo liso (555 nm), TO-PRO-3 (647 nm). - Transferir os tecidos a uma série de metanol (25% -50% -75%) para se desidratar-se lentamente o tecido; executar cada etapa de desidratação durante 2 h à TA ou O / N a 4 ° C sob agitação constante.
- Tecidos de transferência em tubos de polipropileno. Tecidos claros em metilsalicilato (alça sob o capô química) 18 ou como uma alternativa de uso solução BABB 19. Incubar à temperatura ambiente, sob agitação constante até que os tecidos tornam-se transparentes. Mount entre um slide e uma lamela selado com jogo duro meio de montagem (Figura 1C, painel superior).
- Amostras de imagem em um micro confocal invertidoâmbito equipado com alta NA 63X e / ou os objectivos de imersão de óleo 100X (Figura 1C).
- Limpar a lente com a solução de limpeza fornecido pelo fabricante do microscópio.
- Aplicar uma gota de óleo sobre a lente objectiva. Coloque o slide com o modelo no palco microscópio e foco na amostra.
- Defina as configurações no microscópio para gravação simultânea de três canais de fluorescência com linhas de laser de 488 nm, 514 nm e 633 nm.
- Adquira imagens XY individuais ou várias imagens de plano focal (pilha Z) (Figura 3A). Use aumento da largura da pilha Z para executar a reconstrução 3D. Para obter uma imagem de alta resolução utilizam baixa velocidade de digitalização, número de scans médios (≥ 3) e adquirir imagens de resolução de 1.024 x 1.024 pixels de 16 bits.
- Analisar as imagens da pilha Z adquiridos: primeiro renomear e salvar arquivo de imagem (xyz). Utilizando o programa de software do microscópio confocal, configurar uma intensidade máxima projecção das imagens pilha Z em uma reconstrução 3D da imagem.
- Selecione o arquivo xyz, em "Ferramentas processo", clique em "Visualização" e "Projeção 3D". Enter "máximo" no método de projecção (ou "médio", se o sinal fluorescente é saturada). Para uma única projeção não altere o X, Y, Z e aviões, e aplicar a ferramenta de projeção (Figura 3B, R1).
- Use as imagens da pilha Z para criar uma projeção em 3D com animação (software confocal) para fins de visualização. Selecione o arquivo xyz, nas ferramentas de processo, clique em "Visualização" e "Projeção 3D".
- Clique em "Criar Filme". Digite o ângulo de iniciar a rotação em graus (por exemplo, 0 ° como ponto do filme, eixo Y de partida) e clique em "Set Start". Digite o ângulo de rotação em graus End (eixo Y), como ponto final do filme (por exemplo, 180 ° ou 3606; para uma rotação completa) e clique em "Set End".
- Escolha "Máximo" como um método de projecção (ou "médio", se o sinal fluorescente é saturada). Introduzir o "Número de Quadros" para a rotação da reconstrução 3D (por exemplo, 20 ou rotações mais elevadas para reduzir a velocidade de rotação). Clique em "Aplicar". Exportar o filme como um arquivo visual (por exemplo, "avi") (Filme Suplementar 1) ou exportar como arquivo "tiff", que cria um arquivo de imagem para cada ângulo de rotação (Figura 3B, rotação R4, R10, R18).
5. Combinada Second Harmonic Generation (colágeno) e de dois fótons de fluorescência Excited (elastina) Imagem em Tissue Ex Vivo durante Cultura
Nota: Todos os procedimentos são realizados à temperatura ambiente a menos que especificamente indicado.
- Remover placas transwell da incubadora e coloque um único (não fixo) tiparte ssue em um 35 milímetros placa de cultura celular contendo 500 mL de meio.
- Colocar o tecido de modo que o eixo longo é plana sobre a placa. Mantenha tecido molhado em todos os momentos no entanto, não flutuante.
- Coloque objectivo imerso em água do microscópio multifóton directamente em contacto com o tecido (Figura 1C).
