כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצר שתלי כלי רקמה מהונדסת, כי הם פונקציונליים להשתלה לעכברים על ידי זריעה כפולה תאי גזע pluripotent מושרה באופן חלקי (PiPSC) – נגזר תאי שריר חלק וPiPSC – תאי האנדותל נגזרו על bioreactor פיגום כלי decellularized.
The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.
הבנייה של צינורות כלי דם היא אסטרטגיה בסיסית לתיקון כירורגי של כלי נפגעו ונפצעו כתוצאה ממחל לב וכלי דם. עד כה, חומרי שתל המשמשים בניתוחים כוללים ביולוגית פולימרים סינטטיים (polytetrafluoroethylene [טפלון], polytetrafluoroethylene המורחב [ePTFE; גור-Tex] או terephthalate פוליאתילן [דקרון]), allografts, רקמת אוטולוגי (קרום הלב או וריד saphenous) וxenografts 1. בעוד שתלי מלאכותיים (למשל, גורטקס ודקרון) הם נפוצים ביותר, חומרים אלה עלולים לגרום לסיבוכים לטווח קצר וארוך רבים הכוללים היצרות, בתצהיר סידן, thrombo-אמבוליזציה וזיהומים. למרות שמטופלים עם שתלים ביולוגיים נוכחי עם ירידה באירועי thrombo-תסחיפים, הם עדיין נתקלים במגבלות כגון אי ספיקה משנית שתל ועמידות מקוצרת בשל הסתיידות השפלה 2. לכן, למרות שיפור המשמעותי בt כירורגיתechniques במשך השנים, החוקרים וקלינאים עדיין עמוס עם הצורך בזיהוי הצינור האידיאלי למחלות לב וכלי דם. לאחרונה, תחום המחקר של הנדסת רקמות כלי דם יצר מושג שבו תאים משולבים פיגומים מתכלים, במטרה ליצור סביבת biomimetic שמגלמת כלי פונקציונלי להשתלה מוצלחת 1. ביסודו, הצלחתו של בונה כלי הדם תלויה בשלושה מרכיבים חיוניים; תאים המרכיבים את הפיגום, כלומר, שכבה פנימית של תאי האנדותל ושכבת תאי שריר חלק, פיגום המכיל המטריצה תאית המתאימה כדי לספק תכונות מכאניות דומות לכלי הדם המקומיים, ואיתות המולקולרית / סלולרית שנדרש לייזום / ויסות תיקון.
patency שתל לטווח ארוך ופיתוח מתמשך של הניאו-רקמות תלויים מאוד בזריעת תאים יעילה של פיגומים, הereby טיוח ההחלטה של סוג תא חשיבות קריטית. מספר דיווחים להדגים את השימוש באנדותל הבוגר ותאי שריר חלק ממקורות שונים לפתח צינורות בקוטר קטן 3-6. למרות מבטיח, חוסר כלי אוטולוגי מספיק כדי להשיג אנדותל הבוגר ותאי שריר חלק יישארו נטל ניכר. לאחרונה, תאי גזע ממקורות שונים שנוצלו עבור יישומי הנדסת רקמות וכלי דם. תאים אכן, תאי גזע pluripotent מגוון של סוגי תאי גזע כוללים תאי גזע עובריים 7, מושרה (iPSCs) 8,9, PiPSC 10,11, נגזר מח עצם mononuclear 12, בתאי גזע mesenchymal 13, ותאי האנדותל וקיר כלי למבוגרים -derived תאי גזע אנטיגן-1 (SCA-1) + תאי גזע / אב 14,15 כולם הודגמו להיות מסוגל בידול לתאי האנדותל או פונקציונלי או שריר חלק בתגובה לתקשורת מוגדרת ותנאי תרבות. יתר על כן, יכולת התחדשות עצמית בלתי מוגבלת של תאי הגזע להפוך אותם מועמדים טובים יותר בניגוד לאנדותל הבוגר ותאי שריר חלק שיכול רק לחלק למספר מוגבל של פעמים לפני שעברו למעצר צמיחה והזדקנות.
הבחירה של חומר פיגום כדי ליצור כלי רקמות מהונדס מוצלחות להשתלה תלויה במספר גורמים כגון biocompatibility, תכונות ביו-מכאניות, ושיעור ההתכלות. ביסודו, חומרים המשמשים ליצור פיגומים לשתלים צריכים להיות מתכלה ולא הר תגובות חיסוני נמען מיותר. בנוסף, הוא חייב להקיף נקבוביות מתאים ומייקרו עבור קובץ מצורף תא והישרדות שלאחר מכן. עד כה, החומרים הנפוצים ביותר בשימוש לפיגומים בהנדסת רקמות וכלי דם כוללים פולימרים של חומצות polyglycolic, חומצת polylactic, וε-caprolactone פולי 16. לאחרונה, יש לי חומרים ביולוגיים decellularizedגם יושם בהצלחה מסוימת. מספר מעבדות הראו כי זריעה אנושית decellularized, כלבים או כלי החזיריים עם תאי אוטולוגי סיפקה שתל ביולוגי שהתנגד קרישה והיפרפלזיה intimal 17-19. אסטרטגיות אחרות בהנדסת רקמות וכלי דם כוללות שתלים תאיים כלי דם המבוססים על חלבוני מטריצה למשל, זריעת תאים בג'ל הפיברין 13 וגיליונות תא יצירה ללא תמיכת פיגום 20, 21.
