Summary
Här beskriver vi en optimerad och effektiv strategi borttagning för insamling av biologiska partiklar i "röra DNA" prov, tillsammans med en förbättrad förstärkningsprotokoll som involverar ett steg 5 pl mikrovolym lys / STR förstärkning, för att möjliggöra återvinning av kort tandem repeat (STR) profiler av bio-partikeln donator (s).
Abstract
DNA-profiler kan erhållas från "touch-DNA" bevis, som omfattar mikroskopiska spår av mänskligt biologiskt material. Nuvarande metoder för återvinning av spår DNA anställa bomullspinnar eller tejp för att prova ett område av intresse. Dock kommer en sådan "blinda-svabbar" -strategi co-prov cellmaterial från olika individer, även om individernas cellerna är belägna i geografiskt skilda platser på posten. Således några av de DNA-blandningar som uppstått i berörings DNA-prover är artificiellt skapas av svabbar själv. I vissa fall kan en offrets DNA hittas i betydande överskott därmed maskera eventuella gärningsmannens DNA.
För att kringgå de utmaningar med standardmetoder för återvinning och analys, har vi utvecklat en lägre kostnad, "smart analys" metod som leder till förbättrad genetisk analys av beröring DNA-bevis. Vi beskriver en optimerad end effektiv mikromanipulering återhämtningsstrategi för insamling av biologiska partiklar i kontakt DNA-prover, samt en förbättrad strategi förstärkning involverar ett steg 5 pl microvolume lys / STR förstärkning för att tillåta återvinning av STR-profiler från bio-partikeln donator (s). Användningen av enskilda eller få (dvs, "klumpar") biopartiklar ger möjligheten att få enstaka källprofiler. Dessa förfaranden representerar alternativa förbättrade tekniker för isolering och analys av enskilda biopartiklar från kriminaltekniska beröring DNA-bevis. Även om inte nödvändigt i alla rättsmedicinsk undersökning, kunde metoden vara till stor nytta för återvinning av en enda källa gärningsmannen DNA-profil i fall som rör fysisk misshandel (t.ex. strypning) som kanske inte är möjligt att använda standardanalystekniker. Dessutom de strategier som utvecklats här erbjuder en möjlighet att få genetisk information vid enstaka cellnivå från en mängd olika ofins icke forensic spår biologiskt material.
Introduction
Touch-DNA är en form av spår biologiska bevis som är direkt överföring av cellmaterial (t.ex. skjul hudceller) från en individ till ett objekt eller en annan individ under fysisk kontakt 1. Förmågan att få DNA-profiler från en mängd olika berörde objekt (dokument, sängkläder, skor, skjutvapen, dricka behållare, pennor, portfölj handtag) har rapporterats i litteraturen 2-9.
En kritisk faktor i analysen av beröring DNA-bevis är den lyckad återhämtning av spår biologiskt material närvarande. Peka DNA-bevis är vanligtvis samlas in av badda det misstänkta området med en steril bomullspinne (kallad "blinda-svabbar"). Med användning av detta tillvägagångssätt, är naturen av det insamlade biologiska materialet inte känd och provtagning av en generaliserad område utförs. Förekomsten av spår eller sprickor yta kan hindra framgångsrik återhämtning av ofta redan liten mängd bimiologiska material närvarande. Dessutom en "blind svabbar" tillvägagångssätt kommer nödvändigtvis samarprovcellmaterial från de olika individer vars celler är närvarande på objektet, även om individernas cellerna finns i rumsligt distinkta platser på posten. Återhämtningen av blandade DNA-profiler, som ofta är utmanande att lösa särskilt med låg mall DNA-prover, observeras ofta 8,10,11 och i många fall kommer att vara en följd artefakt av svabbar processen. Om endast en liten mängd material var närvarande från en av givarna, kan standard utvinning och analystekniker misslyckas med att återhämta sig en profil från mindre bidragsgivaren. Dessutom, vilken typ av kompress eller om det användes torr eller våt (pre-fuktad med sterilt vatten) kan påverka mängden biologiskt material som samlas in på grund av skillnader i absorptivitet och adsorptivitet och effektiviteten i frisättningen av det biologiska materialet 12. Standard utvinningsmetoder kan resultera i ytterligare provförlust på grund krävs fysisk manipulation av provet eller provöverföringssteg.
Som beskrivits ovan, kan enkla bomullstopp tekniker för återvinning av biologiskt material resultera i förlust av spårmängder av biologiskt prov samt en ökad förekomst av blandade profiler pågrund av en underlåtenhet att separera enskilda biologiska komponenter. Därför försökte vi utveckla mer selektiva och effektiva återhämtningsstrategier för insamling av cellulära mikropartiklar som finns på berört objekt. Den utvecklade strategin för analys av biologiskt material från beröring DNA-bevis (som här kallas "biopartiklar" på grund av det faktum att en kärna är inte alltid synlig eftersom en majoritet av de celler som finns i det yttre epidermal lagret av huden är döda eller döende keratinocyter 13) innebär följande: 1) insamling av biologiskt material (dvs biopartiklar) via gel-film frOm rörde föremål och ytor, slitna kläder poster eller direkt mänsklig hud, 2) mikroskopisk undersökning av det återvunna biologiskt material för att säkerställa uppbörden av potentiella humanbiologiskt material, och 3) mikromanipulering av enstaka eller några få bio-partiklar med hjälp av en vattenlösligt lim, och 4) autosomalt DNA-STR profilering av de insamlade biologiska partiklar med hjälp av en microvolume (5 pl) ett steg lys / amplifieringsreaktion.
