Abstract
Tidlig embryogenese ud fra en enkelt celle zygote går gennem hurtig celledeling og morfogenese, og er morfologisk kendetegnet ved præ-globulære, globulære, hjerte, torpedo og kimblad etaper. Denne gradvise udvikling er under den stramme regulering af et komplekst molekylær netværk. Høst tilstrækkelige tidlige embryoner på et tilsvarende udvikling er afgørende for at undersøge den cellulære og molekylære regulering af tidlig embryogenese. Dette er ikke ligetil, da tidlig embryogenese undergår hurtig morfogenese i en kort tid fx 8 dage for Medicago truncatula at nå den tidlige cotyledon fase. Her løse vi problemet ved to tilgange. Den første etablerer en kobling mellem udvikling embryo og pod morfologi i at hjælpe angive den fase af zygotisk embryo. Dette er især baseret på antallet af pod spiraler og udviklingen af pigge. En alternativ måde at supplere in vivo studies er via dyrkning bladeksplantater at producere somatiske embryoer. Mediet omfatter en usædvanlig hormon kombination - et auxin (1-naphthaleneddikesyre), et cytokinin (6-benzylaminopurin), abscisinsyre og gibberellinsyre. De forskellige trin kan skelnes vokser ud af callus uden dissektion.
Introduction
Bælgfrugter er den tredje største familie af højere planter med ca. 20.000 arter og Leguminosae (eller Fabaceae) familie er andet til korn i området høstet og samlet produktion 1. Sojabønner er den tredje største dyrkede afgrøde. Bælgplanter giver omkring en tredjedel af kosten protein og en tredjedel af vegetabilsk olie til konsum 2. Bælgplanter med deres N2 fastsættelse kapacitet bidrager også til bæredygtige landbrugssystemer. Medicago truncatula, ligesom soja, butikker protein og olie i kimbladene sine frø og er en genetisk og genomisk bælgplanter model med betydelige genetiske og genomiske ressourcer 3,4. Mens M. truncatula har gjort det muligt fremskridt i forståelsen af bælgplante-Rhizobium symbiose 4 er det blevet mere og mere anvendt til at studere frø af bælgplanter biologi 5-7 og embryogenese 8,9. Arabidopsis embryogenese er blevet omfattende undersøgt 10,11, men det jegsa ikke-bælgplanter og detaljerne i embryogenese er ikke identiske med Medicago 8,10. Zygotisk embryogenese i M. truncatula har interessante funktioner, med en karakteristisk multicellulær hypofysen, en endoployploid Suspensor og basal transfer celle 8.
Somatisk embryogenese (SE) er almindeligt anvendt til at regenerere planter 12. I bælgplanter model M. truncatula, frø linje Jemalong 2HA (2HA) er udviklet fra moderselskabet Jemalong at have høje somatisk embryogenese 13. Antallet af embryoner er for nylig blevet indholdsmæssigt forøget ved tilsætning både gibberellinsyre (GA) og abscisinsyre (ABA) til længe etablerede medium 14. I dette tilfælde GA og ABA virker synergistisk, hvilket er usædvanligt, GA og ABA gælder almindeligvis antagonistisk 14. Der er produceret af callus embryoner udvikle sig på overfladen, som tillader den fase af embryogenese til let bestemmes visually og let høstes. Under nær isogene linjer, der er embryogent (2HA) og ikke-embryogenisk (Jemalong) letter undersøgelse af somatisk embryogenese, og som har både in vivo og in vitro-systemer giver forskellige eksperimentelle muligheder.
Forståelse af de cellulære og molekylære mekanismer i udviklingen embryo er afgørende for forståelsen frø og planter udvikling. I bælgplanter, som i andre tokimbladede, er kimbladene af embryonet at oplagre produkter, som anvendes til human ernæring. Tidlig embryogenese involverer hurtig celledeling, og korrekt embryo mønster. I ca. 8 dage efter befrugtningen, M. truncatula embryo når tidlige cotyledon faser. Den morfologiske karakterisering er ikke ligefrem angivet ved dage efter befrugtningen i drivhusbetingelser. Således en effektiv standardiseret tilgang til at angive den fase af udviklingslandene embryoner er værdifuld i at studere den genetiske regulation af tidlig zygotisk embryogenese.
