Abstract
Tidig embryogenes utgående från en enda cell zygot går igenom snabb celldelning och morfogenes och är morfologiskt kännetecknas av för-globulära, globulära, hjärta, torped och Cotyledon stadier. Denna gradvisa utvecklingen är under strikt reglering av ett komplext molekylärt nätverk. Skörd tillräckliga tidiga embryon i en liknande utvecklingsstadium är nödvändig för att utreda den cellulära och molekylära regleringen av tidig embryogenes. Detta är inte okomplicerat, eftersom tidig embryogenes genomgår snabb morfogenes i en kort stund exempelvis 8 dagar för Medicago truncatula att nå tidigt cotyledon skede. Här, vi ta upp frågan med två metoder. Den första fastställer en koppling mellan embryoutvecklingen och pod morfologi hjälpa ange etappen av zygotiska embryot. Detta är speciellt baserat på antalet av pod spiraler och utveckling av ryggarna. Ett alternativt sätt för att göra den in vivo-studies är via odling leaf explants att producera somatiska embryon. Mediet innehåller en ovanlig hormon kombination - en auxin (1-naftalenättiksyra), en cytokinin (6-bensylaminopurin), abskisinsyra och gibberellinsyra. De olika stegen kan urskiljas som växer ut ur kallus utan dissektion.
Introduction
Baljväxter är den tredje största familjen av högre växter med cirka 20.000 arter och Leguminosae (eller Fabaceae) familj är andra spannmål i området skördas och den totala produktionen 1. Sojabönor är den tredje största odlade grödan. Trindsäd ger ungefär en tredjedel på protein och en tredjedel av vegetabilisk olja som livsmedel 2. Baljväxter med deras N2 fastställande kapacitet bidrar också till hållbara jordbrukssystem. Medicago truncatula, som sojabönor, lagrar protein och olja i hjärtbladen av dess frön och är en genetisk och genom baljväxter modell med stora genetiska och genomiska resurser 3,4. Medan M. truncatula har möjliggjort framsteg i att förstå baljväxter-Rhizobium symbios 4 har det i allt högre grad används för att studera baljväxter utsäde biologi 5-7 och embryo 8,9. Arabidopsis embryogenes har studerats 10,11 men det jagsa icke-baljväxter och uppgifter om embryogenes är inte identisk med Medicago 8,10. Zygotisk embryogenes i M. truncatula har intressanta funktioner, med en distinkt flercellig hypofysen, en endoployploid suspensor och basalöverföringscell 8.
Somatisk embryogenes (SE) är vanligen används för att regenerera växter 12. I baljväxter modell M. truncatula, fröet linjen Jemalong 2HA (2HA) har utvecklats från moder Jemalong att ha höga hastigheter av somatisk embryogenes 13. Antalet embryon som producerats har nyligen sak ökas genom att lägga både gibberellinsyra (GA) och abskisinsyra (ABA) till den sedan länge etablerade mediet 14. I detta fall är GA och ABA verkar synergistiskt, vilket är ovanligt med tanke på att GA och ABA agera vanligtvis antagonistiskt 14. Embryona framställts av kallus utvecklas på ytan som medger det stadium av embryogenes till lätt bestämmas visually och lätt skördas. Med nära isogena linjer som är embryo (2HA) och icke-embryo (Jemalong) underlättar undersökning av somatisk embryogenes och har både in vivo och in vitro-system ger olika experimentella möjligheter.
Förstå cellulära och molekylära mekanismer av embryoutveckling är avgörande för att förstå utsäde och växtutveckling. I baljväxter, som i andra dikotyledoner, är det hjärtbladen av embryot som lagrar de produkter som används för människoföda. Tidig embryogenes innebär snabb celldelning, och rätt embryo mönstring. I cirka 8 dagar efter befruktningen, M. truncatula embryo når tidigt Cotyledon stadier. Den morfologiska karakteriseringen är inte precis indikeras av dagar efter befruktningen i växthusbetingelser. Således är värdefullt att studera genetiska regul en effektiv standardiserad metod för att ange scenen utvecklings embryonation av tidig zygotiska embryogenes.