- Obter imagens com um comprimento de onda de excitação de 800 nm e coletar luz emitida entre 371-425 nm (SHG, colágeno) e 474-532 nm (autofluorescência, elastina) (Figura 3C). Execute microscopia de dois fótons em um microscópio confocal vertical equipado com um laser de femtosegundo usando uma objetiva de imersão em água 20X / 1.0 NA. Processo confocal acumula com o software do fabricante.
Nota: Excitação com um laser infravermelho próximo de moléculas de colágeno cria alto contraste de imagem de estruturas de colágeno nativas em diferentes profundidades.
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Representative Results
O método de ex vivo, a cultura 3D de tecido conjuntivo é um conjunto up sistema fácil e robusta para entender a relação entre ECM e outros componentes de células que constituem o tecido DD e potencialmente outros tipos de fibrose também. Além disso, este sistema permite que um método fiável para testar os efeitos dos compostos sobre diferentes tipos de células e os seus efeitos sobre a carga 20 fibrótica.
As etapas de coleta de resíduos de material cirúrgico derivado de fibrose de Dupuytren, a montagem da câmara de cultura e exemplos de ferramentas de análise são apresentados na Figura 1. Como ilustrado na Figura 1, este método fornece uma ferramenta experimental para telas grandes telas de drogas, por exemplo, antifibróticas compostos de drogas, bem como o estudo de modelação em ECM em tempo real e de maneira reprodutível. Nodulares partes do cordão fibroso são igualmente cortada e colocada em placas Transwell; cada peça de tecido (100-200 um) é cultivado em cima da membrana de uma inserção de cultura (0,45 de tamanho de poro, 12 mm de diâmetro). O meio de cultura é adicionado na parte inferior da câmara, permitindo o contacto com o tecido através da membrana. Em média, 30-40 partes de tecido pode ser derivada a partir de um único espécime de ressecção, o que permite o rastreio em larga escala de drogas; compostos, moléculas pequenas ou factores de crescimento. As experiências abordando a concentração e / ou o efeito dependente do tempo de fármacos são possíveis.
Como mostrado na Figura 2, a expressão do gene pode ser manipulada (superexpressão / knock down) através da utilização de vírus adeno / lentivírus injectado directamente no tecido. Fluorescente transdução viral marcado é realizada em amostras de tecido fresco grossas por injeção. Tecido permanece em cultura durante 24-48 h pós-injecção e é subsequentemente fixo, embebida e seccionada em 0,7 mm criocortes. Além disso, para analisar o efeito da parte do tecido ou compostos diferentes condições de culturas está fixado e submetido a imunofluorescência inteiro de montagem como mostrado na Figura 3. imagens 3D de tecidos de espessura é feito através de microscopia confocal (Figura 3A-B). Outro método é a imagem 3D vivo em tecidos mantidas em cultura; remodelação do colágeno endógeno é estudado em tempo real no recém-dissecados, peças de tecido não-fixada por geração de segundo harmônico (SHG) (Figura 3C). O efeito de potenciais medicamentos anti-fibróticas também é seguido em partes do mesmo tecido em diferentes pontos de tempo. Estruturas de colágeno do tecido grosso são fotografada usando SHG em um microscópio multiphoton vertical. Durante a gravação, as amostras de tecidos são colocados em médio e são gravadas com um objetivo de imersão em água. Após a imagiologia, os tecidos podem ser transferidos de volta para o sistema de cultura. Os efeitos podem ser estudada ao nível do ambiente celular e extracelular proporcionar uma vantagem sobre os ensaios in vitro baseados em células. Existem várias possibilidades de analise dos efeitos biológicos como histologia de cortes de tecidos fixos, imunofluorescência toda montagem e reconstrução de imagens 3D por microscopia confocal, SHG e dois fótons de fluorescência animado imagens de colágeno endógeno e elastina. Algumas das vantagens da imagiologia de SHG são o uso de tecido fresco, não fixada, que não preparação coloração do anticorpo é necessário e que o mesmo pode ser trabalhada de tecido várias vezes (curso de tempo durante condições de cultura). SHG e dois fótons de fluorescência animado imagem foi descrito anteriormente para o músculo e tecido conjuntivo 21-23 e estrutura da parede arterial unstained 24, no entanto, aqui nós relatamos uma aplicação alternativa para o estudo da fibrose de Dupuytren.
