Summary
Le modèle chroniquement instrumentés de fœtus de mouton non anesthésié est utilisée pour étudier le développement du fœtus humain dans la santé et la maladie, car elle permet le placement chirurgical et l'entretien des cathéters et des électrodes, prises de sang répétitif, l'injection d'une substance, un enregistrement de l'activité bioélectrique et l'imagerie in vivo. Nous décrivons les procédures nécessaires pour établir ce modèle.
Introduction
Une variété de modèles animaux existent pour l'étude de deux grossesses normales et compromis, y compris les rongeurs de laboratoire, les primates non humains et les ruminants domestiques. 1,2,3,4,5 La brebis gestantes chroniquement instrumentés a été largement utilisé pendant 50 ans un modèle de développement et les réponses foetal humain à des stimuli physiopathologiques tels que le lipopolysaccharide (LPS). 6-10 Les lésions après une exposition de LPS imitent exactement ce que l'on voit chez les prématurés avec leucomalacie périventriculaire, qui est due à un profil de maturation similaire des deux espèces. 11, 12
Autres complications de la grossesse ont également été étudiés dans les moindres détails comme la découverte que les glucocorticoïdes prénatales promouvoir le développement du poumon 13-15 et la compréhension de l'impact de la restriction de croissance intra-utérin (RCIU) sur le fœtus 16,17.
L'utilisation intensive du modèle de fœtus de mouton est due à la unique susceptibilité du mouton fœtal non-anesthésié à la mise en place et la maintenance des cathéters et des électrodes chirurgicale, ce qui permet le prélèvement de sang répétitif, l'enregistrement de l'activité bioélectrique, l'application de la stimulation électrique et en imagerie cérébrale in vivo. 18 La télémétrie est également possible, bien que moins fréquemment utilisé encore en raison de la sophistication supérieur à mettre en place ainsi que le coût initial et de maintenance. 19
En outre, le modèle de fœtus de mouton est très polyvalent autant de variantes de l'instrumentation sont possibles en fonction des mesures d'intérêt. Par exemple, il est possible d'enregistrer plus de jours à quelques semaines des signaux multivariés en temps réel tels que les mouvements fœtaux de respiration, l'activité électrique du cerveau, les réponses cardiovasculaires, électrocardiogramme, le débit sanguin régional à une gamme d'organes utilisant des sondes ou des microsphères flux, etc. Merci à cette polyvalence, un large éventail d'études ont été menées, y compris le développement de la cardigansystème ovascular 20,21, hypothalamo-hypophyso-surrénalien (HHS) 22, le développement du cerveau de développement et 23 états de sommeil en particulier 24, effets de l'hypoxie / 25 asphyxie, hypothermie thérapeutique 26, inflammation 6-11, combinaison des deux 27, glucocorticoïdes 28,29, anti-dépresseurs 30, dysplasie broncho-pulmonaire (BPD) 31,32, programmation fœtale 33,34,35,36,37,38,39 ou le développement de nouvelles modalités de surveillance du fœtus avant et pendant le travail au nom mais à quelques domaines d'investigation. 40,41,42,43
L'objectif global de la méthode présentée est de montrer la mise en œuvre de base de ce modèle polyvalent. Il permet d'établir une grande variété de protocoles expérimentaux aiguës et chroniques étudier la physiologie et la physiopathologie fœtal sur la intégrative, orgue, les niveaux cellulaire et moléculaire.
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Protocol
Soins aux animaux a suivi les lignes directrices du Conseil canadien de protection des animaux et de l'approbation par le Conseil de l'Université de Montréal sur la protection des animaux (protocole N ° 10-Rech-1560). Des informations détaillées sur les matériaux et les méthodes utilisées est fourni dans le tableau 1.
1. Anesthésie
- Insérer un cathéter à lumière unique dans une veine jugulaire.
- Sedate la brebis utilisant acépromazine (Atravet 10 mg / mL) 2 mg par voie intraveineuse environ 30 min avant l'induction de l'anesthésie, afin de réduire le stress associé à la procédure qui à son tour réduit les niveaux de cortisol.
- Administrer le diazépam (Diazepam 5 mg / ml) 20 mg, la kétamine (Ketalar 100 mg / ml) 05.04 mg / kg et de propofol (10 mg de propofol / mL) de 0,5 à 1 mg / kg par voie intraveineuse pour induire une anesthésie générale.
- Insérer un cathéter d'échange des voies respiratoires dans la trachée en utilisant un laryngoscope avec une lame de type Wisconsin (extra-longues de 350 mm Gauchers lame) pour faciliter l'intubation avec. Faites glisser la sonde endotrachéale de silicium (diamètre de 9 à 12 mm Intérieur) hors du cathéter d'échange des voies respiratoires et dans la trachée. Cette technique facilite le processus d'intubation. Gonfler le ballonnet de la sonde endotrachéale avec soin pour éviter une ulcération de la trachée induite par la pression et fixer le tube à la tête de la brebis.
- Branchez la sonde endotrachéale au circuit respiratoire de l'appareil d'anesthésie et de commencer immédiatement la ventilation mécanique. Réglez les paramètres de ventilation pour maintenir un P a CO 2 dans les limites normales de 35 à 45 mmHg.
- Insérer un cathéter dans l'artère auriculaire (22 à 20 g; 1 dans [0,9 x 25 mm] à 1,16 dans [1,1 x 30 mm]) et se connecter à tube non conforme à surveiller directement la pression artérielle.