I dette papir, giver vi to standardiserede protokoller til at indsamle udviklingslandene embryoner til biologiske undersøgelser af embryogenese i bælgplanter model M. truncatula. Den første er at indsamle zygotiske embryoner ved at associere embryogenese og pod morfologi, mens den anden er somatisk embryogenese via dyrkning bladeksplantater at tilvejebringe nemt tilgængelige store embryo tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. zygotiske Embryo Development
- Plantemateriale
- Grow Medicago truncatula vildtype Jemalong eller dens nær isogen, stærkt igen generable genotype Jemalong 2HA 13 (kendt som 2HA) i et drivhus med en 14 timers fotoperiode og 23 ° C / 19 ° C dag / nat temperatur.
- Pierce overfladen af frøskal (med en 23 G nål) før såning frøene, så vandet får lov til at komme ind i frø og blød i vand natten over. Tilføj vand nok til fuldt ud at dække frøet.
- Sow 3 frø i hver 15 cm i diameter pot (i alt 10 potter) i pottemuld blanding (groft sand, perlite, kokos-tørv (1: 1: 1) plus 5 g Osmocote Exact Standard: langsom frigivelse gødning) og transfer til drivhus. Behold den sundeste sætteplante efter spiring, så der er 1 plante pr potte og surround ved et espalier for anlægget stængler at klatre.
- Grow Medicago truncatula vildtype Jemalong eller dens nær isogen, stærkt igen generable genotype Jemalong 2HA 13 (kendt som 2HA) i et drivhus med en 14 timers fotoperiode og 23 ° C / 19 ° C dag / nat temperatur.
- Høst Pods
- Saml bælg fra wild typen Jemalong eller 2HA at opnå de relevante stadier tidlig embryo som først beskrevet 9.
BEMÆRK: De forskellige pod faser er vist i figur 1, og de tilsvarende faser embryo er vist i figur 2. - Tjek de forskellige pod etaper ved høst hjælp kriterier som pr tabel 1. Mål den forløbne tid fra scenen 6 at hjælpe særskilte faser 6 og 7 (tabel 2).
- Saml bælg fra wild typen Jemalong eller 2HA at opnå de relevante stadier tidlig embryo som først beskrevet 9.
- Dissekere frøanlæg fra bælg og kontrol fosterstadiet
- Isoler frøanlæg fra bælg hjælp fine pincet alene eller en stereo dissektionsmikroskop og pincet som nødvendigt. Hvis det kræves fosterstadiet kan hurtigt kontrolleres ved anvendelse af en standard sammensat mikroskop (figur 3B).
- Fremstille modificerede Hoyer opløsning indeholdende 7,5 g gummi arabicum, 100 g chloralhydrat, 5 ml glycerol, 60 ml deioniseret destilleret vand. Opløses ved omrøring i 3-5 timer eller natten over.
- For mere forfined mikroskopi slette dissekerede frøanlæg i modificeret Hoyer løsning 15,16. Pick forsigtigt de intakte frøanlæg og sted i et lille volumen Hoyer løsning (nok til at dække ovule) ved stuetemperatur, indtil klar.
- Se prøverne med kontrast differential interferens (DIC) optik. Indfange billederne iwth et digitalkamera 9 (figur 2).
- Opnå de mest ensartede frøanlæg fra det centrale område af pod og ophobes det krævede antal. Et eksempel er vist i figur 3A. Saml frøanlæg på is og opbevares ved ønskede temperatur (-80 ° C i nukleinsyrer) for yderligere analyse.
BEMÆRK: Yderligere oplysninger om analyse af histologiske snit, transmission elektronmikroskopi, og in situ hybridisering se papirer 8,9.