Figura 1. Esquema de ex vivo em 3D sistema de cultura de tecidos. (A) DD contratura de flexão permanente na mão de um paciente antes da remoção cirúrgica. Este valor foi modificado a partir do estudo anterior 5. (B) Exemplo de ex vivo cultura configurar. (C) Os exemplos de abordagens experimentais que podem ser usados para análise da deposição de ECM. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior da figura.
Figura 2. A prova de princípio ex vivo gene expressão modulação mediada por vírus no tecido todo mount. (A) Os núcleos são visualizados com TO-PRO-3 corante (azul). Barras de 75 mm. (B) a visualização directa da fluorescênciadye DsRed (vermelho), após a injecção com adenovírus expressando-DsRed. Bars 75 mm. (C) imagem mesclada (coloração nuclear em azul, DsRed em vermelho). Localização citoplasmática de DsRed indicando entrega adenoviral nas células dentro de 24 horas. Barras de 75 um. (DF) Lentivirus transdução. (D) Os núcleos são visualizadas com TO-PRO-3 corante (azul). Barras 25 mm. (E) a visualização direta da GFP em cortes de tecido (verde), pós-injeção com partículas lenti-GFP. Barras 25 mm. (F) imagem mesclada de D e E, indicando a localização intracelular de lenti-GFP. Barras de 25 mm (GH) Exemplo de knockdown mediada por lentivírus contra gene de interesse (designada como "A");. (L) de transporte de sequência Lentivirus shRNA mexidosInjectou-se ex vivo em tecido. Coloração de imunofluorescência para a proteína de interesse (designada como "A"), representados a vermelho. Barras de 75 ^ m. (H) Lentivírus realização gene da sequência de A-shRNA foi injectado ex vivo para o tecido. Coloração de imunofluorescência para a proteína "A". Os núcleos são corados com TO-PRO-3 corante. Bars 75 mm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. imagem 3D reconstrução, geração de segundo harmônico e de dois fótons de fluorescência animado imagem. (A) imagens 3D por microscopia confocal. Imagens individuais (XY) em planos focais ao longo de diferentes profundidades de tecido (z = 50-200 m). Whole IMMU montarcoloração nofluorescence; miofibroblastos α-actina de músculo liso do marcador (αSMA, vermelho), coloração nuclear (TO-PRO-3, azul). Bares:. 500 mm (B) de reconstrução 3D de imagem (pilha Z 389 mm) de imagens cruas, como indicado no painel A em diferentes rotações 3D indicados como "R1", "R4", "R10", "R18". Bares 500 mm. (C) modelagem conteúdo de colágeno endógeno, através de segunda geração de imagem harmônico (SHG) em frescos, peças de tecidos grossos (painel esquerdo, verde). Dois fótons de fluorescência animado (TPF) de estruturas de elastina da ECM foi capturado por microscopia multiphoton (painel do meio, vermelho). Imagem mesclada de colágeno (verde) e elastina (vermelho) (painel direito). Bares:. 100 mm Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme complementar 1. represensentante filme 3D reconstrução de todo o tecido montagem de Dupuytren imagem confocal de tecido DD foi realizada após sete dias ex vivo cultura e processamento para a coloração de todo imunofluorescência mount.; miofibroblastos α-actina de músculo liso do marcador (αSMA, vermelho), coloração nuclear (TO-PRO-3, azul). Barra de escala = 500 pm. Frames = 20. Z = 389 mm. Por favor clique aqui para ver este vídeo.