- Utilisez un moniteur physiologique multi-paramètre à enregistrer l'électrocardiogramme, pression artérielle directe, la saturation en oxygène (SpO 2), la capnographie (P ET CO 2), et la température toutes les 5 min. Transférer tout physiologic données via un câble série à un ordinateur central de recueil des données physiologiques. Maintenir la température normale du corps en utilisant une couverture à circulation d'eau.
- Administrer une solution de poly-ionique équilibrée à 10 mL / kg pour la première heure de l'anesthésie générale, puis de réduire à 5 ml / kg / h.
- Administrer triméthoprime-sulfadoxine 5 mg / kg IV de la brebis juste avant l'incision de la peau que l'antibioprophylaxie.
- Utilisez des techniques aseptiques en standard avec toutes les manipulations chirurgicales de la brebis et le fœtus.
- Barrière infirmière les brebis à tout moment. Cela inclut également le personnel non-chirurgicales. Cela permettrait de minimiser le potentiel pour enzootique par exemple, Coxiella burnetii. Utiliser des gants et des masques N-95 (type) en tout temps.
2. Présentation de la procédure chirurgicale
- Faire une incision médiane de 20 cm à travers la paroi abdominale inférieure immédiatement crânienne à la mamelle par le biais de la ligne blanche pour minimiser les dommages des muscles abdominaux.
- Retract grand épiploon crânienne et les cornes utérines sont palpés manuellement. Palper chaque corne du corps de l'utérus à la pointe de la corne de remarquer le nombre de fœtus et de leur taille. Si il ya plus d'un fœtus, choisir le plus grand fœtus en évaluant manuellement la taille de la tête et la largeur entre les orbites.
- Maintenir la tête du fœtus choisi fermement dans l'utérus partiellement extériorisé. Effectuer un 10 cm hysterotomy sur la grande courbure avec des ciseaux de Metzenbaum. Mettez immédiatement au-dessus de la tête un gant chirurgical stérile sans latex rempli de solution saline stérile comme si elle était un coup de main. Sinon, utilisez 4x4 humides de garder la tête fœtale humide. Fixez l'utérus à la paroi abdominale.
- Extérioriser les droites et gauches membres thoraciques et tirez doucement le foetus de l'utérus jusqu'à l'appendice xiphoïde.
- Insérez cathéters de polyvinyle dans la droite et brachial gauche veine et les artères en utilisant une technique de coupe-bas standard. Insérez another polyvinylique cathéter dans la cavité amniotique fixateur par son extrémité sur le sternum du fœtus.
- Utilisez cathéters stériles seulement. Nous recommandons la stérilisation de gaz dans votre installation standard. Attacher chaque cathéter à une aiguille et l'aiguille à une double robinet d'arrêt pour permettre le prélèvement de sang ou plus tard surveillance de la pression.
- Suturer électrodes en acier inoxydable pour le manubrium, pointe du sternum et à chaque point de l'épaule pour surveiller l'électrocardiogramme (ECG).
- Retour du fœtus dans l'utérus. Tous les cathéters et les électrodes de sortie via une petite incision dans le flanc gauche.
- Fermez la laparotomie utilisation d'une fermeture à trois couches. Suturer la paroi abdominale avec un monofilament synthétique résorbable suture USP 2 en mode continu simple. Fermez l'espace sous-cutanée avec un synthétique résorbable tressée USP 0 en mode continu simple. Utilisez chirurgicales agrafes en acier inoxydable pour fermer l'incision de la peau.
- Retirer la laine en rasant le processus xiphoïde à la glande mammaire et le long du pli du flanc de chaque côté avec une lame # 40. Nettoyer l'abdomen ventral puis à fond avec un gluconate de chlorhexidine à 4% et une brosse douce pendant 3 min.
- Effectuez un gommage stérile standard avec le gluconate de chlorhexidine 4% à partir du centre de l'abdomen et de progresser de manière centrifuge pendant 3 min. Verser une solution saline stérile sur l'abdomen pour enlever le savon désinfectant. Pour l'étape finale de la préparation chirurgicale, effectuer trois passages alternés de solution de gluconate de chlorhexidine à 2% et de l'alcool isopropylique à 70%.
- Vérifiez que la profondeur de l'anesthésie est adéquat avant l'incision. Faire une incision laparotomie norme de l'ombilic à juste crânienne à la mamelle par le biais de la ligne blanche pour minimiser les dommages des muscles abdominaux.
- Insérez une longue pince éponge dans l'abdomen le long de la paroi abdominale gauche jusqu'àà la position de sortie prévue pour les cathéters dans la région paracostal.
- Poussez les conseils de la pince contre le mur jusqu'à ce qu'un assistant peut localiser et confirmer le site approprié. Ouvrez légèrement (1 cm) les mâchoires de la pince et laissez l'assistant faire une incision de 2 cm d'épaisseur totale.
- Extérioriser les conseils de la pince dans l'incision, ouvrir à nouveau, et de saisir délicatement les cathéters avec la pince qui est finalement sorti de l'abdomen à travers l'incision abdominale ventrale. Fait à noter, certains groupes implanter les cathéters et extériorisent eux. Ceci présente l'inconvénient que intraoperatorie surveillance ECG foetal est impossible.
- Palper l'utérus pour déterminer la position et le nombre foetal. Déterminer le fœtus plus grand en utilisant la distance inter-auriculaire. Inciser la paroi utérine sur la grande courbure dessus du dos de la tête, en évitant les cotylédons.