2. Somatisk Embryo Development in vitro
- Brug en M. truncatula sort that er i stand til let at danne embryoer i kultur. Til denne protokol for bladeksplantater bruger 2 ha planter 13,17, der er 2-4 måneder gamle.
- Tag foldere fra den seneste næsten fuldt udbygget trebladsblad af forlængede stilk.
- Hold trebladede blade på fugtigt papir frotté i en kultur pot for at undgå dehydrering.
BEMÆRK: Når trebladede blade høstes de har brug for at blive udnyttet med minimal forsinkelse. - Fremstilling af dyrkningsmediet
- Brug P4 10: 4: 1: 5-medium i agar (0,8% vægt: vol) i 9 cm Petriskåle.
BEMÆRK: P4 10: 4: 1: 5-medium består af P4 basale medium 18 plus 10 uM 1-naphthaleneddikesyre (NAA), 4 uM 6-benzylaminopurin (BAP), 1 uM abscisinsyre (ABA) og 5 uM gibberellic syre (GA). Brugen af GA + ABA accelererer dannelsen embryo og forårsager materielle stigninger i embryo nummer 14. - Der fyldes op til P4 basale medium i 1 L; bestående af store salte (gør calcium op separat), mindre salte og vitaminer (tabel 3), chelateret jern (fyldes op separat), casaminosyrer (caseinhydrolysat), 30 g saccharose, 8 g agar.
- Store stamopløsninger af større salte, calcium, casaminosyrer, mindre salte og vitaminer ved -20 ° C i egnede portioner. Opbevar chelateret jern ved 4 ° C.
- Udgør den chelaterede jern (200x) ved at opløse 7,44 g Na 2 EDTA • 2H 2 O i ca. 900 ml deioniseret destilleret vand under omrøring, derefter bringe løsningen på 98-99 ° C under tilsætning af 1,853 g FeSO4 • 7H 2 O. Endelig fyldes op til 1 l, når ingredienserne er opløst. Opbevares i ravfarvet flasker ved 4 ° C.
- Der fyldes op til P4 basale medium med stamopløsninger som i tabel 4. De hormoner i mediet er 10 pM NAA, 4 pM BAP, 1 uM ABA, 5 uM GA (se tabel 4 og specifikke materialer Table). Tilsæt NAAog BAP før autoklavering og tilføj ABA og GA efter autoklavering og afkøling til ca. 55 ° C, under anvendelse af filter sterilisering med et 0,22 um filter fastgjort til en sprøjte. Bland godt ved forsigtig hvirvlende.
- Juster medierne til pH 5,8 med 1 M KOH før autoklavering. Autoklav ved 121 ° C i 20 minutter.
- Efter autoklavering tilføje filtersteriliseret ABA og GA, og hæld ca. 25 ml medier i sterile 9 cm petriskåle i en laminar flow hætte eller biologisk kabinet. Cool og lad agaren sæt med låget. Så sat på låget og sørg for der er ingen kondensat på låget. Etiket efter behov og opbevares ved 4 ° C (i en papkasse for at forhindre låget kondensat).
- Brug P4 10: 4: 1: 5-medium i agar (0,8% vægt: vol) i 9 cm Petriskåle.
- Sterilisering af bladvæv
- Arbejde i et UV-steriliseret laminar flow hætte eller biologisk farlige kabinet.
- Sted blade ind i masken kugle af en tidligere autoklaveres fjeder te infuser.
- Fordybe te infuser indeholdende bladene i 70% (vol: vol) ethanol i en culklatur pot i 30 sek.
BEMÆRK: For alle trin i denne procedure bruge 250 ml skrue cap polycarbonat kultur potter, der autoklaveres. - Dræne og derefter overføre og nedsænke bladet væv i 1: 8 (vol: vol) fortyndet blegemiddel (0,5% chlor) i 10 min. Swirl forsigtigt fra tid til anden.