I detta dokument ger vi två standardiserade protokoll för att samla utvecklings embryon för biologiska studier av embryogenes i baljväxter modell M. truncatula. Den första är att samla zygotiska embryon genom att associera embryogenes och pod morfologi medan den andra är somatisk embryogenes via odling blad explants att tillhandahålla lättillgängliga stora embryonummer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Zygotic embryoutveckling
- Växtmaterial
- Odla Medicago truncatula vildtyp Jemalong eller dess nära isogena, höggradigt åter generable genotyp Jemalong 2HA 13 (känt som 2HA) i ett växthus med en 14 h fotoperiod och 23 ° C / 19 ° C dag / natt-temperatur.
- Pierce yta fröhöljet (med en 23 G nål) före sådd utsäde så att vatten tillåts komma in i utsäde och blöt i vatten över natten. Lägg tillräckligt med vatten för att helt täcka fröet.
- Sugga 3 frön i varje kruka diameter 15 cm (totalt 10 krukor) i planteringsjord blandning (grov sand, perlit, kokos-torv (1: 1: 1) plus 5 g Osmocote Exact Standard: övergång gödselmedel långsam) och transfer till växthus. Behåll den hälsosammaste plantan efter groning så det finns 1 planta per kruka och surround med en spaljé för anläggningen stjälkar att klättra.
- Odla Medicago truncatula vildtyp Jemalong eller dess nära isogena, höggradigt åter generable genotyp Jemalong 2HA 13 (känt som 2HA) i ett växthus med en 14 h fotoperiod och 23 ° C / 19 ° C dag / natt-temperatur.
- Skörd Pods
- Samla skida från wild typ Jemalong eller 2HA att erhålla tidig embryosteg som först beskrevs 9.
OBS: De olika pod stegen är visade i fig 1 och motsvarande embryostadier visas i Figur 2. - Kontrollera de olika pod steg vid skörd med hjälp av kriterier som enligt tabell 1. Mät den tid som förflyter från steg 6 för att hjälpa separata steg 6 och 7 (Tabell 2).
- Samla skida från wild typ Jemalong eller 2HA att erhålla tidig embryosteg som först beskrevs 9.
- Dissekera ovules från baljor och kontroll embryostadiet
- Isolera ovules från skida med fin pincett ensam eller en stereo dissekera mikroskop och pincett vid behov. Vid behov embryostadiet kan snabbt kontrolleras med en vanlig sammansatt mikroskop (Figur 3B).
- Förbered modifierad Hoyer lösning innehållande 7,5 g gummi arabicum, 100 g kloralhydrat, 5 ml glycerol, 60 ml avjoniserat destillerat vatten. Lös genom omröring under 3-5 h eller över natten.
- För mer förfinad mikroskopi rensa dissekerade fröämnen i modifierad Hoyer lösning 15,16. Plocka försiktigt upp de intakta ovules och plats i en liten volym Hoyer lösning (tillräckligt för att täcka fröämnet) vid rumstemperatur tills den är klar.
- Visa proverna med differential interferens kontrast (DIC) optik. Fånga bilder iwth en digitalkamera 9 (Figur 2).
- Skaffa de enhetliga ovules från de centrala delarna av kapseln och samla det nödvändiga antalet. Ett exempel visas i figur 3A. Samla ovules på is och förvara vid önskad temperatur (-80 ° C under nukleinsyror) för vidare analys.
OBS: För mer information om analys av histologiska sektioner, transmissionselektronmikroskopi, och in situ hybridisering se papper 8,9.
2. Somatisk embryoutveckling in vitro
- Använd en M. truncatula kultivar thatten är i stånd att lätt bilda embryon i odling. För detta protokoll för blad explantat använder 2HA växter 13,17 som är 2-4 månader gamla.
- Ta flygblad från senaste nästan fullt expanderade treflikiga blad av en förlängning stam.
- Håll trifoliate blad på fuktigt pappershanddukar i ett odlings pott för att undvika uttorkning.
OBS: När trifoliate blad skördas måste de kunna utnyttjas med minimal fördröjning. - Framställning av odlingsmediet
- Använd P4 10: 4: 1: 5-medium i agar (0,8% vikt: vol) i 9 cm Petri-skålar.
OBS: P4 10: 4: 1: 5 mediet består av P4-basalt medium 18 plus 10 pM 1-naftalenättiksyra (NAA), 4 | iM 6-bensylaminopurin (BAP), 1 | iM abscisinsyra (ABA) och 5 ^ M gibberellic syra (GA). Användningen av GA + ABA accelererar embryobildning och orsakar materiella ökningar i embryo nummer 14. - Gör upp P4 basala medium i 1 L; bestående av stora salter (se Calcium upp separat), mindre salter och vitaminer (tabell 3), kelaterad järn (make up separat), kasaminosyror (kaseinhydrolysat), 30 g sackaros, 8 g agar.