- Insérez une canule émoussée à travers les membranes placentaires pour obtenir une améchantillon de fluide niotic sans hémorragie. Inciser les membranes placentaires l'aide de ciseaux.
- Extérioriser la moitié du crâne du foetus à travers cette incision. Placez un gant en latex non chirurgical stérile rempli de solution saline stérile à 37 ° C sur la tête du fœtus pour aider à maintenir la normothermie.
- Lors du retrait de la partie supérieure du corps du foetus de l'utérus, ont l'assistant de tenir le haut de l'Babcock pour éviter la perte de liquide amniotique. Puis, en utilisant de nouveau la pince Babcock, serrer les membranes fœtales et paroi utérine de la peau pour prévenir la contamination abdominale avec le liquide amniotique.
- Exposer seules les parties du corps du foetus qui doivent être instrumenté et de garder les autres parties à l'intérieur de l'utérus ou couvertes par des tissus stériles chaudes et humides (37 ° C), respectivement.
- Enlever les deux membres thoraciques pour faciliter l'exposition de l'artère brachiale et la veine bilatéralement. Inciser le long de la face interne des deux antebrachium et les soinsdisséquer entièrement autour de l'artère brachiale et la veine.
- Insérez cathéters de polyvinyle dans le droit et les artères brachial gauche et le brachial gauche veine en utilisant une technique de coupe-bas standard.
- Libérer le navire à être sondé de tissus adjacents de plus de 1 cm. Ligaturer la partie distale du récipient avec une suture absorbable synthétique 2-0 USP tressé. Preplace une ligature à la partie proximale du navire, mais le garder déliée.
- Avec des ciseaux Castroviejo, couper transversalement le navire à environ 30% de son diamètre. Arrêter l'écoulement de sang partiellement en tirant sur le fil de suture proximal. Insérer le cathéter dans une direction proximale.
- Insérez le polyvinyle cathéter jusqu'à 8 cm proximalement ou jusqu'à ce que la résistance est détectée puis tirez légèrement vers l'arrière. Fixer temporairement l'aspect proximal du cathéter à l'aide d'une pince vasculaire. Placer un autre fil de suture à la fois autour de l'aspect proximal et distal du cathéter. Un assistant est en permanence aspirating et rinçage du cathéter pour assurer la perméabilité du cathéter.
- Fermez la peau du fœtus en utilisant une suture tressée synthétique résorbable USP 2-0, avec un motif de suture continue.
- Libérer le navire à être sondé de tissus adjacents de plus de 1 cm. Ligaturer la partie distale du récipient avec une suture absorbable synthétique 2-0 USP tressé. Preplace une ligature à la partie proximale du navire, mais le garder déliée.
- Pour le droit et l'épaule gauche, manubrium et le processus xiphoïde, fixer une électrode en acier inoxydable isolé pour faciliter la surveillance de l'ECG foetal.
- Suturer la pression amniotique et l'échantillonnage cathéter au sternum. Ce cathéter est fenêtrée à son extrémité.
- Fixez tous les cathéters sur le dos du fœtus en utilisant une tresse matériel de suture absorbable USP 2-0 synthétique.
- Avant le remplacement du foetus dans l'utérus avant, le clenbutérol administrer 30 pg lentement IV plus de 15 min pour éviter une hypotension et pour fournir la relaxation de l'utérus.
- Suturer les membranes foetales utilisant USP 4-0 matériau tressé de suture absorbable synthétique avec un motif continu. Incorporer un seul cathéter ou électrode à la fois dans les closure pour assurer une fermeture étanche. Utilisez un modèle à double couche de Cushing en respectant les principes Halsted pour fermer la couche musculaire de l'utérus en utilisant un matériau de suture USP 0 tressé synthétique résorbable. Enterrer soigneusement les noeuds chirurgicaux.
- Utilisation d'un modèle de suture en bourse, sécuriser tous les cathéters et les câbles ECG à leur sortie de l'incision paracostal gauche.
- Utilisation d'un monofilament synthétique matériel de suture absorbable USP 2 sécuriser la ligne blanche avec un motif continu. Fermez les tissus sous-cutanés utilisant USP 2-0 tressé matériel de suture absorbable synthétique avec un motif continu. Fixez la couche de la peau avec des agrafes chirurgicales.
- Administrer 250 mg d'ampicilline par voie intraveineuse et à nouveau via le cathéter amniotique dans la cavité amniotique. Remplacez les liquides amniotiques perdus avec une solution saline chaude.
- Placez tous les cathéters extériorisés et électrodes ECG dans un endroit sac pour maintenir la stérilité. Placez un jersey autour du torse de la brebis pour sécuriser toute la une de cathétersélectrodes D du corps de la brebis.
- Arrêtez anesthésie générale, et l'extubation la brebis fois réflexes laryngés sont revenues à la normale.
- Retour à la brebis à une cage métabolique, une fois qu'elle est stable après une anesthésie générale. La brebis résidera dans la cage métabolique pendant toute la durée de l'expérience. La brebis doit être capable de se tenir debout, se coucher et manger ad libitum tout en surveillant le fœtus non-anesthésiés sans sédatif la mère.
- Pour les trois jours suivants, administrer des antibiotiques à titre prophylactique pour la brebis (triméthoprime sulfadoxine 5 mg / kg) et le fœtus (250 mg d'ampicilline par voie intraveineuse et à nouveau via le cathéter amniotique).
- Évaluer l'état métabolique des deux brebis et le foetus en utilisant analyses de sang gaz.
