Vi har utvecklat en in vitro ovikt hippocampus som bevarar CA1-CA3 rad nervceller. Kombinerat med det penetrerande mikroelektroduppsättningen, kan neural aktivitet övervakas i både de längsgående och tvärgående riktningar. Denna metod ger fördelar jämfört hippocampus slice förberedelser som utbredning i hela hippocampus kan spelas in samtidigt.
Detta protokoll beskriver en metod för framställning av en ny i platt hippocampus vitro beredning kombineras med en mikrobearbetad array att kart neural aktivitet i hippocampus. Den tvärgående hippocampus slice preparatet är den vanligaste vävnadspreparat för att studera hippocampus elektrofysiologi. En longitudinell hippocampus slice utvecklades också för att undersöka longitudinella anslutningar i hippocampus. De intakta mus hippocampus kan också upprätthållas in vitro eftersom dess tjocklek ger tillräcklig syrediffusion. Men dessa tre preparat som inte ger direkt tillgång till neural förökning eftersom en del av vävnaden saknas eller vikas. Ovikt intakta hippocampus ger både tvärgående och längsgående förbindelser i en platt konfiguration för direkt åtkomst till vävnaden för att analysera den fulla omfattningen av signalutbredning i hippocampus in vitro. För att effektivt övervaka neural aktivitet från tHan cellagret, en skräddarsydd penetrerande mikroelektrod array (PMEA) tillverkades och appliceras ovikt hippocampus. Den PMEA med 64 elektroder av 200 nm i höjd kunde spela in neural aktivitet djupt inne musen hippocampus. Den unika kombinationen av en ovikt hippocampus förberedelser och PMEA ger en ny in-vitro verktyg för att studera hastigheten och utbredningsriktning neural aktivitet i de tvådimensionella CA1-CA3 regioner i hippocampus med en hög signalbrusförhållande.
Att förstå de neurala ledning eller förökning av neurala signaler är avgörande för bestämning av mekanismen för neurala kommunikation i både den normala funktionen och patologiska tillstånd i hjärnan 1-3. Hippocampus är en av de mest omfattande studerade strukturer i hjärnan, eftersom den spelar avgörande roll i flera funktioner i hjärnan såsom minne, och rumslig spårning och är inblandad i flera patologiska förändringar som dramatiskt påverkar beteende samt 1,6. Även hippocampus uppvisar en komplex organisation, kan de olika delarna av dess struktur lätt identifieras och nås i slice beredningen 4-6. I tvärriktningen av hippocampus, är neural aktivitet kända för att utbreda sig genom tri-synaptisk bana som innefattar dentate gyrus (DG), CA3, CA1 andsubiculum 4,5. Man tror att synaptisk transmission och axonal ledning spelar en stor roll för communicatipå i denna tvär kretsen 4,6. Men förökning av neurala signalen sker i både tvärgående och längsgående riktningar 4,6. Detta innebär att hippocampus inte kan utredas fullständigt med hjälp slice preparat som begränsar observation till en viss riktning utbrednings 4. Den longitudinella slice utvecklades för att undersöka axonal vägar längs den längsgående axeln 5. Forskare har observerat beteendespecifik gamma- och theta svängningar främst längs tvärgående och längsgående axlar respektive 6. Dessa beteenden har studerats separat, men ändå samtidig tillgång till båda riktningarna är avgörande för att förstå dessa beteenden. Även med utvecklingen av den intakta hippocampus preparat, är det svårt att övervaka utbredningen genom hela vävnaden på grund av den hopvikta strukturen i hippocampus 4. Ovikt hippocampus ger tillgång till de packade nervcelleri en form av en platt tvådimensionell cellskikt 7,8.
Genom utspelas gyrus dentatus (GD) (Figur 1), antar hippocampus en tillplattad form med en rektangulär form där både tvärgående och längsgående anslutningar förbli intakt med det pyramidala cellskiktet arrangerade i ett tvådimensionellt ark innehåller både CA3 och CA1, lämnar en platt bit av neural vävnad som kan användas för att undersöka neurala förökning (figur 2) 8. Neural aktivitet kan sedan följas med individuella glaspipetter, mikroelektrod arrayer, stimulerande elektroder, samt spänningskänsliga färgämnen (VSD) 3,7,8. Dessutom kan genetiskt kodad spänningsindikator från transgena möss användas för att spåra utbredningsmönster 9.