Detta förfarande erbjuder många fördelar jämfört med traditionellt använda analysmetoder. Återvinning av biopartiklar som använder gel-filmen tillåter en mikroskopisk undersökning av det biologiska materialet som finns i provet före analys. Medan en majoritet av de utvunna från beröring DNA-bevis biopartiklar kanske inte är kärnförsedda celler vilket gör det svårare att avgöra vilka eller hur många biologiska partiklar bör väljas, den mikroskopisk undersökning av dessa prover före analys ger till möjligheten att söka efter kärnförsedda celler sålunda maximizing sannolikheten för DNA-profil återhämtning. Insamlingen av biopartiklar använder vattenlösligt lim assisterad mikromanipulation medger direkt överföring av riktade biopartiklar i reaktionsrören. Detta förfarande visualiseras under mikroskop för att säkerställa framgångsrik överföring av det biologiska materialet. Det reducerade eller microvolume reaktion ökar känsligheten samtidigt minska kostnaden för analys per prov. Detta möjliggör analys av ökat antal prover från en enskild bevis. På grund av intervallet i den genetiska tillstånd av bio-partiklar i kontakt DNA-bevis, är flera provtagningar från enskilda objekt rekommenderas.
Här visar vi en framgångsrik användning av de utvecklade protokoll för att få högt bevisvärde genetiska profiler av givarna av biologiskt material i kontakt DNA-bevis. De utvecklade bioparticle insamling och DNA profilering metoder ge en heltäckande "smart" (dvs, specifika, mätbara, attainable och realistiska) molekylär baserad strategi för karakterisering, analys och tolkning av spår biologiskt material. Medan ursprungligen utvecklades för applicering på kriminalteknisk analys av beröring DNA-bevis, kan de strategier som utvecklats här tillämpas på andra källor för biologiskt material och erbjuder en möjlighet att få individuell identifierande information på enskild cellnivå.
Protocol
OBS: Kroppsvätskor samlades in från frivilliga enligt förfaranden som godkänts av University of Central Florida Institutional Review Board. Informerat skriftligt samtycke erhölls från varje donator.
1. Insamling av biopartiklar från Touched föremål och ytor
- Skär gel-filmen till den önskade storleken. Se till att det är den lämpliga storleken för mikroskopobjektglas som används som den fasta bäraren. Till exempel för en 3 "x 1" glasskiva, använda en gel-film storlek på 2 "x 0,75".
NOTERA: Längden och bredden av materialet kan reduceras, om så önskas, men bör inte överskrida denna storlek. - Ta bort den vita uppbackning från gelén-filmen och fäst gel-filmen till objektglas (Figur 1A). Tryck ner ordentligt för att garantera en fullständig fastsättning.
OBS: Det finns en tydlig topp skyddande lager som inte bör tas bort så att trycket som skall tillämpas längs bit gel-film utan att förorena gel-filmytan. Beredd gel-film diabilder (med skyddsskikt fästs) kan förvaras i rumstemperatur tills det behövs. - Ta den klara toppskyddsfilmen från gel-filmen med sterila pincett när du är klar att använda (Figur 1B) gel-filmprov. Placera gelén-filmytan i direkt kontakt med den önskade berört objekt eller yta (figur 2). Applicera en liten mängd tryck för att säkerställa en effektiv överföring av bio-partiklar till gel-filmen.
OBS: Om för mycket tryck appliceras, kunde glasskiva sönder.
OBS: Flera provtagningar från samma objekt eller yta kan uppsamlas på samma stycke av gel-film. - Bekräfta överföringen av bio-partiklar på gelén-filmen (Figur 3) genom att placera bilden på ett stereomikroskop (trans- eller epi-belysning kan användas). Användning förstoring av ~ 20X för bästa visning större områden av gel-filmen, och förstoring av ~ 200X för bästa viEwing individuella bio-partiklar.
- Förvara gel-filmprovet slide vid rumstemperatur i en täckt glaskassett eller använd omedelbart för färgning och / eller bio-partikelsamling.
2. Valfri Färgning av biopartiklar till stöd i visualisering
- Placera gelén-filmprov slid framställd i steg 1 på ett objektglas-färgning rack över en vask.
- Med användning av en disponibel överföringspipett, täcker hela gelén-filmyta med trypanblått färgämne (Figur 4A). Inkubera vid rumstemperatur under 1 till 2 minuter.
- Avlägsna överflödigt fläcken genom att luta bilden för att låta fläcken rinna av i vasken (Figur 4B).
OBS: Bilden kan sköljas genom försiktig översvämningar med sterilt vatten med hjälp av en engångsöverföring pipett om det behövs (Figur 4C). - Låt bilden lufttorka innan du fortsätter till isolering av bio-partiklar. Visa bilden med hjälp av en stereomikroskop (~ 20X för övergripande visning och ~ 200-300X till view enskilda biopartiklar) för att säkerställa korrekt färgning (Figur 4D-E).
OBS: Bilden kan förvaras i rumstemperatur i en täckt glidlåda.
3. Isolering av biopartiklar besöksmål för analys
- Placera lämplig antal av 0,2 ml PCR-rör i ett ställ och märka rören på lämpligt sätt.