- Rincez tous les cathéters avec le volume minimal de solution saline héparinée possible. Attention - Ne pas dépasser la dose quotidienne de l'héparine et fluides admissible pour le fœtus. Il est possible de surcharger le fluide fœtus. Rincer une fois lentementune journée ~ 5 ml de NaCl par ligne après une prophylaxie antibiotique.
- Pendant l'opération, éventuellement enregistrer les taux de l'ECG et cardiaques maternels et fœtaux ainsi que la mère de la pression artérielle et de la pression des voies aériennes (Paw) en continu (figure 1). Utilisez la fenêtre Moniteur vie pour acquérir toutes les données ECG maternels exception. Flux ces données dans le convertisseur analogique-numérique avec des signaux ECG foetaux et maternels; passer ECG maternelle et fœtale abord dans 1 901 pré-amplificateur. Enregistrer et afficher toutes les données dans le logiciel du fabricant.
- Il suffit mL de l'échantillon 1 artérielle simultanément à partir de la brebis et le foetus pour l'analyse des gaz du sang artériel, le lactate, le glucose et l'excès de base détermination (dans le plasma) en commencer de la chirurgie fœtale (immédiatement après l'insertion du premier cathéter artériel) et après la fermeture de l'utérus .
- Lors de la récupération post-opératoire, prendre un 3 mL de l'échantillon de sang fœtal pour mesurer l'IL-6 et de TNF-α Inflammprofils toires. Centrifuger le plasma à 4 ° C (4 min, 4000 g), transférer et stocker le plasma à -80 ° C pour les tests ELISA ultérieure.
Note: Pour l'application des résultats représentatifs rapportés, six jours après la chirurgie, les animaux ont été sacrifiés en utilisant une injection intraveineuse de pentobarbital de sodium 20 mL. La croissance fœtale a été évaluée par le corps, le cerveau, le foie et le poids maternels. La durée de la période expérimentale varie évidemment en fonction du design choisi pour la question de recherche particulière, et peut atteindre ~ 6 semaines.
- Déterminer les concentrations de cytokine (IL-6, TNF-a) dans le plasma en utilisant un sandwich à-spécifique ovine ELISA. Des anticorps anti-mouton monoclonaux pré-couche souris (capture anticorps IL-6) ou anticorps monoclonal de souris anti-bovine (TNF-α) à une concentration de 4 pg / ml sur la plaque ELISA à 4 ° C pour O / N, après 3 fois laver avec du tampon de lavage (0,05% de Tween 20 dans du PBS, du PBST).
- Bloquer les plaques pendant 1 h avec 1% de BSA dans du PBST. Laver les plaques avec du tampon de lavage 3 fois.
- Utilisez des protéines recombinantes de moutons (IL-6, TNF-a) en standard ELISA, préparer un dilutions en série vont de la norme 1 de 2000 ng / ml à la norme 7 de 31,25 pg / ml.
- Charge 50 pi de normes de protéines diluées en série et échantillons par puits et incuber pendant 2 heures à température ambiante, laver les plaques 3 fois. Exécuter toutes les normes et les échantillons en double.
- Appliquer 50 pi d'anticorps polyclonaux de lapin anti-mouton (anticorps de détection IL-6) ou le lapin anticorps polyclonal anti-bovine (TNF-a) à une dilution de 1: 250 dans des puits et incuber pendant 30 min à température ambiante. Laver les plaques avec le tampon de lavage 5 fois.
- Ajouter 50 ul de la chèvre anti-lapin conjugué IgG-HRP (dilution 1: 5000) pendant 30 min.
- Incuber avec 50 ul de solution de substrat TMB par puits.
- Arrêtez couleur réaction de développement au moment désiré avec 25 pi de 2 N d'acide sulfurique.
- Lire la plAtes sur lecteur de plaque ELISA à 450 nm, avec une correction de longueur d'onde 570 nm.
Remarque: Au cours de nos essais, la sensibilité du test ELISA d'IL-6 était de 16 pg / ml, la sensibilité du test ELISA de TNF-a était de 13,9 pg / ml, respectivement. Pour tous les essais, les intra-dosage et inter-dosage coefficients de variance a été <5% et <10%, respectivement.
Remarque: Les méthodes statistiques exacts dépendront de la question de recherche. Nous rapportons ici les méthodes utilisées pour tester les différences significatives dans les gaz du sang présentés dans le tableau 2.
- Testez la distribution normale des données en utilisant le test de Kolmogorov-Smirnov suivie par des tests paramétriques ou non paramétriques avec ajustement pour les comparaisons multiples, le cas échéant.
- Utilisez K-moyens d'analyse de cluster pour identifier les fœtus dans la cohorte qui étaient spontanément hypoxique et de déterminer le Pô 2 et O 2 valeurs Sam respectifs (considérer M 2 <20 mmHg ou O 2 Sam <55% fetal hypoxie). 44-48
- Utilisez un logiciel statistique comme SPSS pour les analyses.
- Présenter les données sous forme de moyenne ± écart-type avec des différences statistique à p <0,05 considéré comme significatif.