- Butiksstamlösningar av större salter, kalcium, kasaminosyror, mindre salter och vitaminer vid -20 ° C i lämpliga alikvoter. Förvara kelaterat järn vid 4 ° C.
- Gör upp kelaterat järn (200x) genom att lösa 7,44 g Na2EDTA • 2H 2 O i cirka 900 ml avjoniserat destillerat vatten under omrörning, sedan föra lösningen till 98-99 ° C under tillsats av 1,853 g FeSO 4 • 7H 2 O. Slutligen gör upp till 1 L när ingredienserna löses. Förvaras i bärnstensfärgad flaskor vid 4 ° C.
- Gör upp P4 basmedium med stamlösningar som i tabell 4. Hormonerna i mediet är 10 iM NAA, 4 iM BAP, 1 iM ABA, 5 iM GA (se tabell 4 och specifika material tabell). Lägg till NAAoch BAP före autoklavering och till ABA och GA efter autoklavering och kylning till ca 55 ° C, med användning av filtersterilisering med en 0,22 pm filter fäst vid en spruta. Blanda väl genom att försiktigt snurra.
- Justera media till pH 5,8 med 1 M KOH före autoklavering. Autoklav vid 121 ° C under 20 minuter.
- Efter autoklavering till filtersteriliserat ABA och GA, och häll ca 25 ml av media till sterila 9 cm petriskålar i ett laminärt flöde huva eller biologiskt skåp. Kyl och låt agar in med locket. Lägg sedan på locket och se till att det inte finns någon kondensat på locket. Etikett som krävs och förvara vid 4 ° C (i en kartong för att förhindra locket kondensat).
- Använd P4 10: 4: 1: 5-medium i agar (0,8% vikt: vol) i 9 cm Petri-skålar.
- Sterilisering av bladvävnad
- Arbeta i en UV-steriliserad laminärt flöde huva eller biologiskt skåp.
- Plats lämnar in mask boll av en tidigare autoklaverat våren te infusions.
- Doppa te infusionsanordningen innehållande bladen i 70% (volym: volym) etanol i en återvändsgrändTure potten för 30 sek.
OBS: För alla steg i detta förfarande använda 250 ml skruvlock polykarbonat kultur krukor som autoklaveras. - Drain och överför sedan och sänk ned bladvävnad i 1: 8 (volym: volym) utspätt blekmedel (0,5% klor) under 10 min. Snurra försiktigt från tid till annan.
- Töm blekmedel och överföra te infusionsanordningen i en kultur kruka innehållande sterilt avjoniserat destillerat vatten. Försiktigt snurra och dränera överflödigt vatten. Upprepa en gång med en ny kultur pott sterilt avjoniserat destillerat vatten.
- Ta bort bladen från te infusionsanordningen med sterila pincett till en ny kultur pott sterilt avjoniserat destillerat vatten. Skruva på den sterila huven och skölj genom att vända och snurra. Lämna blad flyter på sterilt vatten tills redo att förbereda explants.
- Förbereda och plätering Explantat
- Använda sterila tekniker, trimma individuella steriliserade broschyrer från kanten med en skalpell och skär återstående rektangeln i två eller three rektangulära explantat (8-10 x 3-5 mm) med mitt ven i mitten av varje Explantation (Figur 5A).
OBS: Storleken på explantatet är ganska viktigt i att initiera den första callusing. Utför skärningen på sterila lock från take-away matbehållare. - Platta 6 explantat på agar-stelnat odlingsmedium i 9 cm diameter petriskålar (figur 5B). Plate explantaten abaxial nedåt för att upprätthålla normala blad orientering.
- Täta petriskålar med Parafilm (Figur 5C) sträckta runt skålen. Vävnaden är nu klar för inkubation.
- Använda sterila tekniker, trimma individuella steriliserade broschyrer från kanten med en skalpell och skär återstående rektangeln i två eller three rektangulära explantat (8-10 x 3-5 mm) med mitt ven i mitten av varje Explantation (Figur 5A).
- Vävnads Inkubation
- Inkubera plattorna i mörker vid 28 ° C i ett rum med reglerad temperatur eller tillväxt skåp under hela odlingsperioden.
