Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll zur elektroNanoFaserGerüste mit abgestuften Organisation der Fasern herzustellen und zu erforschen ihre Anwendungen bei der Regulierung der Zellmorphologie / Ausrichtung. Farbverläufe in Bezug auf physikalische und chemische Eigenschaften der Nanofasergerüste bieten eine Vielzahl von Anwendungen im Bereich der Biomedizin.
Introduction
Nanofasern sind eine beliebte Dienstprogramm für das Tissue Engineering die aufgrund ihrer Fähigkeit, die extrazelluläre Matrix in der Struktur und der relativen Größe 1 nachahmen. Jedoch können einige native Gewebe Schnittstellen wie die Sehne-Knochen-Insertionsstelle, enthält Kollagenfasern, das eine variable Organisationsstruktur, die in Ausrichtung hin zunimmt Sehne und nimmt an der Knochenstelle 2-5 aufweisen. Also, für eine effektive Regeneration der Gewebe gibt es eine Notwendigkeit, ein Gerüst, das diesen strukturellen Gradienten effektiv nachahmen herzustellen.
Zuvor hat es Forschung zu langsamen Veränderungen in der Fasermasse durchgeführt, und zwar, Mineralgehalt 6. Allerdings, wieder die Strukturkomponente des Bindegewebes bleibt weitgehend unerforscht. Eine frühere Studie geprüft morphologischen Gradienten durch die Untersuchung der Wirkung der Oberflächen Siliciumdioxid Teilchendichte auf die Proliferation von Ratten-Schädel Osteoblasten und fanden ein inverse Verhältnis zwischen Kieselsäure Teilchendichte und Zellproliferation 7. Aber die morphologischen Veränderungen, die in früheren Arbeiten vermittelten Zellproliferation waren meist verwandten Oberflächenrauhigkeit fehlt die Fähigkeit, in Nachahmung Faser organisatorische Veränderungen 7,8. Eine neuere Studie versucht, ein Gerüst, das die einzigartigen Kollagenfaserorientierungen durch die Verwendung eines neuartigen Kollektor zum Elektro 9 nachgeahmt herzustellen. Während dieser Studie gelungen, ein Gerüst mit beiden ausgerichtet und Wirrfasern, versäumt es, die schrittweise Veränderung der nativen Geweben ausgestellt imitieren. Auch bei der Herstellung von Einzelkomponenten, mit einem sofortigen Wechsel von der willkürlichen Orientierung ausgerichtet ist, die biomechanischen Eigenschaften dieses Gerüst deutlich zurückgegangen. Keine frühere Arbeit ist es gelungen, zutreffend Nanofasergerüste mit kontinuierlichen Abstufungen in der Faserorientierungen von fluchtenden und zufälligen erzeugen. Unsere aktuelle Studie hat erfolgreiche Erholung der Nanofasergerüste gezeigtmit Abstufungen in Faser-Organisation, die möglicherweise nachahmen kann das native Kollagen Organisation Sehne-Knochen-Insertion 10. Diese Arbeit zielt darauf ab, die für die Herstellung von Nanofasergerüste mit einer Struktur, die sehr ähnlich ist, dass der Faser-Organisation in der Landes Sehnen-Knochen-Gewebe-Grenzfläche verwendeten Protokolle zu präsentieren.