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Representative Results
38 brebis de temps datée enceintes ont été instrumentés à 128 ± 2 jours de gestation (DGA, ~ 0,88 gestation, terme 145 DGA) avec artérielle, veineuse et cathéters amniotique et l'électrocardiogramme (ECG) électrodes avec une technique stérile sous anesthésie générale (deux brebis et le fœtus ). En cas de grossesse gémellaire le plus grand fœtus a été choisi sur la base de la palpation et estimer le diamètre intertemporelle; alternativement, le fœtus doit être instrumenté peut être choisi au hasard pour éviter tout biais potentiel ou les deux fœtus peut être instrumenté. La durée totale de la procédure était de 124 ± 27 min. La partie du haut du corps du fœtus à être instrumenté est resté hors de l'utérus pour 92 ± 19 min. La plupart des brebis étaient instrumentés animaux F2. Leur barrage était F1 (Border Leicester * Romanov) et le père était un bélier Hampshire; ils ont été croisés de la manière suivante: Hampshire (50%) - Border Leicester (25%) - Romanov (25%) = HABLRV.
Représentant maternelle et physiologique du foetuscaractéristiques pendant la chirurgie et l'instrumentation sont présentés dans la figure 1 et étaient dans la norme physiologique pour l'âge gestationnel du fœtus et du comportement maternel pendant l'anesthésie.
Poids maternels en moyenne 75 ± 11 kg et 21 sur 38 des jumeaux menées (soit, à un taux de 1,6 ± 0,5). Au moment de l'autopsie (134 ± 3 DGA), parmi les fœtus singletons instrumentés pesé 4,090 ± 800 g, alors que le poids de jumeaux était inférieure à 3300 ± 740 g (p = 0,003). Le poids de jumeaux instrumentés à 3300 ± 670 g était similaire au poids des jumeaux instrumentés (p = 0,78). 18 des fœtus instrumentés étaient des femmes et 20 étaient de sexe masculin.
La dynamique de artérielles fœtale gaz sanguins, la glycémie et de l'acide-base le statut pendant la chirurgie et la récupération post-opératoire sont présentés au tableau 1. Nous avons observé une reprise progressive de l'état acide-base fœtal et une détérioration modérée de l'oxygénation avec peu de changement en glucose et les électrolytes de jours post-opératoires 1 à 3. Notamment, le jour post-opératoire 3, 42% des foetus ont été trouvés à être spontanément hypoxique PO 2 artérielle 11 mmHg de O 2 et sam de 28%. Fœtale Po Le cluster normoxique 2 était centré à 22 mmHg et O 2 sam à 56%. Foetus jumeaux ne sont pas plus que les fœtus uniques hypoxique (p = 0,26).
Artérielle fœtale IL-6 ELISA rendu des valeurs en dessous du seuil de sensibilité de 16 pg / ml pendant toute la période de récupération post-opératoire. De même, les taux de TNF-α sont également restés inchangés et très faible à 29 pg / ml avec ~ 30% des animaux présentaient également des valeurs inférieures au seuil de sensibilité de 13,9 pg / ml pendant toute la période de récupération post-opératoire.
Figure 1. surveillance maternelle et fœtale intraoperatorie. FHR, cardiaque fœtal taux in battements par minute (bpm); fECG, électrocardiogramme foetal (V); PAW, pression positive maternelle (mmHg); PSAM, la mère de la pression artérielle (mmHg); MHR, la fréquence cardiaque maternelle (bpm); mECG, ECG maternel (V). L'axe des X est l'échelle de temps dans les hh: mm:. Ss S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. spontanée hypoxie et le poids corporel du foetus. Aucune relation entre le poids corporel du foetus et PO 2 artérielle au jour post-opératoire 3 a été détecté (Spearman R = 0,326, p = 0,161). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure .
| Source de lumière ACE | Schott-Fostec | ||
| Disséquer des ciseaux | Beaux Science Tools | 14060-11 | |
| Ciseaux de dissection angulaires | Beaux Science Tools | 15006-09 | |
| Poignée de scalpel | Beaux Science Tools | 10003-12 | outil de dissection alternatif |
| Lames de scalpels courbes n ° 12 | Beaux Science Tools | 10012-00 | outil de dissection alternatif |
| Ciseaux osseuses | Beaux Science Tools | 16044-10 | |
| S & T suture attachant forceps | Beaux Science Tools | 00272-13 | |
| Pince Dumont SS - angulaires | Beaux Science Tools | 11203-25 | |
| Soie tressée taille de suture 6-0 | Teleflex Medical | 07 -30 - 10 | |
| Bande médicale | Transpore | 3M | |
| Chlorhydrate de kétamine 100 mg / ml | Hospira | NDC 0409 - 2051 - 05 | Est-finale est de 80 mg / kg |
| Tranqui Ved injection (xylazine 100 mg / ml) | Vecdo | NDC 50989 - 234 - 11 | Est-finale est de 10 mg / kg |
| L'orange réactif 14 | Sigma - Aldrich | R - 8254 | |
| Composants de la solution de Ringer | Solution est le gaz équilibrée avec 95% O2 et 5% de CO2, pH final 7.4 | ||
| Chlorure de sodium | Sigma - Aldrich | S7653 | Concentration finale: 118 mM |
| Chlorure de potassium | Fisher Scientific | P217 - 3 | La concentration finale: 4,7 mM |
| Chlorure de calcium dihydrate | Fisher Scientific | C79 - 500 | La concentration finale: 2,5 mM |