- Tøm blegemiddel og overføre te infusionsenheden i en kultur pot indeholdende sterilt deioniseret destilleret vand. Forsigtigt hvirvle og dræne overskydende vand. Gentag en gang mere med en frisk kultur pot sterilt deioniseret destilleret vand.
- Fjerne blade fra te infusionsenheden med sterile pincetter til en frisk kultur pot sterilt deioniseret destilleret vand. Skru den sterile hætte og skyl ved at vende og hvirvlende. Lad blade flyder på sterilt vand indtil den er klar til at forberede eksplantater.
- Forberedelse og Plating Eksplantater
- Ved hjælp af sterile teknikker, trim individuelle steriliserede foldere fra kanten med en skalpel, og skære de resterende rektangel i to eller three rektangulære eksplantater (8-10 x 3-5 mm) med mid-vene i midten af hver eksplantat (figur 5A).
BEMÆRK: Størrelsen af eksplantatet er ret vigtigt i at indlede den første callusing. Foretag skæringen på sterile låg fra take-away mad containere. - Plade 6 eksplantater på agar-størknet dyrkningsmedium i 9 cm petriskåle med en diameter (figur 5B). Plate eksplantaterne abaxial nedad for at opretholde normale blad orientering.
- Forsegl petriskåle med Parafilm (figur 5C) strakte sig rundt om fadet. Vævet er nu klar til inkubation.
- Ved hjælp af sterile teknikker, trim individuelle steriliserede foldere fra kanten med en skalpel, og skære de resterende rektangel i to eller three rektangulære eksplantater (8-10 x 3-5 mm) med mid-vene i midten af hver eksplantat (figur 5A).
- Tissue Inkubation
- Pladerne inkuberes i mørke ved 28 ° C i en kontrolleret temperatur rum eller vækst skab i hele dyrkningsperioden.
BEMÆRK: Eksplantaterne indleder dedifferentiering, undergå celledeling, proliferation (callus dannelse) og embryogenese (differentiering). - Subkultur den differentierende af forklaringenNTS efter 3 uger på til frisk medium. På dette subkultur overdraget hele eksplantat anvendelse af en steril rustfrit stål spatel og pincet, i en laminær strømning eller en biologisk fare kabinet. Som callusing forekommer, og callus overstiger størrelsen af den største i figur 5C, overfører 50% af den individuelle callus når subkultur til frisk medium.
- Overhold de første embryoner i ca. 4 uger. Mens der er en vis synkroni, indsamle forskellige stadier embryo over en 4-8 ugers inkubationsperiode (figur 6A, B). Indsamler under et dissektionsmikroskop og fremgangsmåde ifølge eksperimentelle formål.
- Subkultur hver 3. uge og fjern embryoner jævne mellemrum, så eksplantaterne vil fortsætte med at producere embryoer i 3 måneder.
- Pladerne inkuberes i mørke ved 28 ° C i en kontrolleret temperatur rum eller vækst skab i hele dyrkningsperioden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For zygotiske embryogenese forskellige pod strukturer svarende til de forskellige embryo faser er vist i figur 1A - F medens de forskellige embryo faser er vist i figur 2A - F. Ved at vælge bælg på samme trin, prøver af frøanlæg, der er helt ensartet kan opnås (figur 3A). Ved anvendelse af RT-qPCR embryo specifikke gener kan let detekteres og tidsforløbet undersøgelser evalueret 9. Nogle ekstra dissektion vil muliggøre en yderligere berigelse af embryo (figur 3B). Forarbejdning til in situ hybridiseringsbetingelser strategier kan let udføres samt eventuelle supplerende undersøgelser med lys (figur 4A, B) og elektronmikroskopi 8. Af særlig værdi i dette system er den særpræg hypofysen og Suspensor (figur 4A, B).