OBS: Explantaten kommer att inleda dedifferentiering, genomgå celldelning, spridning (kallusbildning) och embryo (differentiering). - Subkultur differentierings instuktionernanätter efter 3 veckor på till färskt medium. Vid denna subkultur överföra hela explantatet med en steril spatel och pincett av rostfritt stål, i ett laminärt flöde huva eller en biologiskt skåp. Som callusing inträffar och kallus överskrider storleken på den största en i fig 5C, överför 50% av den individuella kallus när subkultivering till färskt medium.
- Observera första embryon i ca 4 veckor. Även om det finns en viss grad av synkroni, samla olika embryo stadier under en 4-8 veckor inkubationstid (Figur 6A, B). Samla under ett dissektionsmikroskop och förfarandet enligt experimentella syften.
- Subkultur var 3 veckor och ta bort embryon periodvis så att explantaten kommer att fortsätta att producera embryon i tre månader.
- Inkubera plattorna i mörker vid 28 ° C i ett rum med reglerad temperatur eller tillväxt skåp under hela odlingsperioden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För zygotiska embryo olika pod strukturer som motsvarar de olika embryostadier visas i fig 1A - F medan de olika embryostadier visas i figur 2A - F. Genom att välja skida i samma skede, prover av fröämnen som är ganska enhetlig kan erhållas (figur 3A). Genom användning av RT-qPCR embryo specifika gener kan lätt detekteras och tidsförloppsstudier utvärderades nio. Några ytterligare dissektion kommer att möjliggöra ytterligare anrikning av embryot (Figur 3B). Behandling för in situ kan hybridiserings strategier lätt genomföras samt eventuella kompletterande studier med ljus (Figur 4A, B) och elektronmikroskopi 8. Av särskilt värde i detta system är särskiljningsförmåga hypofysen och suspensor (Figur 4A, B).
För somatisk embryogenes cUtting av den ursprungliga explantatet från de individuella småbladens visas i figur 5A. Explantaten placeras sedan abaxial sidan upp i nära kontakt med ägarn (figur 5B). Efter kallusbildning embryon börjar dyka upp efter 3-4 veckor och 7 veckor finns det många embryon vid hjärtbladsnod stadiet (figur 5C). Genom att följa plattorna genom mellan vecka 4 och 7 embryon vid diskreta stadier kan lokaliseras (Figur 6A, B). De olika embryosteg lätt kan uppfattas och enkelt plockas bort för analys. Detta kan vara ganska ett snabbt sätt att få vissa typer av information. Exempelvis Figur 7 illustrerar hur embryon vid det tidiga hjärtbladsstadiet visade expression av en typ av MtOLEOSIN genen men inte en annan. Tidsförlopp studier av genen av intresse kan sedan undersökas med hjälp av zygotisk eller somatiska embryon. En särskild fördel med det somatiska embryosystem är att omvandlingen av Calluar kan utföras utan att regenerera en hel växt och genuttryck i olika stadier av embryogenes visualiseras med GUS (β-glukuronidas) eller fluorescerande markörer. Ett exempel visas i figur 6C.
Figur 1: Pod morfologi och stadier embryoutveckling Pods i olika utvecklingsstadier med embryon vid diskreta steg.. Stegen 2-7 anges. (A) och (B) är stegen 2 och 3 mycket tidiga och tidiga pre-klotformiga (C) steg 4 tidigt klotformiga (D) etapp 5 sen klotformiga (E) etapp 6 hjärta och (F) etapp 7 sen torped. Bar är 2 mm. Steg I är blomning (ej visad).
Figur 2: Embryo utvecklingsstadier. </ Strong> Cleared embryon vid olika utvecklingsstadier. (A) steg 3 tidig pre-klotformiga, (B) steg 4 tidigt klotformiga, (C) etapp 5 sen klotformiga, (D) etapp 6 hjärta, och (e) etapp 7 sen torped. Bar är 60 pm.
Figur 3: Isolerad ovules (A) Gruppen fröämnen med etapp 5 embryon.. (B) ovule betraktas under standardförening mikroskop för att visa embryo som kan skäras ut på "hook" slut. Bar är en mm (A) och 200 | j, m (B).
Figur 4:. Morfologi tidiga embryot (A) Sektion genom mycket tidiga embryot showing embryot korrekt (fyra celler), hypofys (kommande fyra celler), suspensor (kommande fyra celler som har stora vakuoler) och förhållande till fröämnet vävnader. (B) Sektion genom tidiga torped skede embryo (E) med framträdande suspensor (S). Färgades med toluidinblått. Bar är 10 ^ m (A) och 50 | j, m (B).