הפרוטוקול הנוכחי מדגים את הבידול של PiPSC האנושי לאנדותל הפונקציונלי ותאי שריר חלק, הדור של bioreactor המורכב מפיגום כלי decellularized נמל תאי כלי דם נגזר PiPSC פונקציונליים, והשתלה של כלי הרקמה מהונדסות לכשל חיסוני משולב חמור (SCID עכברים). PiPSC הוא סוג תא אופטימלי לשימוש עבור הנדסת רקמות של שתלי כלי משום שתאים אלה לא יוצרים גידולים בעכברים או להעלות אתי ותגובות allo-חיסונית. יתר על כן, יש לנו הראינו כי האסטרטגיה ליצירת פיפס-אנדותל תאים ופיפס חלק תאי שריר היא יעילה והשחזור 10,11. לאחר מכן, מתכננים כלי decellularized לזריעה של תאי כלי דם נגזר PiPSC לחקות באופן הדוק חלבוני מטריצה שקיים בתוך כלי ילידים, וכך לשפר את יעילות השתלה והישרדות. יתר על כן, decellularization של כלי לפני זריעת PiPSC מונע ההתרחשות של תגובות דלקתיות רכובים על ידי סוגי תאים חיסוניים כגון מקרופאגים. יותר מכך, פרוטוקול זה לא רק מייצג מתודולוגיה כדי ליצור מבטיח צינורות כלי דם לתרגום לבני אדם, אלא גם מספק אמצעי רב ערך של לימוד והבנת המנגנונים המולקולריים השולטים בהתחדשות רקמת כלי דם באמצעות מודלים עכבר.
הפרוטוקול הנוכחי מצביע על צליל אסטרטגיה, מהירה, פשוטה, יעילה ושחזור שבו יכולים להיות שנוצרו כלי רקמה מהונדסות תפקודיים באמצעות PiPSC מfibroblasts האנושי. טכניקה זו מהווה כלי רב ערך לרפואת רגנרטיבית, הנדסת רקמות וטיפול בתאים שעלולים להיות מטופל ספציפי בעתיד הקרוב. שלבים קריט…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by The British Heart Foundation and The Oak Foundation.
Human Fibroblasts CCL-153 | ATCC | CCL-153 | Prenatal human embryonic fibroblasts |
ATCC F-12K Medium (Kaighn's Modification of Ham's F-12 Medium) | ATCC | 30-2004 | |
Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
Knockout DMEM medium optimized for embryonic stem cells | Life technologies (Gibco) | 12660-012 | |
Knockout Serum Replacement | Life technologies (Invitrogen) | 10828-028 | |
Human Basic FGF-2 | Miltenyi Biotech | 130-093-837 | |
alpha-MEM medium | Life technologies (Invitrogen) | 32571093 | |
Human PDGF | R&D System | 120-HD-001 | |
Gelatin Solution 2% | Sigma | G1393 | |
Plasmid 20866: pCAG2LMKOSimO (SOX2, OCT4, KLF4, C-MYC) | Addgene | 20866 | |
PvuI Restriction Enzyme | New England Biolabs | RO150S | |
SureClean Plus | Bioline | BIO-37047 | |
Nucelofection Kit (NHDF Kit) | LONZA | VPD-1001 | |
Neomycin | SIGMA | G418 | Selection of |
KL 1500 LCD, Illumination for Stereo Microscopy | SCHOTT | KL 1500 LCD | Cold light illumination for stereo microscopy |
Nikon Zoom Steromicroscope SMZ800 | Nikon | SMZ800 | |
Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
10% SDS Stock Solution Molecular Biology Reagent | Severn Biotech | CAS 151-21-3 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
Matrigel (10mg/ml) | BD | A6661 | |
Shaker IKA Vibrax with Shaking platform VX 7 | Jepson Bolton's, Janke&Kunkel | S32-102 | |
Masterflex L/S Digital Pump Drive | Cole-Parmer | WZ-07523-80 | |
Masterflex L/S 6-channel, 6-roller cartridge pump head | Cole-Parmer | EW-07519-15 | |
Masterflex L/S large cartridges for pump head | Cole-Parmer | EW-07519-75 | |
Masterflex platinum-cured silicone pump tubing, L/S 14, 25 ft | Cole-Parmer | WZ-96410-14 | Tubing goes through the peristaltic pump |
0.5mm ID, 0.8 mm OD Silicone Tubing | SILEX | N/A | Tubings connect incubation chamber, media reservoir and compliance chamber |
Fitting Reducer 0.5 to 1.6, natural Polypropyline | Ibidi | 10829 | Adapter connect above two types of tubings |
1/32" Tubing, ID 0.01" (250µm) Material: PEEK | LabSmith | T-132-010P | Tubing through the incubation chamber wall which connects the graft with outside tubing |
One-Piece Fittings | LabSmith | T-132-100 | Fix the above tubings through the incubation chamber wall |
Nylon tubes (OD 0.9mm, ID 0.75mm) | Smiths Medical | N/A | Tubings insert into two ends of the aorta graft |
NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl mouse | Charles River | ||
Surgical sutures, 8-0 silk | ETHICON | W819 | |
Hypnorm | Vetapharm | Vm21757/4000 | Neuroleptanalgesic for use in mice |
Hypnovel (Midazolam) | Roche | 59467-70-8 | Induction of anaesthesia |
Dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | |
Nylon Tubing | Portex LTD | 800/200/100/200 | 0.65 mm in diameter and 1 mm in length; to make artery cuff |
Electrocoagulator | Martin | SN 54.131 | Ligation of artery branches on aorta |
Bipolar micro hemostat forceps | Martin | 80-91-12-04 | Fixation of vessel ends |
Vessel Dilator | S&T | JFX-7 | |
Vessel Dilator | S&T | JFL-3dZ | |
Vessel Dilator | S&T | D-5aZ | |
Mini applier | AESCULAP | FE572K | |
Micro hemostats clips | AESCULAP | FE720K | |
Surgical sutures, 6-0 VICRYL | ETHICON | V489 |