For somatisk embryogenese cUtting af den oprindelige eksplantat fra de enkelte folioles er vist i figur 5A. Eksplantaterne placeres derefter abaxial opad i tæt kontakt med agar (figur 5B). Efter callus dannelse embryoner begynder at dukke efter 3-4 uger, og med 7 uger der er mange embryoner ved cotyledon fase (figur 5C). Ved at følge pladerne gennem mellem uge 4 og 7 embryoner ved diskrete stadier kan være placeret (figur 6A, B). De forskellige embryo faser let kan opfattes og simpelthen plukket ud til analyse. Dette kan være en ganske hurtig måde at få visse typer af information. For eksempel Figur 7 illustrerer, hvordan embryoner på det tidlige stadium kimblad viste ekspression af én type MtOLEOSIN genet, men ikke en anden. Tidsforløbene undersøgelser af genet af interesse kan derefter undersøges under anvendelse af zygotisk eller somatiske embryoer. En særlig fordel ved den somatiske embryo-systemet er, at transformation af Callus kan udføres uden regenerering af en hel plante og genekspression på forskellige stadier af embryogenese visualiseret under anvendelse GUS (β-glucuronidase) eller fluorescerende mærker. Et eksempel er vist i figur 6C.
Figur 1: Pod morfologi og embryo udviklingsstadier Pods på forskellige stadier af udvikling med embryoner på adskilte faser.. Stages 2-7 angivet. (A) og (B) er trin 2 og 3 meget tidlige og tidlige pre-kugleformede (C) fase 4 tidlige kugleformede (D) fase 5 sen kugleformede (E) fase 6 hjerte og (F) etape 7 sen torpedo. Bar er 2 mm. Fase I er blomstring (ikke vist).
Figur 2: Embryo udviklingsfaser. </ Strong> Ryddet embryoner på forskellige udviklingsstadier. (A) fase 3 tidlige pre-kugleformede, (B) fase 4 tidlige kugleformet, (C) fase 5 sent kugleformet, (D) fase 6 hjerte, og (E) etape 7 sen torpedo. Bar er 60 um.
Figur 3: Isoleret frøanlæg (A) Gruppe af frøanlæg med stage 5 embryoner.. (B) ovule ses under standard sammensat mikroskop for at vise embryonet, som kan udskæres ved "krog" ende. Bar er 1 mm (A) og 200 um (B).
Figur 4:. Morfologi af den tidlige embryo (A) Snit gennem meget tidlig embryo showing embryo korrekt (fire celler), hypofysen (næste fire celler), Suspensor (næste fire celler, som har store vakuoler) og forhold til ovule væv. (B) Snit gennem tidlig torpedo stadie embryo (E) med fremtrædende Suspensor (S). Farvet med toluidinblåt. Bar er 10 um (A) og 50 um (B).
Figur 5:. Dyrkning eksplantater at producere somatiske embryoer (A) trebladsblad viser, hvor eksplantater fra foliole træffes. (B) Eksplantater udpladet på agar. (C) Somatiske embryoner fremstillet af eksplantater efter syv uger kultur. Bar IS10 mm
Figur 6: Somatiske embryo etaper og identificere placeringen af gen expression bruge transformation og GUS. (A) Somatiske embryoer ved kugleformede (G), hjerte (H) og torpedo (T) etaper. (B) somatiske embryoer på tidligt stadium kimblad. (C) Kuglehoben fase somatisk embryo i kraftig GUS-ekspression for MtWOX9 genet i embryo korrekt (E) og faldende farvning i hypofysen (H) og Suspensor (S). (A, B) er 100 um. Bar (C) er 50 um.