- Förbered STR förstärknings mix (se Material List) i ett särskilt PCR-amplifiering kåpa eller biosäkerhet skåp. Vortex mastermixen väl och kortfattat centrifugera i en mini-centrifug.
- Volymen av förstärknings mix som behövs per prov är 3,5 l; förbereda en lämplig volym av huvudblandning för önskat antal prover.
- Pipettera 3,5 l av förstärkningsblandningen i respektive 0,2 ml rör. Cap varje rör löst.
- Lägg en bit dubbelhäftande tejp på ett rent glas objektglas eller direkt på ett glasblock.
OBS: Detta kommer att användas för att hålla0,2 ml rör på plats under provtagning. - Lägg en bit dubbelhäftande tejp på en ren glasobjektglas. Placera en bit vattenlöslig våglödning tejpen ovanpå den dubbelhäftande tejp.
OBS: Denna släde kan lagras i en exsickator för framtida användning. - Placera den första 0,2 ml rör på den dubbelhäftande tejp slide eller blocket som framställts i steg 3.4. Ställ detta rör åt sidan tills provet samlas.
- Placera den vattenlösliga våglödning tejp slide under mikroskop (låg förstoring). Hjälp av spetsen på en volfram nål, försiktigt skrapa ytan av bandet för att samla in en liten mängd (eller "boll") av lim vid slutet av nålen (figur 5A).
OBS: Storleken på kulan kan göras liten eller stor beroende på antalet av biopartiklar som kommer att samlas in. - Försiktigt bort volfram nål med lim från under mikroskop utan att störa nålspetsen. Nålen kanvara rum i ett rack om så önskas under provplacering.
- Placera det framställda gelén-filmprov (från Steg 1 och 2) på mikroskop scenen. Justera fokus och förstoring tills biopartiklar lätt kan ses. Identifiera bio-partiklar som kommer att samlas in.
OBS: Ett glasblock kan användas för att stödja bilden om det behövs. - Hämta den volfram nål med självhäftande boll, och placera nålen över gel-filmytan där biologiska partiklar av intresse finns. Tryck på nålspetsen (med lim) nedåt så att det är i kontakt med den biologiska partikeln (Figur 5B). Lyft nålen upp för att säkerställa att bio-partikeln har samlats. Upprepa denna process tills önskat antal biologiska partiklar har samlats.
- Placera beredda 0,2 ml PCR-rör på mikroskop scenen. Justera förstoringen så att botten av röret som innehåller förstärkningen mix är i fokus.
- Försiktigt in volfram needle till 0,2 ml PCR-rör tills spetsen på nålen är i förstärkningsmixen.
OBS: Detta utförs bäst när du tittar i mikroskopet. - Håll nålen i förstärkningsmixen tills limmet löses och biopartiklar frigörs i lösning (Figur 5C). Ta bort nålen, placera de 0,2 ml upprätt och löst lock röret.
- Upprepa insamlingsförfarandet för ytterligare prover. Rengör volfram nål med pre-fuktad alkohol (isopropanol) stryker in mellan proven.
4. Kombinerad Microvolume nukleinsyraisolering (Direkt Lysis) och Autosomal Short Tandem Repeat (STR) Profilering
- Förbered lysbufferten (se Material) i en utsedd PCR-amplifiering kåpa eller biosäkerhet skåp. Lägg 1,5 ul av lyseringsbuffert till varje rör för en 5 | il total reaktionsvolym. Stäng tube lock tätt.
OBS: De 0,2 ml tuber innehåller redan 3,5 pl avförstärkning mix och uppsamlings biologiska partiklar från steg 3. - Placera proverna i termocyklern och amplifiera prover under användning av följande cykelbetingelser: 75 ° C under 15 min; 95 ° C under 11 min; 34 cykler av 94 ° C under 20 sek och 59 ° C under 3 min; 60 ° C under 10 min; och 4 ° C hold.
- Affär förstärkningsprodukter vid 4 ° C för korttidslagring.
5. Detection - kapillärelektrofores (CE)
- I en 96 brunnar, tillsätt 10 ìl av CE rinnande mix (9.7 l avjoniserat formamid och 0,3 pl storleksstandard, se Material). Lägg ett pl av amplifierad produkt eller allelisk stege till varje brunn.
VARNING: Formamid är en potentiell mutagen och bör hanteras i en kemisk huva iklädd lämplig personlig skyddsutrustning. - Använd elektro villkor som anges av tillverkaren i amplifieringskit manuell eller internally validerade förhållanden.
- Analysera rådata med STR analysprogram.