| PBS (solução salina tamponada com fosfato) | 8,00 g de NaCl (0,137 M) 0,20 g de KCl (2,7 mM) 0,20 g de KH 2 PO 4 (1,1 mM) 0,10 g de MgCl 2 .6H 2 O (0,5 mM) 2.16 g de Na 2 HPO 4 · 7H 2 O (8,1 mM) 0,10 g de CaCl 2 anidro (0,9 mM) H2O até 1 L |
| Dissolve-se 4 g de paraformaldeído num balão contendo 100 ml de tampão fosfato salino (PBS), na hotte, cobrir o balão. Colocar o balão em um aquecimento / bloco de agitação e mexa suavemente a solução. Monitorar a temperatura de modo a que atinja um máximo é de 65 ° C. Evite o excesso de aquecimento. Uma vez que o paraformaldeído foi dissolvido e a solução parece clara, desligue o calor, mas deixar a se mexer. Não manuseie por razões de segurança. Permitir arrefecimento. Quando arrefecida, a alíquota de solução e armazenar a longo prazo no congelador a -20 ° C ou num frigorífico a 4 ° C para o máximo de uma semana. | |
| BSA (albumina de soro bovino), 10% (w / v) | Dissolve-se 10 g de BSA em 100 ml de H 2 O. Filtrar esterilizar usando uma ligação filtro de 0,22 mícrons de baixa proteína. Armazenar a 4 ° C. |
| DMSO / metanol solução de permeabilização (20%) | Misturar com dimetilsulfóxidoMetanol (1: 4 analogias, volume total 100 ml). |
Tabela 1. As soluções de buffer.
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Discussion
Os passos mais críticos de cultura ex vivo de tecido conjuntivo humano são o uso imediato do tecido após a remoção cirúrgica para assegurar a viabilidade; o tecido deve permanecer na solução de meio ou soro fisiológico em todos os momentos; manter uma cultura estéril; cortes transversais de tecido deve ter espessura máxima de 200 m; configurar o sistema de cultura ex vivo é óptima quando o tecido está em contacto com o suporte, mas não totalmente submerso. Meio deve ser adicionado apenas na câmara fora do transwell num pequeno volume (por exemplo, área superficial de 500-600 ul de 12 poços por placa).
O tecido conjuntivo derivado de Dupuytren é enredado em uma estrutura resistente com alto teor de proteínas da MEC, como colágeno, proteoglicanos, e elastina; Devido a essas propriedades e, adicionalmente, devido a myofibroblast contratura pode ser um desafio para cortar o tecido. É importante o uso de instrumentos cirúrgicos adequados; curvo bladed tesoura de Mayo para cortar peças maiores na mesma espessura e tesouras cirúrgicas menores para as peças de tecido menores de corte (por exemplo, se mais peças de tecidos são necessárias placas de utilização de 24 poços).
Os métodos para o estudo da DD são análises histopatológicas do espécime fibróticas excisadas, ou derivação de fibroblastos primários. Derivação celular a partir do material paciente é feito é duas maneiras; em um dos métodos, as partes de tecido são cultivadas em placas de cultura de plástico de um certo número de semanas até que haja crescimento de fibroblastos. O segundo método é o tratamento enzimático de tecidos com tripsina e colagenase. O primeiro método é demorado, fibroblastos propriedades são alteradas devido às condições de cultura e existe uma variabilidade dependente da passagem entre as passagens da mesma linha de células. O método enzimático é mais rápida e pode ser usado para ensaios de separação de células, no entanto, a manutenção in vitro destas células para fora do ECM inato não reflecte o in vivo 25 (ou seja, mechanoregulation e mechanotransduction). Perda de tensão resulta em desmontagem de fibras αSMA em MFBs em curto período de tempo 26. A abundância de αSMA na ex vivo 27, 28. No que diz respeito variabilidade técnica e biológica, o nosso método é reproduzível (viabilidade, rede ECM) e menos propenso a alteração do tecido devido ao curto tempo de cultura. Por exemplo, o método de desdobramento de fibroblastos requer várias semanas, o que pode provocar alterações bioquímicas (por exemplo, acumulação de mutações genéticas, senescência replicativa). No entanto, as características genéticas específicas do paciente e variabilidade biológica são, em si desafios no domínio da investigação DD e não pode ser combatida com qualquer um dos métodos atuais.