Gradient Nanostrukturen möglicherweise weitreichenden Anwendungen in einer Vielzahl von Bereichen. Wir konzentrierten uns auf die Anwendungen auf Tissue Engineering der Sehne-Knochen-Insertionsstelle durch die Kombination unserer Gerüste mit Fettgewebe gewonnene Stammzellen (ADSCs), die bereits für die Geweberegeneration auf verschiedenen Substraten 11-14 eingesetzt werden. Darüber hinaus sind ADSCs sehr ähnlich in der Natur, um Stammzellen des Knochenmarks hinsichtlich der Multipotenz und ihre Ressourcen reichlich vorhanden ist, die mit einem einfachen Fettabsaugung 15,16 geerntet werden können. Seeding diese Zellen auf Nanofasergerüste abgestuft weitere Verbesserung ihrer tisklagen Ingenieuranwendungen, indem es für die gesteuerte Verteilung der Zellen, die potentiell in verschiedenen Geweben differenzieren können. Zusätzlich zum Impfen Stammzellen können Nanofasern mit Signalmolekülen zur Regulierung der zellulären Antwort eingekapselt werden. Koppeln Nanoverkapselung mit der organisatorischen Gradienten dieser Gerüste ermöglicht die Untersuchung von Zellverhalten oder mögliche Implantatdesigns und Beschichtungen. Verkapselung von funktionellen Molekülen, wie morphogenetisches Knochenprotein 2 (BMP-2), von dem gezeigt wurde, um die Osteoblasten-Differenzierung 15,16 induzieren könnten weitere Verbesserung der Gewebezüchtung dieser Gerüste 10.
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Protocol
1. Herstellung der Lösung
- Es wird eine Lösung von Poly (ε-caprolacton) (PCL) (M w = 80.000 g / mol) bei einer ungefähren Konzentration von 100 mg / ml. Löse PCL in einem Gemisch von Dichlormethan (DCM) und N, N-dimethlyformamide (DMF) in einem Verhältnis von 4: 1 (v / v) mit einer Konzentration von 10% (w / v).
- Legen Sie die Lösung in einem 20 ml Glasröhrchen zum Mischen. Platzieren Glasrohr in Ultraschallreiniger für 30 Minuten oder bis die Lösung durchlässig ist.
2. Geräte Vorbereitung
- Fügen Sie den PCL-Lösung vorbereitet in eine 5-ml-Spritze mit einer 21-Gauge-stumpfe Nadel.
- Platzieren Spritzenpumpe in vertikaler Elektrospinnposition gemäß Figur 1.
- Verwenden Sie ein Stahl-Lücke Sammler Edelstahl mit einem offenen Raum von 2 cm x 5 cm für die ausgerichtete Fasersubstrat. Platzieren Sie den Sammler 12 cm von der Nadelspitze.
- Verbinden Sie den Gleichstrom (DC) Hochspannungsnetzteil an dieNadel und erden Sie die Sammler. Stellen Sie sicher, dass der Kollektor ist einzeln ohne Kontakt zur anderen Laborgeräten geerdet.
3. Das Elektro
- Set Spritzenpumpe auf 1,50 ml / h, bis die Tröpfchen bilden an der Nadelspitze sofort ersetzt werden, wenn entfernt. Dann stellen Sie die Durchflussrate auf 0,50 ml / h.
- Schalten Sie die Spannung Betreiber bis 12 kV.
- Elektrospinnen, bis die uniaxial ausgerichteten Fasern vollständig zu bedecken die Lücke auf dem Sammler.
- Leim auf die Kanten einer Glasplatte und Übertragung der Fasern von dem Spalt Kollektor mit der Glasplatte. Legen der Glasplatte auf der Oberseite von einem Stück Aluminiumfolie, die die gleiche Größe wie die Glasplatte und ist geerdet.
- Positionieren Sie die zweite Spritze Kollektor nach 3.
- Bringen Sie die Kunststoffmaske zum zweiten Spritzenpumpe und positionieren 2 mm oberhalb des Kollektors.
- Hinzufügen Coumarin 6 bei 1% (w / w) in der PCL-Lösung, wenn nanoencapsulation ist desired- und mische bis die Lösung durchlässig ist.
- Laden Sie den PCL oder PCL / Cumarin 6 Lösung in eine 5 ml Nadel mit einem stumpfen 21-Gauge-Nadel. Stellen vertikale Pumpen bis 0,50 ml / h und horizontal auf 9 ml / h oder bei einer ungefähren Geschwindigkeit von 1 mm / min zu ziehen.
- Elektrospinnen, bis die Maske fast vollständig aus dem Kollektor mit dem Randbereich nach wie vor unter der Maske bewegt, aber.
4. Fasercharakterisierung
- Prüfmuster mit doppelseitige leitende Band an der metallischen Bolzen und Mantel mit Platin für 40 sec mit einem Sputter-Coater bei 40 mA.