Representative Results
Representativa bilder av enskilda och hopklumpade biopartiklar som återvunnits från en skjortkrage (100% polyester) som bärs av en manlig donator visas i figur 6 (enskilda biopartiklar) och figur 7 (hopklumpade biopartiklar). De biopartiklar återvanns från skjortkrage användning av det protokoll som beskrivs här: överföring av biopartiklar från skjortkrage till gel-filmen genom direkt kontakt, färgning av återvunna biopartiklar med trypanblått, insamling av bioparticle prover med hjälp av en volfram nål och vattenlösligt lim och STR-analys med hjälp av 5 pl mikrovolym lys / STR förstärkning. Figurerna 6 och 7 representerar en typisk provtagning av biopartiklar som skulle analyseras ur ett individuellt beröring DNA post (20 enkel / enskilda biopartiklar och 20 hopklumpade biopartiklar). Den bioparticle (er) samlas i varje bild är märkta med längd och bredd mätningar (i mikron). PERCentage av STR alleler som återvunnits från var och en av de insamlade bioparticle (s) finns på varje enskild bild för att visa på de variabla grader av framgång som kan förväntas erhållas från biopartiklar med denna typ av bevis. De utvunna från beröring DNA-prover biopartiklar är i stort sett döda eller döende keratinocyterna och därför en bevis STR profil inte erhålles från varje insamlad bioparticle, såsom kan ses i figurerna 6 och 7. För denna skjortkrage prov, var STR-profiler som erhållits från 14/20 (70%) av de enskilda biopartiklar och 15/20 (75%) clumped biopartiklar. Dock varierar varje återvunna profiler i bevisvärde: 3-97% allelen återhämtning för enskilda biopartiklar profiler och 3-100% allel återhämtning för hopklumpade bioparticle profilerna. På grund av variationen i framgångsrika, är insamling av många biopartiklar från varje beröring DNA post rekommenderas. Detta säkerställer en bättre chans att få en mycket probative STR profil.
STR profil som erhålls från en av de individuella bioparticle prover från skjortkragen visas i figur 8 (den bioparticle från vilken profilen härstammar visas till vänster). Nästan en hel STR profil (28 av 30 alleler, en locus hoppar, noggrannhet den erhållna profilen verifieras genom jämförelse med en referensprofil) erhölls från denna person bioparticle. Den erhållna profilen är av hög kvalitet med någorlunda balanserade mellan locus topphöjder och ingen allela hoppar. Allelisk hoppar och obalanserade topphöjd artefakter är båda ofta observeras med låg mall DNA-prover. STR profil som erhålls från ett av de hopklumpade bioparticle prover från skjortkragen visas i fig 9. En full STR profil (30/30 alleler, noggrannhet hos den erhållna profilen verifieras genom jämförelse med en referensprofil) erhölls. Som tidigare nämnts, är en STR-profil inte återhämtat sig från allty bioparticle uppsamlades. Ett exempel på misslyckad DNA-profilering av en enda bioparticle (3% allel återhämtning, 30/01 alleler) visas i fig 10 (individuellt bioparticle). Även denna person bioparticle lyckades inte, var mycket bevisvärde STR profiler av givaren av biopartiklar i detta prov från andra biopartiklar återvunnits från samma prov. Detta illustrerar behovet av att utföra flera enda cell / klump provtagningar från samma objekt.
De utvecklade "smarta" analysmetoder som beskrivs här för beröring DNA-bevis har använts med framgång för att återställa bevisvärde enda källprofiler från singel och "hopklumpade" biopartiklar från olika berört objekt och kläder objekt (t.ex. stol armstöd, bil rattar, mobiltelefoner, kaffekoppar, cigaretter, pennor, skjortor, shorts och tröjor). Men viktigare är detta tillvägagångssätt har också använts för att upptäcka och profilering av manliga dPå eller DNA (enda källa) i simulerade fysisk kontakt / misshandel blandningen prover (t.ex. förövare gripa tag i en offrets handled, nacke eller kläder, eller kontakt med offrets strö som i sexuella övergrepp).
Figur 1: Beredning av gel-film diabilder för bioparticle samling. (A) Den vita tillbaka skyddskåpan tas bort med sterila pincett från bit gel-film för att exponera självhäftande baksida. Gelén-filmen fästes sedan till en glasmikroskopskiva med ett fast tryck. (B) När gelén-filmprovet är redo att användas för bioparticle insamling, den övre klar skyddsfilm avlägsnas med användning av sterila pincetter.
Figur 2: Bioparticle samlingen med hjälp av gel-film från olika substrat. De gel-diabilder kan användas för att samla biopartiklar från en mängd olika ytor. Gelén-filmen placeras i direkt kontakt med föremålet eller ytan av intresse. Svag tryck appliceras för att överföra biopartiklar på gelén-filmytan. Insamling av biopartiklar från (A) slitna kläder poster (päls krage), (B) rört föremål (resor kaffekopp), och (C) direkt mänsklig hud (male handled) visas.
Figur 3:. Biopartiklar på en sliten kläder objekt (inuti byxbenet) biopartiklar överförs till gel-filmen genom direkt kontakt med föremålet ytan. Biopartiklar kan hittas som "klumpar" eller enskilda / enkel biopartiklar (indikerade med röda pilar).
Figur 4:. Valfri färgning av biopartiklar på gel-film diabilder För bättre visualisering av biopartiklar, kan gel-filmprover färgas med trypan blånad. Hela ytan av gel-filmen täcks av trypanblått (A). Efter 1-2 min av färgning, sliden försiktigt lutas för att tillåta överflödig färg att rinna av sliden (B). Skonsam översvämning med sterilt vatten (C) kan användas för att avlägsna överflödig färg. Efter sliden lufttorkas, kan sliden ses under mikroskop för att säkerställa korrekt färgning (D, E). Anm:. Inte alla biopartiklar kommer att visas färgas (dvs, blå) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
oad / 52612 / 52612fig5.jpg "/>
Figur 5: Bioparticle insamling och analys. (A) En liten mängd (eller "boll") av vattenlösligt våglödning tejp ("adhesiv") samlas på spetsen av en volfram nål genom försiktig skrapning. (B) Limmet sedan rörd till gel- filmyta för att samla de biopartiklar av intresse. Enskilda eller flera biopartiklar kan samlas med en enda klisterboll. (C) När de önskade biopartiklar har samlats, är nålspetsen placeras i förstärknings mix i en 0,2 ml PCR-rör. Nålen hålls i vätskan tills det löser och frisläppandet av biopartiklar i lösning observeras. Alla steg i insamlingen utförs och ses under mikroskop för att säkerställa ett framgångsrikt bioparticle insamling och överföring. Klicka här för att se en larGER version av denna siffra.