| Phosphate de potassium monobasique | Fisher Scientific | P -285 | La concentration finale: 1,2 mM |
| Sulfate de magnésium | JT Baker | Jan-00 | Concentration finale: 0,57 mM |
| 4- (2-hydroxyéthyl) pipérazine-1-éthanesulfonique (HEPES) | Fisher Scientific | BP 310-500 | Concentration finale: 5,95 g / L |
| Glucose | Sigma - Aldrich | G8270 | Concentration finale: 5,5 mM |
| LifeWindow | Digicare technologie biomédicale | ||
| DEC bioamplifier et ADC unités | Cambridge électronique Design Limited, Unité 4, Science Park, Milton Road, Cambridge CB4 0FE ANGLETERRE. | <td> BioAmp: 1902; ADC: micro1401; Logiciel d'acquisition de données: de Spike 2, V7.13 ||
| Neurolog signaux analogiques bioamplifier | Digitimer Ltd 37 Hydeway Welwyn Garden City Hertfordshire, AL7 3BE, Angleterre | NL108A | |
| ABL800Flex | Radiometer Canada; 200 Aberdeen Dr, London, ON N5V 4N2 | ||
| Eppendorf 5804R | Eppendorf Canada; 2,810 Argentia Road, n ° 2 Mississauga, Ontario, L5N 8L2 | ||
| Flèche jugulaire cathétérisme Set | Arrow International, Inc., 2400 Bernville Road, Reading, PA 19605 USA | ||
| Atravet | 10 mg / ml | ||
| Diazepam | 5 mg / ml | ||
| La kétamine | Ketalar | <td> 100 mg / ml | |
| Propofol | 10 mg / ml | ||
| Surgivet | Tubes endotrachéaux; Smiths Medical ASD, Inc. St. Paul, MN 55112, USA | ||
| Cuire Airway cathéter d'échange avec les adaptateurs RAPI-FIT | Cuire Critical Care 750, Bloomington IN 47402-0489 USA | ||
| Dispomed Ventilateur | Dispomed Ltée, 745 Nazaire-Laurin, Joliette, Québec J6E 0L6 | ||
| BD Insyte-W | Becton Dickinson, Infusion Therapy Systems Inc., 9450 S State St, Sandy Utah 84070 USA | 22-20 G; 1 dans [0,9 x 25 mm] à 1,16 dans [1,1 x 30 mm] | |
| Edwards Lifesciences Réf: kit de surveillance de la pression PX272 avec TruWave pression jetable | |||
| LifeWindow LW6000 | Digicare Biomédical technologie 107 Commerce Road, Boynton Beach, FL 33426-9365 USA | ||
| Gaymar | |||
| Babcock | |||
| Cathéters de polyvinyle | SCI (scientifique Commodities Inc.) | 2 mètres | |
| 2-0 Vicryl | |||
| Ciseaux de Castroviejo | |||
| électrocardiogramme (ECG) | LifYY, Metrofunk Kabel-Union, Berlin, Allemagne | quatre électrodes en cuivre à gaine unique, 2 mètres | |
| 2-O Vicryl | |||
| 3-0 Vicryl | |||
| PDS II USP | |||
| Sulfadoxine triméthoprime | |||
| Ampicilline | |||
| Robinet d'arrêt | Argon médicale, Cat 041220001A | Double Robinet 4 voies avec luer lock mâle | |
| Aiguilles | Tyco Healthcare 8881202389 | Moyeu en aluminium Monoject aiguilles émoussées, 22Gx, 0.7mmx 38,1 mm: pour artérielle fœtale et cathéters veineux | |
| Aiguilles | Tyco Healthcare 8881202322 | Moyeu en aluminium Monoject aiguilles émoussées, 16Gx, 1.6mmx38.1mm: pour les cathéters amniotiques |
Tableau 1. spécifique Réactifs / équipement.
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Tableau 2. aperçu complet des fœtus des gaz du sang, des métabolites et des électrolytes pendant la chirurgie et la récupération post-opératoire. Sanguin artériel fœtal pH, la PCO 2 (mmHg), PO 2 (mmHg), la saturation en oxygène (O 2 Sam%), du glucose (mg / dL), lactate (mmol / L) et de l'excès de base (mmol / L) à divers points de temps des périodes d'instrumentation et de récupération: le début de la chirurgie fœtale immédiatement après l'installation du premier cathéter artériel foetal (de l'utérus ouvert), la fin de la chirurgie fœtale (utérus Jours de fermeture), post-opératoires 1 à 3. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
L'anesthésique et les procédures chirurgicales sont présentés qui sont nécessaires à l'établissement d'un modèle animal pour l'étude de la physiologie et de la pathophysiologie du fœtus: le mouton fœtal non-anesthésié chroniquement instrumentés.
Quatre étapes critiques dans le protocole doivent être soulignés. Tout d'abord, passer les cathéters et les électrodes à travers le flanc maternelle: il est important que cela soit fait à la fois d'éviter les blessures des organes internes. Deuxièmement, le site de fixation d'exploitation avant l'extériorisation uterotomy le fœtus: ceci est essentiel pour prévenir ou minimiser la perte de liquide amniotique et suture subséquente de la membrane amniotique avant la fermeture de l'utérus. Troisièmement, le cathétérisme artériel: artères de fœtus de mouton sont environ 1-2 mm de diamètre et donc pas difficile de sonder pour un chirurgien expérimenté; une équipe de deux chirurgiens effectue meilleure et la plus rapide dans cette tâche qui permet de gagner du temps afin de minimiser la durée globale de la procédure. Quatrièmement, sec attentionurant et l'organisation de tous les cathéters et les électrodes dans la cavité amniotique avant de retourner le foetus dans l'amnios et la fermeture de l'utérus: cela permet d'éviter de tirer accidentelle des cathéters ou déchirer des électrodes ECG en raison de mouvements maternelles ou fœtales après la chirurgie.
