A continuación, presentamos un protocolo para fabricar nanofibras andamios electrospun con organización gradated de fibras y explorar sus aplicaciones en la regulación de la morfología celular / orientación. Gradientes con respecto a las propiedades físicas y químicas de las nanofibras andamios ofrecen una amplia variedad de aplicaciones en el campo biomédico.
The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible applications in controlling cell morphology/orientation. Nanofiber organization is controlled with a new fabrication apparatus that enables the gradual decrease of fiber organization in a scaffold. Changing the alignment of fibers is achieved through decreasing deposition time of random electrospun fibers on a uniaxially aligned fiber mat. By covering the collector with a moving barrier/mask, along the same axis as fiber deposition, the organizational structure is easily controlled. For tissue engineering purposes, adipose-derived stem cells can be seeded to these scaffolds. Stem cells undergo morphological changes as a result of their position on the varied organizational structure, and can potentially differentiate into different cell types depending on their locations. Additionally, the graded organization of fibers enhances the biomimicry of nanofiber scaffolds so they more closely resemble the natural orientations of collagen nanofibers at tendon-to-bone insertion site compared to traditional scaffolds. Through nanoencapsulation, the gradated fibers also afford the possibility to construct chemical gradients in fiber scaffolds, and thereby further strengthen their potential applications in fast screening of cell-materials interaction and interfacial tissue regeneration. This technique enables the production of continuous gradient scaffolds, but it also can potentially produce fibers in discrete steps by controlling the movement of the moving barrier/mask in a discrete fashion.
Las nanofibras son una utilidad popular para la ingeniería de tejidos debido a su capacidad para imitar la matriz extracelular en su estructura y tamaño relativo 1. Sin embargo, algunas interfaces de tejidos nativos, tales como el sitio de inserción del tendón en el hueso, contienen fibras de colágeno, que exhiben una estructura organizativa variable que aumenta en alineación hacia el tendón y disminuye en el sitio de hueso 2-5. Por lo tanto, para la regeneración de tejidos eficaz hay una necesidad de fabricar un andamio que podrían imitar eficazmente este gradiente estructural.
Anteriormente, ha habido una investigación llevada a cabo sobre los cambios graduales en la composición de la fibra, concretamente, el contenido mineral 6. Sin embargo, volver a crear el componente estructural de los tejidos conectivos sigue siendo en gran parte inexplorado. Un estudio anterior examinó gradientes morfológicos mediante el estudio del efecto de la densidad de las partículas de sílice superficie sobre la proliferación de los osteoblastos de calota de rata y se encontró un Inverrelación entre la densidad se partícula de sílice y la proliferación celular 7. Pero los cambios morfológicos que mediaron la proliferación celular en trabajos anteriores fueron en su mayoría relacionados con la rugosidad superficial que carecen de la capacidad en la imitación de los cambios organizativos de fibra de 7,8. Un estudio reciente intentó fabricar un andamio que imitaba las orientaciones únicas fibras de colágeno mediante el uso de una novela colector para electrospinning 9. Si bien este estudio logró producir un andamio con fibras tanto alineados y aleatorios, no logró imitar los cambios graduales que se exhiben en los tejidos nativos. También, en la producción de componentes separados, con un cambio inmediato de alineado con orientación aleatoria, las propiedades biomecánicas de este andamio disminuyeron significativamente. Sin el trabajo previo ha sido capaz de producir nanofibras andamios aplicables con gradaciones continuas en orientaciones de las fibras de alineado y al azar. Nuestro estudio reciente ha demostrado la recreación exitosa de nanofibras andamioscon gradaciones en la organización de fibra que potencialmente pueden imitar la organización de colágeno nativo en la inserción del tendón al hueso 10. Este trabajo tiene como objetivo presentar los protocolos utilizados para la producción de nanofibras andamios con una estructura que se asemeja mucho a la de organización de las fibras en la interfaz nativa del tejido del tendón al hueso.
Estructuras de nanofibras Gradient han potencialmente aplicaciones en una variedad de campos de gran alcance. Nos centramos en las aplicaciones a la ingeniería de tejidos de la zona de inserción del tendón al hueso mediante la combinación de nuestros andamios con células madre derivadas de tejido adiposo (ADSC) que ya se utilizan para la regeneración de tejidos en varios sustratos 11-14. Además, ADSC son de naturaleza muy similar a las células madre de médula ósea en términos de multipotencia y su recurso es abundante que puede ser cosechada usando un simple 15,16 procedimiento de liposucción. Siembra de estas células a los andamios nanofibras graduadas mejora aún más su tisdemandar aplicaciones de ingeniería al permitir la distribución controlada de las células que potencialmente pueden diferenciarse en diversos tejidos. Además de la siembra de células madre, las nanofibras se pueden encapsular con moléculas de señalización para la regulación de la respuesta celular. El acoplamiento de nanoencapsulación con el gradiente de la organización de estos andamios permite el estudio del comportamiento celular o posibles diseños de implantes y recubrimientos. La encapsulación de moléculas funcionales como la proteína morfogenética ósea 2 (BMP2), que se ha demostrado que induce la diferenciación de osteoblastos 15,16, podría mejorar aún más las aplicaciones de ingeniería de tejidos de estos andamios 10.
The most critical part of the protocol is generation of the gradient scaffold. It is imperative that the mask covering the collector moves at a constant velocity so there is a gradual change within the fiber scaffold. The correct preparation of PCL solution is also important to ensure electrospinning success. Checking the fiber morphology prior to electrospinning is recommendable, especially after the encapsulation of Coumarin-6, which may require a higher voltage to electrospin correctly.
Fu…
The authors have nothing to disclose.
Esta obra fue financiada en parte con fondos de puesta en marcha de la Universidad de Nebraska Medical Center y el Instituto Nacional de Salud (número de concesión 1R15 AR063901-01).
Polycaprolactone | Sigma-Aldrich | 440744 | |
N,N-Dimethlyformamide | Fisher Chemical | D-119-1 | |
Dichloromethane | Fisher Chemical | AC61093-1000 | |
Coumarin 6 | Sigma-Aldrich | 546283 | |
Adipose Derived Stem Cells | Cellular engineering Technologies | HMSC.AD-100 | |
Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 26140-111 | |
Fluorescein Diacetate | Sigma-Aldrich | F7378 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | |
α-Modified Eagle's Medium | Invitrogen | a10490-01 | |
Acetone | Fisher Scientific | s25120a | |
Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 10010023 | |
Glass Slides | VWR international, LLC | 101412-842 | |
Syringe Pump | Fisher Scientific | 14-831-200 | Single syringe |
Ultrasonic Cleaner | Branson | 1510 | |
High Voltage DC Power Supply | Gamma High Voltage Research | ES30 | |
Scanning Electron Microscope | FEI | Nova 2300 | |
Fluorescence Microscope | Zeiss | Axio Imager 2 |