Figur 6:. Individuella biopartiklar i en skjorta krage prov biopartiklar utvanns med användning av gel-film från insidan av en skjorta krage som bärs av en manlig donator. De biopartiklar färgades med hjälp trypanblått och bilder på tjugo olika individuella biopartiklar identifierats i provet visas. I varje bild är bioparticle som samlades inringade (röda cirklar indikerar biopartiklar där en profil utvanns, svarta cirklar indikerar biopartiklar där en profil inte återvunnits). Den procentuella allelen återvinning (antal observerade alleler av möjliga 30) visas ovanför bilden av bioparticle från vilken en profil utvanns. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: clumped biopartiklar i en skjorta krage prov biopartiklar utvanns med användning av gel-film från insidan av en skjorta krage som bärs av en manlig donator.. De biopartiklar färgades med hjälp trypanblått och bilder av tjugo olika hopklumpade biopartiklar identifierats i provet visas. I varje bild är bioparticle som samlades inringade (röda cirklar indikerar biopartiklar där en profil utvanns, svarta cirklar indikerar biopartiklar där en profil inte återvunnits Procenten allelen återvinning (antal observerade alleler av möjliga 30). visas för varje bioparticle från vilken en profil utvanns. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: Autosomal STR profil som erhålls från en enda bioparticle från en manlig skjortkragen en autosomal STR profil erhölls från en enda bioparticle (visas på vänster) med användning av de 5 | il direkt lys / amplifieringsreaktion.. Noggrannheten hos denna profil bestämdes genom jämförelse med en donatorreferensprov. Femton autosomalt STR-locus och amelogenin (könsbestämning) är sam-amplifieras i en enda reaktion och separeras genom kapillärelektrofores. Resultaten visas här som ett elektroferogram. Allelen nummer är beteckningen under varje topp vid varje lokus. X-axeln representerar fragmentstorlek (baspar, bp) och y-axeln representerar signalintensitet (RFU relativa fluorescensenheter; det under varje motsvarande allel nummer). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9: Autosomal STR profil som erhålls från en hopklumpat bioparticle från en manlig skjortkragen en autosomal STR profil erhölls från en hopklumpat bioparticle (visas på vänster) med användning av de 5 | il direkt lys / amplifieringsreaktion.. Noggrannheten hos denna profil bestämdes genom jämförelse med en donatorreferensprov. Femton autosomalt STR-locus och amelogenin (könsbestämning) är sam-amplifieras i en enda reaktion och separeras genom kapillärelektrofores. Resultaten visas här som ett elektroferogram. Allelen nummer är beteckningen under varje topp vid varje lokus. X-axeln representerar fragmentstorlek (baspar, bp) och y-axeln representerar signalintensiteten (RFU relativ fluorescensenheter; tillgänglig under varje motsvarande allel nummer).pg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 10:. Exempel på ett misslyckande att erhålla ett autosomalt STR-profil som erhålls från en samlad bioparticle Den enskilde bioparticle visas på vänster samlades in från en skjortkrage gel-filmprov. Såsom kan ses från den erhållna STR profilen (visad till höger), var endast en allel (av 30 möjliga) erhålles. Allelen nummer är beteckningen under varje topp vid varje lokus. X-axeln representerar fragmentstorlek (baspar, bp) och y-axeln representerar signalstyrkan (RFU relativa fluorescensenheter; det under varje motsvarande allel nummer). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Här har vi beskrivit metoder för insamling och förbättrad genetisk analys av biopartiklar återvinns från beröring DNA-bevis. Den utvecklade synsätt innebär följande: 1) insamling av biologiskt material (dvs biopartiklar) via gel-filmen från berört föremål och ytor, slitna kläder poster eller direkt mänsklig hud, 2) mikroskopisk undersökning av det återvunna biologiskt material för att säkerställa uppbörden av potentiella humant biologiskt material, och 3) mikromanipulering av enstaka eller ett fåtal biopartiklar användning av ett vattenlösligt lim, och 4) autosomal DNA-STR profilering av de uppsamlade biopartiklar som använder en microvolume (5 | il) en-steg-lys / amplifieringsreaktion. Användningen av en en-stegs slutna röret reaktion minskar risken för förorening och provförlust från ytterligare prov manipulationer eller överföring till andra reaktionsrör. Den förbättrade ett steg microvolume (5 pl) lys / STR amplifieringsreaktionerna medger återvinning av helt eller probative STR profiler av givaren av enstaka eller några få biopartiklar. Detta tillvägagångssätt har utvecklats för att få enstaka källa STR profiler från enkel- och fler source beröring DNA-bevis (t.ex., slitna objekt kläder och andra hushållsartiklar, berört / hanteras föremål och ytor, hud / hud blandningar). Det har framgångsrikt använts för detektion av den manliga donator i simulerade fysiska misshandel blandning prover.