Den plana konfigurationen av det ovikta hippocampus nätverk är väl lämpad för optisk metod inspelning men också för en mikroelektrod array. MOST av de kommersiellt tillgängliga matriser är tillverkade med platt eller låg profil elektroder och kan spela in neural aktivitet i både vävnadsskivor och odlade nervceller 10-12. Emellertid, signal-till-brusförhållande (SNR) minskar när signalerna erhålles från en intakt vävnad eftersom soma av nervceller finns djupare in i vävnaden. Mikroelektrod elektrod arrayer med höga bildformat krävs för att förbättra SNR.
För detta ändamål har en genomträngande mikroelektrod array (PMEA) utvecklats i vårt laboratorium, och ger möjlighet att direkt söka i vävnaden genom att sätta 64 spikar med en diameter på 20 nm och höjd på 200 nm i ovikt hippocampus 7,13 . Denna mikroelektrod array har högre SNR jämfört med spänningskänsliga färgämne avbildning och SNR förblir stabil under ett experiment 7,13. Kombinationen av den ovikta hippocampus preparatet och PMEA ger ett nytt sätt att investeraiGate neurala utbredning över ett tvådimensionellt plan. Experiment som använder denna teknik har redan gett betydande resultat om mekanismerna för neurala signalutbredning i hippocampus vari neural aktivitet kan föröka oberoende av synaptiska eller elektriska synapser 7.
Utvecklingen av den ovikta hippocampus förberedelser, där de längsgående och tvärgående axlar hippocampus bevaras i kombination med en genomträngande mikroelektrod array, ger ett kraftfullt verktyg för att undersöka vilka samband anatomi eller neural förökning i hippocampus 7. Detta utspelas procedur gäller även för att studera hippocampus hos vuxna möss. Nyligen genomförda studier med detta preparat visade att 4-AP-inducerad epileptiform aktivitet skulle propagera med en diagonal vågfront ö…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by National Institutes of Health (National Institute of Neurological Disorders and Stroke) Grant 1R01NS060757-01 and by the E.L. Lindseth endowed chair to Dominique M. Durand. We thank Dr. Andrew M. Rollins’ laboratory for the help on the OCT imaging.
desiccator jar | LABRECYCLERS Inc. | 5410 | Place regular paper towels at the bottome of the jar for animal anesthesia use. |
A blade and Custome made surgical stage for unfolding hippocampus | N/A | N/A | A petri dish is place upside down (in the center) in the ice with a wet filter paper place on top of it. |
Custom made tissue recovery chamber | N/A | N/A | Plastic tubes were glued with plastic mesh at the bottom and bubbled with 95% O2/ 5% CO2 in the aCSF. |
Straight Operating Scissors | Fisher Scientific | S17336B Medco Instruments No.:81995 | This scissors is used to decapitate the mice. |
Integra Miltex Goldman-Fox Scissors | Fisher Scientific | 12-460-517 MILTEX INC No.:5-SC-320 | This scissors is used to cut the skull of the mice. |
Miltex Hysterectomy Forceps |
Claflin Medical equipment | CESS-722033-00001 | This Forceps is used to peel the cut skull to expose the brain |
Micro Spatula | Cardinal Health | This micro spatula is used to tranfer the whole brain of a semisphere into the recorering chamber. | |
Frey Scientific Stainless Steel Semi-Micro Spatula | Cardinal Health | this semi micro spatula is used to tranfer the unfolded hippocampus into the glucose aCSF in the recovering chamber. | |
small paint brush | Lowe's | tem #: 105657 Model #: 90219 | The one with the smallest size in a normal paint brush package |
Fire polished glass help tool | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes. |
Custom made glass needle | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes. |
Custom made glass tool with a metal wire loop | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes with a reshaped metal wire loop. |
Custom made glass solution dropper | N/A | N/A | This tool was made from the regular Pasteur glass pipettes with its tips cut and a rubber head attached with the cut end. |
Custom made tissue anchor | N/A | N/A | Nylon fiber mesh was glued on a insulated copper wire ring. The tissue anchor was hold by an micromanipulator. |
Custom fabricated microelectrode array | N/A | N/A | More detail about the array please refer to Kibler, et al, 2011. |
Custom made filter and amplifiers circuits for the array | N/A | N/A | More detail about the array please refer to Kibler, et al, 2011. |
Data acquisition processor 3400a | Microstar Laboratories | N/A | This is a complete data acquisition system with A/D converter. |