Figur 7: Genekspression duing embryogenese in vitro under anvendelse af kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR), Gene ekspression af OLEOSIN3 (A) og OLEOSIN4 (B) i begyndelsen af kimblad embryoer udskåret fra embryoner fra embryogen kallus.. Ekspression er relativ to blad. Standardafvigelser er angivet.
| Stage nummer | Fosterstadiet | Pod etape |
| Stage 1 | Blomst på anthesis | |
| Trin 2 | Meget tidligt præ-kugleformede embryo | Pod med en eller to spiraler |
| Trin 3 | Tidlige præ-globulære embryo | Pod med tre komplette spiraler |
| Trin 4 | Tidlig kugleformet | Pod med fem komplette spiraler og pigge ikke synlig |
| Trin 5 | Late kugleformet | Pod med seks spiraler og umodne pigge ikke overstiger pod bredde |
| Stage 6 | Hjerte etape | Pod med seks spiraler og langstrakte udløb pigge over pod bredde |
| Stage 7 | Torpedoetape | Pod med seks spiraler, modne tykkere længere pigge og øget omkreds |
Tabel 1: Kriterier for høst af pod etaper Morfologiske kriterier identificere pod etaper svarende til definerede embryo etaper..
| Flower Stage 1 (S1) | Pod Stage 2 (S2) | Pod Stage 3 (S3) | Pod Fase 4 (S4) | Pod Etape 5 (S5) | Pod Stage 6 (S6) | Pod Stage 7 (S7) | |
| Dage | 0 | 1,5-2 | 0,5-1 | 0,5 | 0,5-1 | 1 | 1-1,5 |
Tabel 2. Tidsforløb for pod kollektion. Tiden fra than tidligere udvikling fosterstadiet angivet i dage.
| Større salte / L | Bisalte / L | Vitaminer / l | |||
| mg | mg | mg | |||
| Kno 3 | 1875 | MnSO4 • H2O | 10 | Myo-inositol | 100 |
| NH 4 NO 3 | 600 | H 3 BO 3 | 3 | Thiamin HCI | 10 |
| KH 2 PO 4 | 131 | ZnSO4 • 7H 2 O | 2 | Nicotinsyre | 1 |
| KCL | 225 | <td> KI0,75 | Pyridoxin HCl | 1 | |
| MgSO4 • 7H 2 O | 225 | Na 2 MoO 4 • 2H 2 O | 0.25 | ||
| Calcium separat | CuSO4 • 5H 2 O | 0,025 | |||
| CaCl2 • 2H 2 O | 300 | CoCl2 • 6H 2 O | 0,025 | ||
| Chelateret jern separat | |||||
| FeSO4 • 7H 2 O | 9,267 | ||||
| Na2EDTA • 2H 2 O | 37.2 | ||||
Tabel 3: P4 Medium Komponenterne i P4 medium..
| Komponent | Beløb / l |
| 10 x større salte | 100 ml |
| 100 x calcium | 10 ml |
| 1.000 x bisalte | 1 ml |
| 200 x jern | 5 ml |
| 100 x casaminosyrer | 10 ml |
| 1.000 x vitaminer | 1 ml |
| Saccharose | 30 g |
| Agar | 8 g |
| Hormoner | |
| 1.000 uM NAA | 10 ml |
| 1.000 pM BAP | 4 ml |
| 1.000 uM ABA | 1 ml | </ Tr>
| 1.000 uM GA | 5 ml |
Tabel 4: Konfektion P4 medium med hormoner Konfektion P4 medium med hormoner fra stamopløsninger..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De beskrevne protokoller er relativt ligetil og tillade undersøgelse af bælgplante embryogenese med alle moderne celle og molekylære teknikker. Vi anerkender, at der er fordele og ulemper ved både in vivo og in vitro metoder. Begge tillade mere fokus på tidlig embryogenese i forhold til kultur af umodne frø 19.
I tilfælde af in vivo-undersøgelser, der er beskrevet overvejende isoleringen af ovule fra bælgen som er egnet til mange embryo studier. Det er naturligvis muligt yderligere berige for embryo væv ved skæring off "krog" område (figur 3B). Det er vanskeligt at isolere meget tidligste udviklingsstadium embryo som under disection embryonet går ofte tabt, da det ikke er godt fastgjort til det tilstødende væv, som gør brugen af frøanlæg fordelagtige. Brug af pod morfologi eliminerer tagging af blomster og med en tid course ordning for hver blomst. Derudover er der potentiale variabilitet i udviklingsmæssige timing metoder, medmindre miljøet meget tæt kontrolleret. Optimal plantevækst er vigtigt, så pod dannelse ikke forekommer under stressbetingelser. Bliv fortrolig med pod udvikling og kan gøres mindre justeringer for at definere morfologiske stadier til at matche specifikke udviklingsstadier embryo.