Detta tillvägagångssätt skulle utvärderas ytterligare i ytterligare kroppsvätska / vävnads blandningen scenarier som ett offer kliade sig / hennes angripare, där endast ett fåtal biopartiklar från gärningsmannen skulle vara närvarande bland en överväldigande mängd biologiskt material från offret. Dessutom, eftersom detta tillvägagångssätt utvecklats i den aktuella studien tillåter analys vid den enda bioparticle nivån, det skulle kunna användas för att få en bättre förståelse av arten och omfattningen av sekundär överföring 14-19, där en mellanhand överför en DNA-profil på en surface, föremål eller person till en annan yta föremålet eller personen 20. En blind-svabbar förhållningssätt till analysen av sekundära överföringen kan misslyckas med att identifiera spårmängder av material från den sekundära givaren. Den metod som utvecklats här tillåter analys av enstaka eller några få biopartiklar varför resultaten inte förväxlas genom närvaron av en överväldigande mängd biologiskt material från den primära donator. De metoder som utvecklats i detta arbete kan också få konsekvenser för analys av spår biologiskt material i sexuella övergrepp fall som exempelvis innebär digital penetration av slidan där positiv identifiering av spårmängder av hudceller från gärningsmannen kan vara avgörande för att fastställa att sexuell kontakt inträffade.
Medan insamling av biopartiklar från gel-filmprov inte innebär svåra och komplexa manipulationer, det finns kritiska steg i denna procedur som måste utföras med stor omsorg för att se till successful överföring av biopartiklar till nedströmsreaktionskärlet. Insamlingen av biopartiklar med vattenlösligt lim måste ses mikroskopiskt (dvs, stereo vid hög förstoring (~ 200-300X) för att se till att endast de biopartiklar av intresse samlas. Beroende på storleken av limmet "boll" används finns finns risk för att samla in ytterligare omgivande material som kan innefatta både biologiska och icke-biologiska material (t.ex., fibrer, annat skräp). får Insamlingen av oavsiktliga ytterligare biopartiklar resultera i återhämtningen av blandade DNA-profiler. Insamlingen av icke-biologiskt material får införa hämmare in i mikrovolym lys / STR reaktioner. Om flera biopartiklar samlas med samma klister "boll", det finns en potential för tidigare insamlade biopartiklar att lossna från limmet. Detta är inte frekvent, men kan inträffa när större antal bioparticles samlas (t.ex. över 50) med en enda klister "boll". Om ett stort antal biopartiklar är riktade, rekommenderas att flera samlingar av färre biopartiklar görs men alla överförda till samma 0,2 ml rör. När biopartiklar har samlats, måste man vara försiktig vid avlägsnandet av gel-filmen slide från mikroskopet scenen och placeringen av 0,2 ml rör, så att spetsen på nålen inte störs. Under placeringen av spetsen på nålen i huvudblandningen vid botten av 0,2 ml rör, bör nålspetsen inte göra kontakt med de sidor av röret, för att undvika förlust av material på sidorna av röret. Medan solubilisering av bindemedlet är typiskt snabb (~ 30 sek eller mindre beroende på storleken av limmet "boll") och kan övervakas under mikroskopisk undersökning, bör nålspetsen avlägsnas långsamt från huvudblandningen för att säkerställa att fullständig solubiliseringav bindemedlet har uppnåtts. Om limmet inte fullständigt har lösts upp, kan nålen återföras till vätskan för att medge fullständig upplösning.
De protokoll som beskrivs här har optimerats för användning med biopartiklar och mänskliga celler från rättsmedicinsk biologisk bevis. Den lysbuffert valda är kompatibelt med den utvalda DNA-STR amplifieringskit. Även om det kan finnas lämpliga alternativa lys buffertar, måste deras effektivitet i termer av cellysering och kompatibilitet med nedströms analys kontrolleras av användaren. Dessutom har STR amplifieringskit och amplifieringscykel nummer beskrivs i detta protokoll optimerats för användning med enstaka eller några biopartiklar. Ett nästa generations STR förstärkning kit med rapporterat ökad robusthet och känslighet valdes och har visat sig resultera i återhämtningen av högkvalitativa STR-profiler från enstaka eller några få biopartiklar. Medan många andra STR kit, med varierande rekommenderas Amplifitionscykelnummer, finns tillgängliga, kan de inte ha lämplig känslighet och därför skulle behöva utvärderas ordentligt innan de används i dessa protokoll.
Trots den framgångsrika användningen av de beskrivna metoderna för återvinning STR profiler från enstaka eller några biopartiklar, kommer andelen framgångsrika profil återhämtning inte vara 100%. Därför, för vissa prover en begränsad partiell DNA-profil eller någon profil kan observeras. Detta kan inte undvikas på grund av oförmåga att slutgiltigt visuellt identifiera de flesta biopartiklar som cellmaterial, den potentiella försämrat tillstånd av kärnämnet i de insamlade biopartiklar eller förlust av provmaterial från limmet före överföringen i reaktionskärlet. Därför är analysen av ett enda bioparticle prov för varje beröring DNA post rekommenderas inte. Vi samlar ofta 20 provuppsättningar från en individuell gel-film prov och kommer att samla in ytterligare provningssatser som behövs om en lämplig STR-profil inte erhålls. Than bara begränsning för samlingarna är mängden biologiskt material som finns på prov gel-film (och troligen kostnaden för analysen, även om microvolume reaktionerna ger möjlighet att samla in ytterligare prover för en liknande eller lägre kostnad som en enda standard reaktionsvolym ( t.ex., 25 pl).