Au lieu de l'approche présentée ici à sonder les navires brachial, la carotide ou vaisseaux fémoraux peuvent également être utilisés. Le choix dépend de l'approche globale de l'instrumentation qui à son tour sera dictée par la conception de l'étude. Il est recommandé de minimiser le temps le fœtus passe hors de l'utérus et de réduire au minimum la mesure dans laquelle le foetus doit rester en dehors de l'utérus pour être instrumenté. Ces considérations ont conduit au choix des navires instrumentés dans le "approche minimale" présenté. Nous vous recommandons de cathétérisme artères des deux côtés pour permettre intra-artérielle surveillance de la pression artérielle et le prélèvement de sang artériel sans interférence mutuelle à travers til expérimenter. Un avantage supplémentaire est la redondance fail-safe cette approche introduit: dans un cas, l'artère ne se bloqué pendant la période expérimentale, échantillonnage et de surveillance de pression sont possibles à partir du même navire avec l'inconvénient d'interrompre la surveillance après prélèvement sanguin est effectué.
Il existe trois limitations qui empêchent une adaptation plus large de ce modèle animal. Ces limitations peuvent être adressées par quelques modifications suggérées ci-dessous. Premièrement, il est l'exigence de niveau de biosécurité 2 accouchements dans certaines juridictions. Cela est dû à un risque pour Coxiella burnetii à partir d'infection chez les humains brebis gestantes avec un système immunitaire affaibli. 49,50 vaccination est disponible pour les animaux et les humains exposés à diminuer ce risque 51,52 et PCR tests peuvent être effectués pour garantir qu'aucune animaux positifs sont livrés à l'installation de la ferme de recherche. Une solution peut être de combiner la vaccination des animaux avec le test PCR multipless à la ferme à partir des prélèvements vaginaux effectués avant la reproduction commence, avant la livraison, puis de nouveau à partir du liquide amniotique pendant la chirurgie. Avec ces précautions, dans certaines juridictions, l'utilisation de moutons dans la recherche ne se limite pas comme il est dans d'autres. Deuxièmement, le coût par animal est dans la gamme inférieure à quatre chiffres, comparable à certaines souches de souris knock-out. Avec cela à l'esprit cependant, le gain d'information de chaque expérience de fœtus de mouton ne compare que des primates non humains en ce qui concerne la grande quantité de données qui peuvent être recueillies, les questions qui peuvent être posées et le potentiel de la traduction à la raison humaine au moment de la mise au point d'organes chez les ovins. Troisièmement, il ya la question de l'élevage et de la disponibilité des animaux au cours de certaines périodes de l'année seulement. Même avec un traitement hormonal, les résultats de la reproduction des moutons, comme le taux de grossesse et la vitalité des agneaux (fœtus) sont satisfaisants seulement quelques mois autour de saisons de reproduction naturels. 53 Ainsi, l'expérienceordonnancement al nécessite une planification minutieuse avec les années scindé en automne et au printemps saisons. Une solution peut consister à établir Septembre à Novembre et un dispositif expérimental «saisons de moutons 'Avril-Juin à-. Cette question est aussi une vertu, car elle permet de temps pour analyser les nombreuses données recueillies au cours de chaque saison expérimentale.
Il ya un certain nombre de facteurs qui contribuent à l'importance par rapport aux méthodes existantes. Les données morphométriques, cardiovasculaires et de gaz de sang présentés étaient dans la gamme pour les espèces 54,55 et ressemblent à ceux de l'espèce humaine 56, un avantage majeur de ce modèle animal. Une exception est le taux de grossesses multiples plus élevés par rapport à jumelage humaine. 57 Ce cependant est aussi une vertu du modèle, que l'étude des effets de l'élargissement à quatre voies sur le développement foetal est une tâche importante biomédicale. 55,58,59 Très faibles niveaux de poste -operative inflammation telle que mesurée par l'IL-6 et TNF-a ELISAscombiné avec récupération de l'état acide-base indiquent que l'instrumentation chirurgicale fœtale est bien toléré et la période de récupération post-opératoire de 72 heures est suffisante pour assurer un état initial stable du fœtus de mouton avant de commencer une expérience. Un pourcentage élevé de l'hypoxie chronique modérée spontanée dans foetus de mouton court terme les rend un modèle intéressant pour étudier les effets chroniques de l'hypoxie prénatale humaine et l'inflammation sur le développement foetal et périnatale, comme par exemple, RCIU, et les insultes périnatales, tels que l'inflammation et asphyxie aiguë. 60,61,62 Plusieurs modèles de moutons de RCIU sont utilisés, certains se fondant sur l'hypoxie spontanée, certains induisant par embolisation placentaire, par exemple. 16,63-66 D'autre part, une hypoxie sévère avant le début d'une expérience peut être aussi un critère d'exclusion dans les cas où, par exemple, les systèmes cardiovasculaire, nerveux ou centrales doivent être étudiés, comme ici les réponses des hypoxique chronique fœtus unere connu pour différer de ceux qui sont normoxique. 60 Une autre application importante est l'étude de l'impact du stress prénatal maternel sur le développement foetal et postnatal. 5,67 Enfin, comme on peut le voir dans les nombreuses publications citées avec ce modèle, l'instrumentation du fœtus peut être faite à travers un large éventail d'âges gestationnels allant de ~ 70 à 135 dGA correspondant à mi-gestation - les études à court terme du développement du fœtus. Avec l'avancement de l'âge gestationnel, l'instrumentation de la complexité de plus en plus sont possibles, mais les considérations de la durée de l'instrumentation chirurgicale besoin d'être mis en balance la nécessité d'obtenir un certain nombre d'enregistrements multivariées de la même fœtus.