Como mostrado neste protocolo, os espécimes DD fibróticas após a ressecção cirúrgica são cultivadas diretamente no sistema ex vivo em 3D e / ou congeladas rapidamente. Dependendo da pergunta científica, modificação do tecido é possível através da adição de factores de crescimento, compostos químicos, virus-mediada de entrega de genes, oligonucleótidos anti-sentido e miARNs. Os compostos podem ser entregues na mídia ou com microinjeções locais do tecido na câmara de cultura 3D. Depois de 3 e 7 dias de cultura de tecido podem ser homogeneizados para isolamento de células e a análise por FACS ou isolamento de ARN total e proteínas para análise do perfil de expressão, bem como processados para análise histológica. O status de proteínas fibrosas (αSMA, colágeno tipo I e II, fibronectina), a arquitetura do tecido do nódulo parte do cordão e da consistência da rede fibrosa expressão é avaliada antes e após os tratamentos. A fim de acompanhar os rearranjos ECM durante a cultura que combinou o SHG (colágeno) e de dois fótons de fluorescência animado (elastina) de imagem.
Os rearranjos extracelulares pode então ser quantificado ou modeladas utilizando software imagem quantificação. Estes parâmetros dão uma indicação dos efeitos da droga sobre fibrose ou o Molesular alterações que tenham sido induzidas durante a cultura. Além disso matrizes ECM também pode ser realizada em fatias individuais para gerar uma melhor visão geral dos efeitos. Em geral, nós estabelecemos um sistema robusto que permite o estudo da fibrose ex vivo.
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Disclosures
Os autores entraram com um pedido de patente para a doença de Dupuytren: cultura de órgão 3D. # GB1307200. Contratos de licença e de serviços comerciais estão disponíveis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 11965-084 | |
| fetal calf serum (FCS) | Gibco | high glucose, heat inactivated | |
| penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Cell culture inserts | Millicell | PIHA01250 | 0.45 μm pore size, 12 mm diameter |
| anti-collagen type I | Southern Biotech | 1310-08 | |
| anti-α smooth muscle actin | Sigma | A2547 | |
| anti-collagen type III | Southern Biotech | 1330-01 | |
| Alexa Fluor555 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A-31570 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody | Invitrogen | A-11055 | |
| TOPRO-3 | Invitrogen | T3605 | |
| methylsalicylate | Sigma | M6752 | |
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Tissue Tek OCT | Sakura | 25608-930 | |
| Microsccope glass coverslips | Menzel-Glaser | BB024060A1 | 24 x 60 mm |
| Microscope SuperFrost slides | Menzel-Glaser | AA00000102E | 76 x 26 mm |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium | Vector laboratories | H-1400 | |
| Leica TCS SP5 II confocal microscope | Leica Microsystems | Argon-488, 514 nm and HeNe-633 nm laser lines | |
| Zeiss 710 NLO upright confocal microscope | Jena, Germany | Equipped with femtosecond Spectra - Physics Deep See MP laser (Santa Clara, United States) using a Plan-Apochromat 20X/1.0 NA water-immersion objective. |
References
- Shih, B., Bayat, A. Scientific understanding and clinical management of Dupuytren disease. Nat Rev Rheumatol. 6 (12), 715-726 (2010).
- Bisson, M. A., McGrouther, D. A., Mudera, V., Grobbelaar, A. O. The different characteristics of Dupuytren's disease fibroblasts derived from either nodule or cord: expression of α-smooth muscle actin and the response to stimulation by TGF-β1. The Journal of Hand Surgery. 28 (4), 351-356 (2003).
- Brickley-Parsons, D., Glimcher, M. J., Smith, R. J., Albin, R., Adams, J. P. Biochemical changes in the collagen of the palmar fascia in patients with Dupuytren's disease. The Journal of Bone & Joint Surgery. 63 (5), 787-797 (1981).
- Berndt, A., Kosmehl, H., Katenkamp, D., Tauchmann, V. Appearance of the myofibroblastic phenotype in Dupuytren's disease is associated with a fibronectin, laminin, collagen type IV and tenascin extracellular matrix. Pathobiology. 62 (2), 55-58 (1994).
- Karkampouna, S., et al. Novel ex vivo culture method for the study of Dupuytren's disease: effects of TGFβ type 1 receptor modulation by antisense oligonucleotides. Mol Ther Nucleic Acids. 3, e142 (2014).
- Kruithof-de Julio, M., et al. Canonical Wnt signaling regulates Nkx3.1 expression and luminal epithelial differentiation during prostate organogenesis. Developmental Dynamics. 242 (10), 1160-1171 (2013).