De utvecklade DNA profilering metoder beskriver här ger en molekylbaserad strategi för karakterisering, analys och tolkning av spår biologiskt material återvinns från berörings DNA-prover. Det finns dock ytterligare genetisk information som kan erhållas från de utvunna biopartiklar utöver bestämning av donator (dvs., STR-profil) av givaren av det biologiska materialet. Vävnaden eller kroppsvätska ursprungskälla (t.ex. hud kontra saliv) kan ge viktig bakgrundsinformation som en brottsutredning. Utan en sådan beslutsamhet, kan den tvetydighet av vävnadskällan ursprungs Explosad som alternativa omständigheterna kring brottet (t.ex. hur kroppsvätska kan ha deponerats) kunde föreslås. De bioparticle insamling och isolerings protokoll som beskrivs här kan användas för att samla biopartiklar eller andra celler (t.ex., buckal, vaginal) för användning i en vävnadskälla identifikation (mRNA profiling 21-30) strategi som innebär mikro volym omvänd transkription (RT) och amplifieringsreaktioner. Med ytterligare optimering kan det även vara möjligt att utveckla ett DNA / RNA co-isolering strategi att tillåta celltyp identifiering (RNA) och STR profilering från samma prov, inklusive biopartiklar från beröring DNA-bevis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SealRite 1.5 ml natural microcentrifuge tubes, sterile | USA Scientific | 1615-5510 | numerous alternative suppliers are available, but tubes should be sterile |
| 0.2 ml PCR tubes with flat cap, natural | Phenix Research | MPX-200F | or equivalent |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 and/or 06-666-11C | |
| Alcohol prep pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | alternative is 06-665-24 (Fisher Sci); canister of larger alcohol wipes rather than individual pads |
| Sterile water | 18.2 MΩ, autoclaved | ||
| Glass microscope slides, frosted, 3" x 1": 1 mm | Fisher Scientific | 12-544-3 | alternative brands or sizes are acceptable |
| Disposable transfer pipet | Fisher Scientific | 13-711-9D | alternatives are acceptable |
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | |
| Pipets: 0.2-2, 2-20, 10-100, 100-1,000 μl | various | ||
| Sterile, aerosol-resistant pipet tips | various | ||
| Mini-centrifuge | various | ||
| Stereomicroscope | Leica | M205C | others are suitable, but must be capable of magifications up to 350X |
| GeneAmp PCR system 9700 thermal cycle (silver or gold block) | Life Technologies | N8050200 or 4314878 | other models and manufacturers can be used, but performance with the STR amplification kit must be verified |
| 3130 Genetic Analyzer | Life Technologies | 3130-01 | alternatives: 310 or 3500 Genetic Aanlyzers (Life Technologies) |
| GeneMapper software | Life Technologies | various | various versions of the software are available and can be used |
| WF Gel-Film , x8 retention level | Gel-Pak | WF-40-x8-A | 4" x 4" wafer film; can be ordered in other size specifications |
| Double sided tape | various | ||
| Glass block, 3" x 1.5" x 3/8" | McCrone Microscopes and Accessories | 370-2 | or equivalent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tungsten needle with holder | McCrone Microscopes and Accessories | 106 | |
| 3M water soluble wave solder tape, 5414 transparent | Allied Electronics | 70113977 | |
| Lysis buffer (forensicGEM Saliva, Zygem) | VWR | 95043-992 | Lysis buffer is prepared in 10 μl portions (prepare additional master mix portions as needed to accommodate the desired number of samples). 1.5 μl is used for each sample. To prepare 10 μl of lysis buffer (sufficient for ~6 samples): 6.9 μl sterile water, 2.1 μl 10x buffer - blue, 1 μl forensicGEM. |
| STR Amplification kit, AmpFlSTR Identifiler Plus PCR amplification kit | Life Technologies | 4427368 | Alternative STR amplification kits can be used, but performance would have to be verified by user. The amplification mix is prepared as follows (volumes per sample): 2.2 μl PCR reaction mix, 1.1 μl Primer set, 0.2 μl (1U) AmpliTaq Gold DNA polymerase. A master mix sufficient for the desired number of samples should be prepared. 3.5 μl of the prepared mix is added to the 0.2 ml tube for bioparticle collection. |
| AmpliTaq Gold DNA polymerase | Life Technologies | N808-0245 | |
| HiDi formamide | Life Technologies | 4311320 | |
| GeneScan 500 LIZ size standard | Life Technologies | 4322682 | |
| 96 well optical reaction plates | Life Technologies | N8010560 | |
| Plate septa, 96 well | Life Technologies | 4315933 | |
| Performance-optimized polymer, POP-7 | Life Technologies | 4363785 | Alternatives such as POP-4 are acceptable |
References
- Hanson, E. K., Ballantyne, J. Getting blood from a stone': ultrasensitive forensic DNA profiling of microscopic bio-particles recovered from 'touch DNA' evidence. Methods Mol.Biol. 1039, 3-17 (2013).
- Balogh, M. K., Burger, J., Bender, K., Schneider, P. M., Alt, K. W. STR genotyping and mtDNA sequencing of latent fingerprint on paper. Forensic Sci Int. 137 (2-3), 188-195 (2003).