Figur 5:. Odling explants att producera somatiska embryon (A) treflikiga blad som visar där explants från örtblad tas. (B) Explantat utströks på agar. (C) Somatiska embryon som framställts av explantat efter 7 veckors odling. Bar IS10 mm
Figur 6: Somatisk embryosteg och identifiera lokaliseringen av genen expression med hjälp av transformation och GUS. (A) Somatiska embryon i klotformiga (G), hjärta (H) och torped (T) steg. (B) Somatiska embryon i tidigt cotyledon skede. (C) Klotformigt stadium somatiskt embryo som visar stark GUS-expression för MtWOX9 genen i embryo korrekt (E) och minskande färgning i hypofys (H) och suspensor (S). Bar (A, B) är 100 ^ m. Bar (C) är 50 | am.
Figur 7: Genuttryck duing embryogenes in vitro med användning av kvantitativ polymeraskedjereaktion (qPCR) Gene expression av OLEOSIN3 (A) och OLEOSIN4 (B) i tidig Cotyledon stadium embryon exciderade från embryon från embryogen kallus.. Expression är relativ to blad. Standardfel indikeras.
| Steg nummer | Embryostadiet | Pod stadium |
| Etapp 1 | Blomma på antes | |
| Etapp 2 | Mycket tidigt pre-klotformiga embryo | Pod med en eller två spiraler |
| Steg 3 | Tidig pre-globulära embryo | Pod med tre kompletta spiraler |
| Steg 4 | Tidig globulära | Pod med fem kompletta spiraler och ryggar inte syns |
| Steg 5 | Sen globulära | Pod med sex spiraler och omogna ryggar högst pod bredd |
| Steg 6 | Hjärta steget | Pod med sex spiraler och långsträckta förfallande ryggar över pod bredd |
| Steg 7 | Torpedostadium | Pod med sex spiraler, mogna tjockare längre ryggar och ökad omkrets |
Tabell 1: Kriterier för skörd av pod steg morfologiska kriterier som används för att identifiera pod steg motsvarande definierade embryostadier..
| Blomma Steg 1 (S1) | Pod Stage 2 (S2) | Pod Stage 3 (S3) | Pod Stage 4 (S4) | Pod Stage 5 (S5) | Pod Steg 6 (S6) | Pod Steg 7 (S7) | |
| Dagar | 0 | 1,5-2 | 0,5-1 | 0,5 | 0,5-1 | 1 | 1-1,5 |
Tabell 2. Tidsförlopp för pod samling. Tiden från than tidigare embryoutvecklingsstadiet anges i dagar.
| Större salter / L | Mindre salter / L | Vitaminer / L | |||
| mg | mg | mg | |||
| KNO3 | 1875 | MnSO 4 • H2O | 10 | Myo-inositol | 100 |
| NH 4 NO 3 | 600 | H 3 BO 3 | 3 | Tiamin HCl | 10 |
| KH 2 PO 4 | 131 | ZnSO 4 • 7H 2 O | 2 | Nikotinsyra | 1 |
| KCL | 225 | <td> KI0,75 | Pyridoxin-HCl | 1 | |
| MgSO 4 • 7H 2 O | 225 | Na 2 Moo 4 • 2H 2 O | 0,25 | ||
| Kalcium separat | CUSO4 • 5H 2 O | 0,025 | |||
| CaCl2 • 2 H2O | 300 | CoCl2 • 6H 2 O | 0,025 | ||
| Kelaterat järn separat | |||||
| FeSO 4 • 7H 2 O | 9,267 | ||||
| Na2EDTA • 2 H2O | 37,2 | ||||
Tabell 3: P4 Medium Komponenterna i P4-mediet..
| Komponent | Mängd / L |
| 10 x stora salter | 100 ml |
| 100 x kalcium | 10 ml |
| 1000 x mindre salter | 1 ml |
| 200 x järn | 5 ml |
| 100 x kasaminosyror | 10 ml |
| 1000 x vitaminer | 1 ml |
| Sackaros | 30 g |
| Agar | 8 g |
| Hormoner | |
| 1000 pM NAA | 10 ml |
| 1000 ^ iM BAP | 4 ml |
| 1000 nM ABA | 1 ml | </ Tr>
| 1000 pM GA | 5 ml |
Tabell 4: Göra upp P4 medium med hormoner att göra upp P4 medium med hormoner från stamlösningar..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De protokoll som beskrivs är relativt rakt fram och tillåta undersökning av baljväxter embryogenes med alla moderna cell- och molekylärbiologiska metoder. Vi är medvetna om att det finns fördelar och nackdelar med både in vivo och in vitro metoder. Båda ge mer fokus på tidig embryogenes jämfört med odling av omogna frön 19.