- Untersuchen Fasern durch Rasterelektronenmikroskop (SEM) nach unseren früheren Studien 17,18.
- Sammeln Bilder bei einer Beschleunigungsspannung von 15 kV.
- Durchführen von schnellen Fourier-Transformation (FFT) auf einem getrennten Faserprobe die Faserausrichtung zu messen. Die detaillierten Angaben zum Messfaserausrichtung durch FFT kann beziehen to früheren Studien 19,20.
5. Seeding Stammzellen.
- Sterilisation der Faserproben durch Eintauchen in eine 70% Ethanollösung für 2 Std. Dann waschen die Fasern mit destilliertem Wasser, um jegliche Verunreinigungen zu entfernen.
- Erhalten menschlichen ADSCs und Kulturzellen in einem 25 cm 2 -Kolben bei 37 ° C in einer Atmosphäre von 95% Luft / 5% CO 2. Ändern Sie jeden zweiten Tag 10 das Zellkulturmedium.
- Trypsinieren die Zellen und die Anzahl der Zellen. Genauer gesagt, nehmen Sie das Kulturmedium aus der Zellkulturflasche und waschen Sie die Zellen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) zweimal. Dann fügen Sie 1 m l einer 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung (pre-warm im Wasserbad auf 37 ° C), um die Zellschicht zu bedecken und die Flasche in der Zellkulturbrutschrank inkubieren für 2-3 Minuten. 4 ml Kulturmedium und waschen Sie alle Zellen von der Oberfläche durch Pipettieren des Mediums über die gesamte Oberfläche. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension und redispergieren the Zellpellet in Kulturmedium. Count-Zellen über Hämazytometer. Seed etwa 1 × 10 4 Zellen zur Nanofasergerüst in einem 35 mm -Kultur Schale gelegt und Inkubation für 3 und 7 Tagen.
- Stain-Zellen unter Verwendung von Fluoresceindiacetat (5 mg / ml in Aceton) (FDA) dann bild die Proben unter Verwendung eines Fluoreszenz-Mikroskops. Genauer gesagt, werden 100 ul des FDA-Lösung in die Kulturschale pipettieren und 30 min. Dreimal vor Fluoreszenzabbildung waschen Zellen mit PBS. Analysieren Zellorientierung durch eine kundenspezifische Matte-lab-Programm auf der Grundlage unserer bisherigen Studien 10.
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Representative Results
Unter Verwendung dieses Protokolls wurde eine Fasermatte mit einer organisatorischen Gradienten gebildet. 3 zeigt die REM-Bilder an verschiedenen Stellen auf der Nanofaser-Gerüst entnommen. Qualitativ kann bestimmt werden, dass es einen Übergang von der uniaxial ausgerichteter Fasern mit einem 0 mm (3A) zu einer zufälligen Fasersortiment auf 6 mm (Figur 3D). Die FFT liefert einen quantitativen Wert auf die Faserausrichtung, Einzelheiten über die quantitativen Prozesse sind detailliert hier 19. Fasern bei 0 mm weisen eine FFT, die Faserausrichtung zeigt, und 6 mm die FFT-Muster bedeutet eine zufällige Orientierung. Es gibt eine klare Progression in den SEM-Aufnahmen (Figur 3) aus einer ausgerichteten Faser-Organisation zu einer zunehmend Wirrfaserabscheidung (3B - C).