- Barbaro, A., Cormaci, P., Teatino, A., La, M. A., Barbaro, A. Anonymous letters? DNA and fingerprints technologies combined to solve a case. Forensic Sci Int. 146, S133-S134 (2004).
- Bright, J. A., Petricevic, S. F. Recovery of trace DNA and its application to DNA profiling of shoe insoles. Forensic Sci.Int. 145 (1), 7-12 (2004).
- Castello, A., Alvarez, M., Verdu, F. DNA from a Computer Keyboard. Forensic Science Communications. 6 (3), (2004).
- Horsman-Hall, K. M., et al. Development of STR profiles from firearms and fired cartridge cases. Forensic Sci Int. Genet. 3 (4), 242-250 (2009).
- Petricevic, S. F., Bright, J. A., Cockerton, S. L. DNA profiling of trace DNA recovered from bedding. Forensic Sci. Int. 159 (1), 21-26 (2006).
- Oorschot, R. A., Jones, M. K. DNA fingerprints from fingerprints. Nature. 387 (6635), 767 (1997).
- Sewell, J., et al. Recovery of DNA and fingerprints from touched documents. Forensic Sci Int.Genet. 2 (4), 281-285 (2008).
- Raymond, J. J., van Oorschot, R. A., Gunn, P. R., Walsh, S. J., Roux, C. Trace evidence characteristics of DNA: A preliminary investigation of the persistence of DNA at crime scenes. Forensic Sci Int Genet. 4 (1), 26-33 (2009).
- Wickenheiser, R. A. Trace DNA: a review, discussion of theory, and application of the transfer of trace quantities of DNA through skin contact. J.Forensic Sci. 47 (3), 442-450 (2002).
- Sweet, D., Lorente, M., Lorente, J. A., Valenzuela, A., Villanueva, E. An improved method to recover saliva from human skin: the double swab technique. J. Forensic Sci. 42 (2), 320-322 (1997).
- Molecular Biology of the Skin - the Keratinocyte. Darmon, M. M., Blumenberg, M. M. , Academic Press. San Diego, CA. (1993).
- Daly, D. J., Murphy, C., McDermott, S. D. The transfer of touch DNA from hands to glass, fabric and wood. Forensic Sci Int Genet. 6 (1), 41-46 (2012).
- Goray, M., Eken, E., Mitchell, R. J., van Oorschot, R. A. Secondary DNA transfer of biological substances under varying test conditions. Forensic Sci Int Genet. 4 (2), 62-67 (2010).
- Goray, M., Mitchell, R. J., van Oorschot, R. A. Investigation of secondary DNA transfer of skin cells under controlled test conditions. Leg.Med.(Tokyo). 12 (3), 117-120 (2010).
- Lowe, A., Murray, C., Whitaker, J., Tully, G., Gill, P. The propensity of individuals to deposit DNA and secondary transfer of low level DNA from individuals to inert surfaces. Forensic Sci Int. 129 (1), 25-34 (2002).
- Phipps, M., Petricevic, S. The tendency of individuals to transfer DNA to handled items. Forensic Sci Int. (2-3), 168-162 (2007).
- Zoppis, S., et al. DNA fingerprinting secondary transfer from different skin areas: Morphological and genetic studies. Forensic Sci Int Genet. 11, 137-143 (2014).
- Gill, P. Misleading DNA Evidence: Reasons for Miscarriages of Justice. , Academic Press - Elsevier. (2014).
- Haas, C., Hanson, E., Ballantyne, J. Capillary electrophoresis of a multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction to target messenger RNA markers for body fluid identification. Methods Mol. Biol. 830, 169-183 (2012).
- Hanson, E., Ballantyne, J. RNA Profiling for the Identification of the Tissue Origin of Dried Stains in Forenic Biology. Forensic Sci Rev. , 22145-22157 (2010).
- Hanson, E., Haas, C., Jucker, R., Ballantyne, J. Specific and sensitive mRNA biomarkers for the identification of skin in 'touch DNA' evidence. Forensic Sci Int Genet. 6, 548-558 (2012).
- Hanson, E. K., Ballantyne, J. Highly specific mRNA biomarkers for the identification of vaginal secretions in sexual assault investigations. Sci Justice. 53 (1), 14-22 (2013).
- Juusola, J., Ballantyne, J. Messenger RNA profiling: a prototype method to supplant conventional methods for body fluid identification. Forensic Sci Int. 135 (2), 85-96 (2003).
- Juusola, J., Ballantyne, J. Multiplex mRNA profiling for the identification of body fluids. Forensic Sci Int. 152 (1), 1-12 (2005).
- Fleming, R. I., Harbison, S. The development of a mRNA multiplex RT-PCR assay for the definitive identification of body fluids. Forensic Sci Int Genet. 4 (4), 244-256 (2010).
- Haas, C., Klesser, B., Maake, C., Bar, W., Kratzer, A. mRNA profiling for body fluid identification by reverse transcription endpoint PCR and realtime PCR. Forensic Sci Int Genet. 3 (2), 80-88 (2009).
- Lindenbergh, A., et al. A multiplex (m)RNA-profiling system for the forensic identification of body fluids and contact traces. Forensic Sci Int Genet. 6 (2), 565-577 (2012).
- Richard, M. L., et al. Evaluation of mRNA marker specificity for the identification of five human body fluids by capillary electrophoresis. Forensic Sci Int Genet. 6 (4), 452-460 (2012).