Un certain nombre d'applications très prometteuses futures de la technique présentée est dérivé du nombre sans cesse croissant de réactifs de biologie moléculaire spécifique-moutons et récent séquençage du génome du mouton. Ces développements récents ont encore encouragé cette ANIMAL modèle soit une approche très prometteuse et puissant pour comprendre le développement du fœtus humain sain et pathologique à différentes échelles d'organisation, de (épi) génome à la physiologie intégrative. 68 69-74
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACE Light source | Schott-Fostec | A20500 | |
| Dissecting scissors | Fine Science Tools | 14060 - 11 | |
| Angled dissecting scissors | Fine Science Tools | 15006 - 09 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003 - 12 | alternating dissecting tool |
| Curved scalpel blades #12 | Fine Science Tools | 10012 - 00 | alternating dissecting tool |
| Bone scissors | Fine Science Tools | 16044 - 10 | |
| S & T suture tying forceps | Fine Science Tools | 00272 - 13 | |
| Dumont SS forceps - angled | Fine Science Tools | 11203 - 25 | |
| Braided silk suture size 6-0 | Teleflex Medical | 07 - 30 - 10 | |
| Medical Tape | transpore | 3M | |
| Ketamine hydrochloride 100 mg/ml | Hospira | NDC 0409 - 2051 - 05 | Final Does is 80 mg/kg |
| Tranqui Ved Injection (xylazine 100 mg/ml) | Vecdo | NDC 50989 - 234 - 11 | Final Does is 10 mg/kg |
| Reactive orange 14 | Sigma - Aldrich | R - 8254 | |
| Ringers Solution Components | Solution is gas equilibrated with 95% O2 and 5% Co2, final pH 7.4 | ||
| Sodium chloride | Sigma - Aldrich | S7653 | Final Concentration: 118 mM |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217 - 3 | Final Concentration: 4.7 mM |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | C79 - 500 | Final Concentration: 2.5 mM |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | P -285 | Final Concentration: 1.2 mM |
| Magnesium sulfate | J.T. Baker | Jan-00 | Final Concentration: 0.57 mM |
| 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | BP 310 - 500 | Final Concentration: 5.95 g/L |
| Glucose | Sigma - Aldrich | G8270 | Final Concentration: 5.5 mM |
| LifeWindow | Digicare Biomedical Technology | ||
| CED bioamplifier and ADC units | Cambridge Electronic Design Limited, Unit 4, Science Park, Milton Road, Cambridge CB4 0FE ENGLAND. |
Bioamp: 1902; ADC: micro1401; Data acquisition software: Spike 2, V7.13 | |
| Neurolog analog signal bioamplifier | Digitimer Ltd 37 Hydeway Welwyn Garden City Hertfordshire, AL7 3BE, England |
NL108A | |
| ABL800Flex | Radiometer Canada; 200 Aberdeen Dr, London, ON N5V 4N2 | ||
| Eppendorf 5804R | Eppendorf Canada; 2810 Argentia Road, #2 Mississauga, Ontario, L5N 8L2 |
||
| Arrow Jugular Catheterization Set | Arrow International, Inc., 2400 Bernville Road, Reading, PA 19605 USA | ||
| Atravet | 10 mg/ml | ||
| Diazepam | 5 mg/ml | ||
| Ketamine | Ketalar | 100 mg/ml | |
| Propofol | 10 mg/ml | ||
| SurgiVeT | Endotracheal Tubes; Smiths Medical ASD, Inc. St. Paul, MN 55112, USA | ||
| Cook Airway Exchange Catheter with RAPI-FIT Adapters | Cook Critical Care 750, Bloomington IN 47402-0489 USA | ||
| Dispomed Ventilator | Dispomed Ltd., 745 Nazaire-Laurin, Joliette, Quebec J6E 0L6 | ||
| BD Insyte-W | Becton Dickinson, Infusion Therapy Systems Inc., 9450 S State St, Sandy Utah 84070 USA | 22 to 20 G; 1 in [0.9 x 25 mm] to 1.16 in [1.1 x 30 mm] | |
| Edwards Lifesciences Ref: PX272 Pressure monitoring kit with TruWave Disposable Pressure | |||
| LifeWindow LW6000 | Digicare Biomedical Technology 107 Commerce Road, Boynton Beach, FL 33426-9365 USA | ||
| Gaymar | |||
| Babcock | |||
| Polyvinyl catheters | SCI (Scientific Commodities Inc.) | 2 meters | |
| 2-0 Vicryl | |||
| Castroviejo scissors | |||
| electrocardiogram (ECG) | LIFYY, Metrofunk Kabel-Union, Berlin, Germany | four copper electrodes in single sheath, 2 meters | |
| 2-O Vicryl | |||
| 3-0 Vicryl | |||
| PDS II USP | |||
| Trimethoprim sulfadoxine | |||
| Ampicillin | |||
| Stopcock | Argon Medical, Cat 041220001A | Double 4-way Stopcock with male luer lock | |
| Needles | Tyco Healthcare 8881202389 | Monoject aluminum hub blunt needles, 22Gx, 0.7mmx 38.1mm: for fetal arterial and venous catheters | |
| Needles | Tyco Healthcare 8881202322 | Monoject aluminum hub blunt needles, 16Gx, 1.6mmx38.1mm: for amniotic catheters |
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