ADSCs unterzog morphologischen Veränderungen auf der Grundlage ihrer Lage im Nanofasergerüst, Fig. 4 (4A - D) entnommen und 7 Tagen (Abbildung 4E - H). Die Verteilung des Stammzellenwinkel wurde quantitativ durch eine angepasste MATLAB-Programm bewertet und mit Hilfe der Kolmogorov-Smirnov-Test bei verschiedenen Abständen analysiert. 4I zeigt die Verteilung der Zell Winkel an verschiedenen Standorten. Bei 0 mm, oder in der Region der ausgerichteten Fasern, 70% der Zellen erschienen innerhalb von 20 ° von der Achse der Nanofaserherstellung. Demgegenüber ausgesät die ADSCs den Zufallsabschnitte der Fasergerüste fehlte dieses Organisationsstruktur, wobei nur 20% der Zellen innerhalb von 20 ° erscheint. Schließlich wird die Bildung des chemischen Gradienten mit Coumarin 6 - geladen wurde PCL-Fasern mit Fluoreszenz-Mikroskopie untersucht. Die chemische Gradienten wurde qualitativ bestätigt mit dem mikroskopische Aufnahme (5A). Das Bild bestätigt die zunehmende chemical Konzentration über dem Gerüst, die durch die stetig zunehmende Intensität des Fluoreszenzbildes ausgestellt ist. Das Diagramm der Fluoreszenzintensität (Bild J) (5B) bestätigt die Steigung der chemischen Konzentration durch einen linearen Wachstums auf dem Gerüst.
Figur 1: zeigt die schematische Darstellung der Versuchsanordnung zur Herstellung der uniaxial ausgerichtete Fasersubstrat.
Abbildung 2: (a) zeigt die Platzierung der zweiten Spritzenpumpe zur Herstellung des Gradienten Gerüst. (B) Platzierung der Maske über dem Sammler. Diese Zahl hat sich von [10] Macromol nachgedruckt. Biosci., 12, Xie, J., Ma, B., Michael, PL & Shuler, FD FabriKation Nanofasergerüste mit Abstufungen in Fiber-Organisation und deren Anwendungsmöglichkeiten. 1336-1341, Copyright 2012, mit Genehmigung von Wiley-VCH.
Abbildung 3: REM-Bilder der Nanofaser PCL abgestuft Gerüst bei 0 mm (A), 2 mm (B), 4 mm (C) und 6 mm (D). Die sekundären Bilder Fourier schnelle Übertragungsmuster (FFT). Muster (A) ist, dass der ausgerichteten Fasern, (D) legt nahe, Wirrfaserablagerung. Diese Zahl hat sich von [10] Macromol nachgedruckt. Biosci., 12, Xie, J., Ma, B., Michael, PL & Shuler, FD Herstellung von Nanofasergerüste mit Abstufungen in Fiber-Organisation und deren Anwendungsmöglichkeiten. 1336-1341, Copyright 2012, mit Genehmigung von Wiley-VCH.
FiguWieder 5: (A) Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme von Cumarin 6 eingekapselten Fasern. (B) Die Grafik zeigt die Fluoreszenzintensität auf dem Schafott. Der lineare Anstieg bedeutet eine allmähliche Veränderung in der chemischen Konzentration durch das Schafott. Diese Zahl hat sich von [10] Macromol nachgedruckt. Biosci., 12, Xie, J., Ma, B., Michael, PL & Shuler, FD Herstellung von Nanofasergerüste mit Abstufungen in Fiber-Organisation und deren Anwendungsmöglichkeiten. 1336-1341, Copyright 2012, mit Genehmigung von Wiley-VCH.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Anschubfinanzierung von der University of Nebraska Medical Center und National Institute of Health (Förderkennzeichen 1R15 AR063901-01) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polycaprolactone | Sigma-Aldrich | 440744 | |
| N,N-Dimethlyformamide | Fisher Chemical | D-119-1 | |
| Dichloromethane | Fisher Chemical | AC61093-1000 | |
| Coumarin 6 | Sigma-Aldrich | 546283 | |
| Adipose Derived Stem Cells | Cellular engineering Technologies | HMSC.AD-100 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 26140-111 | |
| Fluorescein Diacetate | Sigma-Aldrich | F7378 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | |
| α-Modified Eagle's Medium | Invitrogen | a10490-01 | |
| Acetone | Fisher Scientific | s25120a | |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 10010023 | |
| Glass Slides | VWR international, LLC | 101412-842 | |
| Syringe Pump | Fisher Scientific | 14-831-200 | Single syringe |
| Ultrasonic Cleaner | Branson | 1510 | |
| High Voltage DC Power Supply | Gamma High Voltage Research | ES30 | |
| Scanning Electron Microscope | FEI | Nova 2300 | |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Axio Imager 2 |
References
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