Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

مثقب تسجيل التصحيح، المشبك من الماوس العصبونات الحسية الشمية في الظهارة العصبية السليمة: التحليل الوظيفي من الخلايا العصبية التي تم تحديدها إبداء الرائحة مستقبلات

Published: July 13, 2015 doi: 10.3791/52652
Automatic Translation
1, 1
1UMR Centre des Sciences du Goŭt et de l'Alimentation, CNRS, INRA, Université de Bourgogne

Abstract

تحليل الاستجابات الفسيولوجية للخلايا العصبية الحسية الشمية (OSN) عندما حفز مع بروابط معينة أمر بالغ الأهمية لفهم أساس السلوكيات مدفوعة حاسة الشم والتشكيل الخاصة بهم. هذه الخصائص الترميز تعتمد بشكل كبير على التفاعل الأولي بين جزيئات الرائحة ومستقبلات الشم (OR) أعربت في OSNs. هوية وخصوصية ويجند الطيف من التعبير عن أو حاسمة. أعرب احتمال العثور على يجند من OR في OSN اختيارها عشوائيا داخل الظهارة منخفضة جدا. لمواجهة هذا التحدي، هذا البروتوكول يستخدم وراثيا الفئران الموسومة معربا عن GFP بروتين فلوري تحت سيطرة المروج من نسب الأرجحية محددة. وتقع OSNs في ظهارة ضيقة وتنظيم المبطنة للتجويف الأنف، مع الخلايا المجاورة تؤثر النضج وظيفة. نحن هنا تصف طريقة لعزل والظهارة الشمية سليمة وتسجيل من خلال تسجيلات التصحيح المشبك خصائص OSNs هxpressing مستقبلات الرائحة محددة. بروتوكول يسمح احد لتوصيف خصائص الغشاء OSN مع الحفاظ على تأثير الأنسجة المجاورة. تحليل نتائج التصحيح، المشبك غلة الكمي الدقيق ليجند / أو التفاعلات، ومسارات نقل والصيدلة، والترميز خصائص OSNs 'والتشكيل على مستوى الغشاء.

Introduction

الخلايا العصبية الحسية الشمية (OSN) تمثل الخطوة الأولى للإدراك حاسة الشم. تقع في الظهارة الشمية بطانة التجويف الأنفي لدى القوارض، وتحويل المعلومات الكيميائية للعطر في إمكانات العمل التي يتم إرسالها عبر محور عصبي على الدماغ. لفهم أفضل للآليات الترميز حاسة الشم، فمن الضروري أن تميز تنبيغ وغشاء خصائص OSNs. حتى وقت قريب، نفذت معظم التقنيات المستخدمة لوصف خصائص OSNs الثدييات خارجا على فصل OSNs 1-4. تستخدم عملية التفكك المختلفة (أي الإنزيمات) العمليات الميكانيكية والكيميائية لتحرير OSNs من بيئتهم. هذه العمليات لحث على عدد منخفض من خلايا متاحة للتسجيلات. هذا العدد المنخفض يمكن أن يكون أكثر أهمية في حالة الخلايا GFP المسمى. التفكك أيضا إلى إزالة الخلية الى خلية التفاعلات المحلية بين OSNs وخلايا أخرى من الظهارة الشمية التي قد تعزز survivالقاعدة وتعديل خصائص OSNs. من أجل تجاوز الإجراء التفكك، تم وضع إعداد سليمة 5.

كل OSN يعبر عن مستقبلات الشم واحدة (OR) مختارة من عائلة متعددة الجينات كبيرة 6. هناك ~ 1000 نسب الأرجحية التي أعرب عنها في الظهارة الشمية الرئيسية في الماوس. نظرا لوجود عدد كبير من الحيوانات أو في نوع البرية، وفرص لتسجيل OSNs التعبير عن نفسه أو منخفضة جدا. للتغلب على هذه القيود، هي الجينات المستهدفة الفئران المتاحة فيها جميع OSNs التعبير عن الهوية أو وصفت مع البروتين الفلوري 7-9. واستخدمت هذه OSNs المسمى للقيام تحليل وظيفي في الأعمال التحضيرية فصلها 7،10،11 مع العيوب المذكورة في وقت سابق. لذا لإعداد ظهارة سليمة 5 من الفئران وصفت وراثيا تلتف هذه القضايا. لأنها تتيح رصد نشاط OSNs معربا عن نسب الأرجحية محددة بدقة في بيئة أقرب إلى في السادسفو وقت ممكن. الى جانب ذلك، تسجيلات التصحيح المشبك من OSNs تسمح أيضا تحليل دقيق لخصائص الغشاء، تنبيغ مسار الصيدلة، يجند / أو التفاعلات. بالكاد يمكن تحليل كل هذه المواضيع باستخدام التسجيلات خارج الخلية. استخدمنا هذه التقنية لرصد ردود OSNs التعبير عن مستقبلات الرائحة SR1 وMOR23 12،13. تم تأكيد جدوى هذه التقنية من قبل مجموعات أخرى على MOR23 معربا عن OSNs 14 فضلا عن نسب الأرجحية الأخرى معربا عن الخلايا العصبية 15،16. رصد مجموعة محددة من OSNs يمكن أن يؤدي إلى تحليل خصائصها في العديد من السياقات المختلفة مثل التنمية 14، والشيخوخة 17، الرائحة التي يسببها اللدونة 18، ودور الاختلافات في تسلسل مستقبلات الرائحة في رائحة الترميز 15. وبالتالي يتيح هذا البروتوكول أداة قوية لرصد الخصائص الفنية للOSNs المعرفة على مستوى الغشاء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

هذا البروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان من جامعة دي بورغون وتمت الموافقة من قبل لجنة الأخلاق جامعة دي بورغون.

