Hier präsentieren wir ein Protokoll zur elektroNanoFaserGerüste mit abgestuften Organisation der Fasern herzustellen und zu erforschen ihre Anwendungen bei der Regulierung der Zellmorphologie / Ausrichtung. Farbverläufe in Bezug auf physikalische und chemische Eigenschaften der Nanofasergerüste bieten eine Vielzahl von Anwendungen im Bereich der Biomedizin.
The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible applications in controlling cell morphology/orientation. Nanofiber organization is controlled with a new fabrication apparatus that enables the gradual decrease of fiber organization in a scaffold. Changing the alignment of fibers is achieved through decreasing deposition time of random electrospun fibers on a uniaxially aligned fiber mat. By covering the collector with a moving barrier/mask, along the same axis as fiber deposition, the organizational structure is easily controlled. For tissue engineering purposes, adipose-derived stem cells can be seeded to these scaffolds. Stem cells undergo morphological changes as a result of their position on the varied organizational structure, and can potentially differentiate into different cell types depending on their locations. Additionally, the graded organization of fibers enhances the biomimicry of nanofiber scaffolds so they more closely resemble the natural orientations of collagen nanofibers at tendon-to-bone insertion site compared to traditional scaffolds. Through nanoencapsulation, the gradated fibers also afford the possibility to construct chemical gradients in fiber scaffolds, and thereby further strengthen their potential applications in fast screening of cell-materials interaction and interfacial tissue regeneration. This technique enables the production of continuous gradient scaffolds, but it also can potentially produce fibers in discrete steps by controlling the movement of the moving barrier/mask in a discrete fashion.
Nanofasern sind eine beliebte Dienstprogramm für das Tissue Engineering die aufgrund ihrer Fähigkeit, die extrazelluläre Matrix in der Struktur und der relativen Größe 1 nachahmen. Jedoch können einige native Gewebe Schnittstellen wie die Sehne-Knochen-Insertionsstelle, enthält Kollagenfasern, das eine variable Organisationsstruktur, die in Ausrichtung hin zunimmt Sehne und nimmt an der Knochenstelle 2-5 aufweisen. Also, für eine effektive Regeneration der Gewebe gibt es eine Notwendigkeit, ein Gerüst, das diesen strukturellen Gradienten effektiv nachahmen herzustellen.
Zuvor hat es Forschung zu langsamen Veränderungen in der Fasermasse durchgeführt, und zwar, Mineralgehalt 6. Allerdings, wieder die Strukturkomponente des Bindegewebes bleibt weitgehend unerforscht. Eine frühere Studie geprüft morphologischen Gradienten durch die Untersuchung der Wirkung der Oberflächen Siliciumdioxid Teilchendichte auf die Proliferation von Ratten-Schädel Osteoblasten und fanden ein inverse Verhältnis zwischen Kieselsäure Teilchendichte und Zellproliferation 7. Aber die morphologischen Veränderungen, die in früheren Arbeiten vermittelten Zellproliferation waren meist verwandten Oberflächenrauhigkeit fehlt die Fähigkeit, in Nachahmung Faser organisatorische Veränderungen 7,8. Eine neuere Studie versucht, ein Gerüst, das die einzigartigen Kollagenfaserorientierungen durch die Verwendung eines neuartigen Kollektor zum Elektro 9 nachgeahmt herzustellen. Während dieser Studie gelungen, ein Gerüst mit beiden ausgerichtet und Wirrfasern, versäumt es, die schrittweise Veränderung der nativen Geweben ausgestellt imitieren. Auch bei der Herstellung von Einzelkomponenten, mit einem sofortigen Wechsel von der willkürlichen Orientierung ausgerichtet ist, die biomechanischen Eigenschaften dieses Gerüst deutlich zurückgegangen. Keine frühere Arbeit ist es gelungen, zutreffend Nanofasergerüste mit kontinuierlichen Abstufungen in der Faserorientierungen von fluchtenden und zufälligen erzeugen. Unsere aktuelle Studie hat erfolgreiche Erholung der Nanofasergerüste gezeigtmit Abstufungen in Faser-Organisation, die möglicherweise nachahmen kann das native Kollagen Organisation Sehne-Knochen-Insertion 10. Diese Arbeit zielt darauf ab, die für die Herstellung von Nanofasergerüste mit einer Struktur, die sehr ähnlich ist, dass der Faser-Organisation in der Landes Sehnen-Knochen-Gewebe-Grenzfläche verwendeten Protokolle zu präsentieren.
Gradient Nanostrukturen möglicherweise weitreichenden Anwendungen in einer Vielzahl von Bereichen. Wir konzentrierten uns auf die Anwendungen auf Tissue Engineering der Sehne-Knochen-Insertionsstelle durch die Kombination unserer Gerüste mit Fettgewebe gewonnene Stammzellen (ADSCs), die bereits für die Geweberegeneration auf verschiedenen Substraten 11-14 eingesetzt werden. Darüber hinaus sind ADSCs sehr ähnlich in der Natur, um Stammzellen des Knochenmarks hinsichtlich der Multipotenz und ihre Ressourcen reichlich vorhanden ist, die mit einem einfachen Fettabsaugung 15,16 geerntet werden können. Seeding diese Zellen auf Nanofasergerüste abgestuft weitere Verbesserung ihrer tisklagen Ingenieuranwendungen, indem es für die gesteuerte Verteilung der Zellen, die potentiell in verschiedenen Geweben differenzieren können. Zusätzlich zum Impfen Stammzellen können Nanofasern mit Signalmolekülen zur Regulierung der zellulären Antwort eingekapselt werden. Koppeln Nanoverkapselung mit der organisatorischen Gradienten dieser Gerüste ermöglicht die Untersuchung von Zellverhalten oder mögliche Implantatdesigns und Beschichtungen. Verkapselung von funktionellen Molekülen, wie morphogenetisches Knochenprotein 2 (BMP-2), von dem gezeigt wurde, um die Osteoblasten-Differenzierung 15,16 induzieren könnten weitere Verbesserung der Gewebezüchtung dieser Gerüste 10.
The most critical part of the protocol is generation of the gradient scaffold. It is imperative that the mask covering the collector moves at a constant velocity so there is a gradual change within the fiber scaffold. The correct preparation of PCL solution is also important to ensure electrospinning success. Checking the fiber morphology prior to electrospinning is recommendable, especially after the encapsulation of Coumarin-6, which may require a higher voltage to electrospin correctly.
Fu…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde von der Anschubfinanzierung von der University of Nebraska Medical Center und National Institute of Health (Förderkennzeichen 1R15 AR063901-01) unterstützt.
Polycaprolactone | Sigma-Aldrich | 440744 | |
N,N-Dimethlyformamide | Fisher Chemical | D-119-1 | |
Dichloromethane | Fisher Chemical | AC61093-1000 | |
Coumarin 6 | Sigma-Aldrich | 546283 | |
Adipose Derived Stem Cells | Cellular engineering Technologies | HMSC.AD-100 | |
Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 26140-111 | |
Fluorescein Diacetate | Sigma-Aldrich | F7378 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | |
α-Modified Eagle's Medium | Invitrogen | a10490-01 | |
Acetone | Fisher Scientific | s25120a | |
Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 10010023 | |
Glass Slides | VWR international, LLC | 101412-842 | |
Syringe Pump | Fisher Scientific | 14-831-200 | Single syringe |
Ultrasonic Cleaner | Branson | 1510 | |
High Voltage DC Power Supply | Gamma High Voltage Research | ES30 | |
Scanning Electron Microscope | FEI | Nova 2300 | |
Fluorescence Microscope | Zeiss | Axio Imager 2 |