- Krause, C., Kloen, P., ten Dijke, P. Elevated transforming growth factor β and mitogen-activated protein kinase pathways mediate fibrotic traits of Dupuytren's disease fibroblasts. Fibrogenesis & Tissue Repair. 4 (1), 14 (2011).
- Gorman, D. B., Wu, Y., Seney, S., Zhu, R. D., Gan, B. S. Wnt expression is not correlated with beta-catenin dysregulation in Dupuytren's Disease. J Negat Results Biomed. 5, 13 (2006).
- Streuli, C. H., Schmidhauser, C., Kobrin, M., Bissell, M. J., Derynck, R. Extracellular matrix regulates expression of the TGF-beta 1 gene. The Journal of Cell Biology. 120 (1), 253-260 (1993).
- Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (4), 265-275 (2006).
- Gottrup, F., Ågren, M. S., Karlsmark, T. Models for use in wound healing research: A survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue. Wound Repair and Regeneration. 8 (2), 83-96 (2000).
- Gudjonsson, T., et al. Normal and tumor-derived myoepithelial cells differ in their ability to interact with luminal breast epithelial cells for polarity and basement membrane deposition. Journal of Cell Science. 115 (1), 39-50 (2002).
- Xu, R., Boudreau, A., Bissell, M. Tissue architecture and function: dynamic reciprocity via extra- and intra-cellular matrices. Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1-2), 167-176 (2009).
- Jokinen, J., et al. Integrin-mediated cell adhesion to type I collagen fibrils. Journal of Biological Chemistry. 279 (30), 31956-31963 (2004).
- Au-Yong, I. T. H., Wildin, C. J., Dias, J. J., Page, R. E. A review of common practice in Dupuytren surgery. Techniques in Hand & Upper Extremity Surgery. 9 (4), 178-187 (2005).
- Deries, M., Collins, J. J. P., Duxson, M. J. The mammalian myotome: a muscle with no innervation. Evolution & Development. 10 (6), 746-755 (2008).
- Deries, M., et al. Extracellular matrix remodeling accompanies axial muscle development and morphogenesis in the mouse. Developmental Dynamics. 241 (2), 350-364 (2012).
- Martins, G. G., et al. Dynamic 3D Cell Rearrangements Guided by a Fibronectin Matrix Underlie Somitogenesis. PLoS ONE. 4 (10), e7429 (2009).
- Yokomizo, T., et al. Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos. Nat. Protocols. 7 (3), 421-431 (2012).
- Karkampouna, S., de Julio, M. K. ruithof- Fibrosis: a novel approach for an old problem. Receptors & Clinical Investigation. 1 (5), (2014).
- Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Seminars in Cell & Developmental Biology. 20 (8), 931-941 (2009).
- Freund, I., Deutsch, M., Sprecher, A. Connective tissue polarity. Optical second-harmonic microscopy, crossed-beam summation, and small-angle scattering in rat-tail tendon. Biophysical Journal. 50 (4), 693-712 (1986).
- Mohler, W., Millard, A. C., Campagnola, P. J. Second harmonic generation imaging of endogenous structural proteins. Methods. 29 (1), 97-109 (2003).
- Boulesteix, T., et al. Micrometer scale ex vivo multiphoton imaging of unstained arterial wall structure. Cytometry Part A. 69A (1), 20-26 (2006).
- Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (5), 349-363 (2002).
- Hinz, B., Mastrangelo, D., Iselin, C. E., Chaponnier, C., Gabbiani, G. Mechanical tension controls granulation tissue contractile activity and myofibroblast differentiation. The American Journal of Pathology. 159 (3), 1009-1020 (2001).
- Eastwood, M., McGrouther, D. A., Brown, R. A. A culture force monitor for measurement of contraction forces generated in human dermal fibroblast cultures: evidence for cell-matrix mechanical signalling. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1201 (2), 186-192 (1994).
- Verjee, L. S., Midwood, K., Davidson, D., Eastwood, M., Nanchahal, J. Post-transcriptional regulation of α-smooth muscle actin determines the contractile phenotype of Dupuytren's nodular cells. Journal of Cellular Physiology. 224 (3), 681-690 (2010).