I fallet med in vivo-studier vad som beskrivs övervägande isoleringen av fröämnet från kapseln, som är lämpliga för många embryo studier. Det är naturligtvis möjligt att ytterligare berika för embryovävnad genom skärning av "hake" område (figur 3B). Det är svårt att isolera de allra tidigaste stadiet av embryoutvecklingen som under disection embryot ofta försvinner eftersom det inte är väl fäst till intilliggande vävnad, vilket gör användningen av ovules fördelaktiga. Använda pod morfologi eliminerar märkning av blommor och med en tid course ordning för varje blomma. Dessutom finns det potential variationer i utvecklingstids metoder om miljön är mycket hårt kontrollerad. Optimal planttillväxt är viktig för att pod bildning inte inträffar under stressförhållanden. Bekanta dig med pod utveckling och små justeringar kan göras för att fastställa morfologiska steg för att matcha specifika stadier embryoutveckling.
Vid somatisk embryogenes, måste det erkännas att embryona härrör asexuellt och inte från en zygot. Dessutom är näringskälla olika till zygotiska embryot. I fallet med somatiska embryot är det odlingsmediet och omgivande kallus, och i fallet av det zygotiska embryot är frövitan. Detta betyder att suspensor är mycket bättre utvecklad i fallet med den zygotiska embryot (Figur 4A, B). Den speciella värdet på M. truncatula system är det stora antalet embryon som svar på den ovanliga fyra hormone regimen. Om det stora antalet inte förekommer då kontrollera uppgifter om att upp hormoner och deras tillsats till mediet bör kontrolleras. Som med alla kultur metodik sterilitet explantatet vävnad utan skador (göra små justeringar av tidpunkten för etanol och hypoklorit steriliseringstider om detta är ett problem) är viktigt tillsammans med vården för att upprätthålla sterilitet under alla förberedande steg.
Vad vi har funnit är att det är värdefullt att komplettera in vivo och in vitro processer. Ett exempel från våra egna studier är undersökningen av transkriptionsfaktorn MtSERF1 (somatiskt embryo besläktad faktor 1) som är en eten svar transkriptionsfaktor-genen. MtSERF1 upptäcktes först i somatiska embryon med hjälp av RNAi, promotor-GUS fusioner och in situ-hybridiseringar; och sedan visas att uttryckas i zygotisk embryogenes 20.
Studiet av baljväxter embryogenes är viktigt för hUman näring, och med hjälp av M. truncatula embryon tillsammans med de cellulära och molekylära tekniker finns nu kan förbättra detta område. Insight kan erhållas om hur embryostorlek och därmed avkastning kan optimeras tillsammans med erforderlig kolhydrater, olja och proteinsammansättning. Dessa bestämningsfaktorer är till stor del ligger i tåget i början av embryogenes 8,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P4 medium | Sigma-Aldrich | Use Sigma-Aldrich Chemicals or other analytical grade supplier | |
| Major salts | |||
| Minor salts | |||
| Vitamins | |||
| Agar | Bacto Laboratories | 214010 | Bacto agar |
| Plant hormones | |||
| 1-Naphthaleneacetic acid | Sigma-Aldrich | N0640 | Dissolve in small amount of 1 M NaOH |
| Abscisic acid | Sigma-Aldrich | A1049 | Dissolve in small amount of 1 M NaOH |
| 6-Benzylaminopurine | Sigma-Aldrich | B3274 | Dissolve in MQ water with heating and few drops 1N HCl |
| Gibberellic Acid | Sigma-Aldrich | G7645 | Dissolve in small amount of ethanol |
| Equipment | |||
| Stereo dissecting microscope | Leica | MZFLIII | Or similar |
| Light microscope | Zeiss | Axiophot | Or similar, with suitable optics |
| Digital camera | Zeiss | AxioCam HRc | Or similar |
| Sterilising leaves | |||
| 250 mL screw cap polycarbonate container with polypropylene lid | SARSTEDT | 75.9922.519 | Autoclavable |
References
- Gepts, P., et al. Legumes as a model plant family. Genomics for food and feed report of the cross-legume advances through genomics conference. Plant Physiol. 137 (4), 1228-1235 (2005).