I tilfælde af somatisk embryogenese, må det erkendes, at embryonerne stammer ukønnet og ikke fra en zygote. Også den ernæringsmæssige kilde er anderledes end den zygotisk embryo. I tilfælde af den somatiske embryo, er dyrkningsmediet og omgivende callus, og i tilfælde af zygotisk embryo er endospermen. Det betyder, at Suspensor er langt bedre udviklet i forbindelse med den zygotisk embryo (figur 4A, B). Den særlige værdi af M. truncatula system er det store antal embryoer som reaktion på den usædvanlige fire hormone regime. Hvis det store antal ikke forekommer derefter kontrollere detaljerne, som udgør de hormoner og deres tilsætning til mediet skal kontrolleres. Som med enhver kultur metodik sterilitet eksplantatvævet uden skader (foretage små justeringer af timingen af ethanol og hypochlorit sterilisering gange, hvis dette er et problem) er vigtigt sammen med omhu i at bevare sterilitet i alle forberedende trin.
Hvad vi har fundet er, at det er værdifuldt at supplere in vivo og in vitro processer. Et eksempel fra vores egne undersøgelser er undersøgelsen af transkriptionsfaktoren MtSERF1 (SOMATISK EMBRYONER relateret faktor 1), som er en ethylen respons transkriptionsfaktor genet. MtSERF1 blev først opdaget i somatiske embryoer ved hjælp RNAi, promotor-GUS-fusioner og in situ hybridiseringer; og vist derefter at blive udtrykt i zygotisk embryogenese 20.
Studiet af bælgplante embryogenese er vigtig for human ernæring, og bruge M. truncatula embryoner sammen med de cellulære og molekylære teknologier nu tilgængelig kan forbedre dette område. Indsigt kan opnås i, hvordan embryo størrelse og dermed udbyttet kan optimeres sammen med den nødvendige kulhydrat, olie og proteinsammensætning. Disse determinanter er stort set sat i tog i begyndelsen af embryogenese 8,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P4 medium | Sigma-Aldrich | Use Sigma-Aldrich Chemicals or other analytical grade supplier | |
| Major salts | |||
| Minor salts | |||
| Vitamins | |||
| Agar | Bacto Laboratories | 214010 | Bacto agar |
| Plant hormones | |||
| 1-Naphthaleneacetic acid | Sigma-Aldrich | N0640 | Dissolve in small amount of 1 M NaOH |
| Abscisic acid | Sigma-Aldrich | A1049 | Dissolve in small amount of 1 M NaOH |
| 6-Benzylaminopurine | Sigma-Aldrich | B3274 | Dissolve in MQ water with heating and few drops 1N HCl |
| Gibberellic Acid | Sigma-Aldrich | G7645 | Dissolve in small amount of ethanol |
| Equipment | |||
| Stereo dissecting microscope | Leica | MZFLIII | Or similar |
| Light microscope | Zeiss | Axiophot | Or similar, with suitable optics |
| Digital camera | Zeiss | AxioCam HRc | Or similar |
| Sterilising leaves | |||
| 250 mL screw cap polycarbonate container with polypropylene lid | SARSTEDT | 75.9922.519 | Autoclavable |
References
- Gepts, P., et al. Legumes as a model plant family. Genomics for food and feed report of the cross-legume advances through genomics conference. Plant Physiol. 137 (4), 1228-1235 (2005).
- Graham, P. H., Vance, C. P. Legumes: importance and constraints to greater use. Plant Physiol. 131 (3), 872-877 (2003).
- Young, N. D., Udvardi, M. Translating Medicago truncatula genomics to crop legumes. Curr. Opin. Plant Biol. 12 (2), 193-201 (2009).
- Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insights into the evolution of rhizobial symbioses. Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).
- Gallardo, K., Le Signor, C., Vandekerckhove, J., Thompson, R. D., Burstin, J. Proteomics of Medicago truncatula seed development establishes the time frame of diverse metabolic processes related to reserve accumulation. Plant Physiol. 133 (2), 664-682 (2003).
- Verdier, J., et al. Gene expression profiling of M. truncatula transcription factors identifies putative regulators of grain legume seed filling. Plant Mol. Biol. 67 (6), 567-580 (2008).
- Thompson, R., Burstin, J., Gallardo, K. Post-genomic studies of developmental processes in legume seeds. Plant Physiol. 151 (3), 1023-1029 (2009).
- Wang, X. -D., Song, Y., Sheahan, M. B., Garg, M. L., Rose, R. J. From embryo sac to oil and protein bodies: embryo development in the model legume Medicago truncatula. New Phytol. 193 (2), 327-338 (2012).
- Kurdyukov, S., Song, Y., Sheahan, M. B., Rose, R. J. Transcriptional regulation of early embryo development in the model legume Medicago truncatula. Plant Cell Rep. 33 (2), 349-362 (2014).
- Mansfield, S. G., Briarty, L. G. Early embryogenesis in Arabidopsis thaliana. 2. The developing embryo. Can. J. Botany. 69 (3), 461-476 (1991).
- Seefried, W. F., Willman, M. R., Clausen, R. L., Jenik, P. D. Global regulation of embryonic patterning in Arabidopsis by microRNAs. Plant Physiol. 165 (2), 670-687 (2014).
- Birnbaum, K. D., Sánchez Alvarado, A. Slicing across kingdoms: regeneration in plants and animals. Cell. 132 (4), 697-710 (2008).
- Rose, R. J., Nolan, K. E., Bicego, L. The development of the highly regenerable seed line Jemalong 2HA for transformation of Medicagotruncatula - implications for regenerability via somatic embryogenesis. J. Plant Physiol. 155 (6), 788-791 (1999).
- Nolan, K. E., Song, Y., Liao, S., Saeed, N., Zhang, X., Rose, R. J. An unusual ABA and GA synergism increases somatic embryogenesis, facilitates its genetic analysis and improves transformation in Medicago truncatula. PloS ONE. 9 (6), e99908 (2014).
- Liu, C. M., Meinke, D. W. The titan mutants of Arabidopsis are disrupted in mitosis and cell cycle control during seed development. Plant J. 16 (1), 21-31 (1998).
- Nolan, K. E., Kurdyukov, S., Rose, R. J. Expression of the SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE 1 (SERK1) gene is associated with developmental change in the life cycle of the model legume Medicago truncatula. J. Exp. Bot. 60 (6), 1759-1771 (2009).
- Iantcheva, A., Vlahova, M., Atanassov, A., et al. Somatic embryogenesis from leaf explants. The Medicago truncatula handbook. Mathesius, U. , Available from: http://www.noble.org/MedicagoHandbook (2006).
- Thomas, M. R., Johnson, L. B., White, F. F. Selection of interspecific somatic hybrids of Medicago by using Agrobacterium transformed tissues. Plant Sci. 69 (2), 189-198 (1990).
- Ochatt, S. J. Immature seeds and embryos of Medicago truncatula cultured in vitro. Plant Embryo Culture: Methodsand Protocols, Methods in Molecular Biology. Thorpe, T. A., Yeung, E. C. 710, Springer protocols, Humana press. 39-52 (2011).
- Mantiri, F. R., Kurdyukov, S., Lohar, D. P., Sharopova, N., Saeed, N. A., Wang, X. D., VandenBosch, K. A., Rose, R. J. The transcription factor MtSERF1 of the ERF subfamily identified by transcriptional profiling is required for somatic embryogenesis induced by auxin plus cytokinin in Medicago truncatula. Plant Physiol. 146 (4), 1622-1636 (2008).