- Graham, P. H., Vance, C. P. Legumes: importance and constraints to greater use. Plant Physiol. 131 (3), 872-877 (2003).
- Young, N. D., Udvardi, M. Translating Medicago truncatula genomics to crop legumes. Curr. Opin. Plant Biol. 12 (2), 193-201 (2009).
- Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insights into the evolution of rhizobial symbioses. Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).
- Gallardo, K., Le Signor, C., Vandekerckhove, J., Thompson, R. D., Burstin, J. Proteomics of Medicago truncatula seed development establishes the time frame of diverse metabolic processes related to reserve accumulation. Plant Physiol. 133 (2), 664-682 (2003).
- Verdier, J., et al. Gene expression profiling of M. truncatula transcription factors identifies putative regulators of grain legume seed filling. Plant Mol. Biol. 67 (6), 567-580 (2008).
- Thompson, R., Burstin, J., Gallardo, K. Post-genomic studies of developmental processes in legume seeds. Plant Physiol. 151 (3), 1023-1029 (2009).
- Wang, X. -D., Song, Y., Sheahan, M. B., Garg, M. L., Rose, R. J. From embryo sac to oil and protein bodies: embryo development in the model legume Medicago truncatula. New Phytol. 193 (2), 327-338 (2012).
- Kurdyukov, S., Song, Y., Sheahan, M. B., Rose, R. J. Transcriptional regulation of early embryo development in the model legume Medicago truncatula. Plant Cell Rep. 33 (2), 349-362 (2014).
- Mansfield, S. G., Briarty, L. G. Early embryogenesis in Arabidopsis thaliana. 2. The developing embryo. Can. J. Botany. 69 (3), 461-476 (1991).
- Seefried, W. F., Willman, M. R., Clausen, R. L., Jenik, P. D. Global regulation of embryonic patterning in Arabidopsis by microRNAs. Plant Physiol. 165 (2), 670-687 (2014).
- Birnbaum, K. D., Sánchez Alvarado, A. Slicing across kingdoms: regeneration in plants and animals. Cell. 132 (4), 697-710 (2008).
- Rose, R. J., Nolan, K. E., Bicego, L. The development of the highly regenerable seed line Jemalong 2HA for transformation of Medicagotruncatula - implications for regenerability via somatic embryogenesis. J. Plant Physiol. 155 (6), 788-791 (1999).
- Nolan, K. E., Song, Y., Liao, S., Saeed, N., Zhang, X., Rose, R. J. An unusual ABA and GA synergism increases somatic embryogenesis, facilitates its genetic analysis and improves transformation in Medicago truncatula. PloS ONE. 9 (6), e99908 (2014).
- Liu, C. M., Meinke, D. W. The titan mutants of Arabidopsis are disrupted in mitosis and cell cycle control during seed development. Plant J. 16 (1), 21-31 (1998).
- Nolan, K. E., Kurdyukov, S., Rose, R. J. Expression of the SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE 1 (SERK1) gene is associated with developmental change in the life cycle of the model legume Medicago truncatula. J. Exp. Bot. 60 (6), 1759-1771 (2009).
- Iantcheva, A., Vlahova, M., Atanassov, A., et al. Somatic embryogenesis from leaf explants. The Medicago truncatula handbook. Mathesius, U. , Available from: http://www.noble.org/MedicagoHandbook (2006).
- Thomas, M. R., Johnson, L. B., White, F. F. Selection of interspecific somatic hybrids of Medicago by using Agrobacterium transformed tissues. Plant Sci. 69 (2), 189-198 (1990).
- Ochatt, S. J. Immature seeds and embryos of Medicago truncatula cultured in vitro. Plant Embryo Culture: Methodsand Protocols, Methods in Molecular Biology. Thorpe, T. A., Yeung, E. C. 710, Springer protocols, Humana press. 39-52 (2011).
- Mantiri, F. R., Kurdyukov, S., Lohar, D. P., Sharopova, N., Saeed, N. A., Wang, X. D., VandenBosch, K. A., Rose, R. J. The transcription factor MtSERF1 of the ERF subfamily identified by transcriptional profiling is required for somatic embryogenesis induced by auxin plus cytokinin in Medicago truncatula. Plant Physiol. 146 (4), 1622-1636 (2008).