1. الحيوانات

  1. استخدام الفئران المعدلة وراثيا OR-IRES-tauGFP المتاحة في مختبر جاكسون. وقد وضعت هذه الفئران في المختبر الدكتور بيتر Mombaerts "من أجل تحليل استهداف أكسون وتطوير النظام الشمي 19. على سبيل المثال، خط MOR23-IRES-tauGFP، والأوراق المالية رقم 006643، يحمل اسم سلالة B6 الرسمي؛ 129P2- Olfr16 tm2Mom / MomJ. وبالمثل، فإن خط SR1-IRES-tauGFP، والأوراق المالية رقم 6717 يحمل اسم B6 الرسمي؛ 129P2- Olfr124 tm1Mom / MomJ.
  2. وفيما يتعلق عمر الحيوانات: من أجل نتائج أفضل من البروتوكول، واستخدام الحيوانات بين 2 و 4 أسابيع من العمر. في هذه الفئة العمرية، وتشريح هو أسهل (العظام أكثر ليونة، أكثر حزما الظهارة الشمية) والمقابض شجيري هي ثنائيةgger مقارنة الحيوانات الأكبر سنا.

2. إعداد أقطاب وحلول

  1. لماصات محفزة: شراء prepulled تحفيز ماصات. خلاف ذلك، وإعداد عليها يدويا.
    1. باستخدام اللهب، ثني ستة الماصات الزجاج 1 مم في حوالي 1 سم من الحافة. إدراج هذه الماصات ستة زائد على التوالي ال 7 في 1.5 سم الحرارة يتقلص أنابيب تعزيز من قبل العيينة.
    2. الحرارة يتقلص أنابيب للحفاظ على برميل المرفقة معا. إرفاق إضافي أنابيب الحرارة يتقلص إلى أقصى الطرف الآخر من برميل. سحب هذا ماصة تحفيز مع مجتذب متعددة برميل.
    3. إضافة بعض الغراء السائل الأبيض حول العيينة لتعزيز نصائح محني. اسمحوا الجافة O / N.
  2. إعداد 1 أو 2 لتر من محلول طبيعي رينغر خارج الخلية (في ملي: كلوريد الصوديوم 124، بوكل 3، 4 MgSO 1.3، CaCl 2 2، 3 NaHCO 26، ناه 2 PO 4 1.25، الجلوكوز 15؛ درجة الحموضة 7.6 و 305 الميلي أسمول). الحفاظ على 4 ° Cحتى الاستخدام.
  3. إعداد محلول المخزون داخل الخلايا (مم): بوكل 70، KOH 53، حمض methanesulfonic 30، EGTA 5، HEPES 10، السكروز 70؛ الرقم الهيدروجيني 7.2 (KOH) و 310 الميلي أسمول. الحفاظ على 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. جيدة لعدة أسابيع.
  4. يعد حل داخل الخلايا تسجيل مع النيستاتين بشكل إرتجالي (في آخر لحظة) قبل التجربة.
    1. تزن 3 ملغ من النيستاتين، إضافة 50 ميكرولتر من DMSO. دوامة 20 ثانية ثم يصوتن 2-3 دقائق حتى المخفف بالكامل.
    2. إضافة 20 ميكرولتر من حل DMSO نيستاتين في 5 مل من محلول المخزون داخل الخلايا. دوامة و 20 ثانية، ثم يصوتن 3 دقائق. الحفاظ على هذا الحل في 4 درجات مئوية، وحماية من الضوء المباشر، نيستاتين غير حساسة للضوء. هذا الحل يمكن استخدامها لبضع ساعات. استبدال كل يوم.
    3. مرة واحدة إعداد الظهارة الشمية تحت المجهر، واتخاذ بعض من هذا الحل في حقنة 1 مل مع طرف الأصفر ممدود اللهب لملء الأقطاب. بعيدا عن الضوء المباشر. مرة واحدة على RT، والحل نيستاتينغير مستقر. استبدال الحل في حقنة 1 مل كل ساعة أو الاحتفاظ بها في الجليد.
  5. سحب أقطاب تسجيل مع ساحبة للحصول على رقبة طويلة ورأس صغير (~ 2 ميكرون) مع المقاومة من 15-20 MΩ مع الحل نيستاتين الداخلي.
  6. يعد حل الرائحة عند 0.5 M في DMSO تحت غطاء الدخان. قسامة والحفاظ على درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. تخفيف الرائحة في حل قارع الأجراس حتى التركيز المطلوب. ملء ماصة محفزة.

3. إعداد الظهارة الشمية

ملاحظة: الفئران OR-IRES-tauGFP تعبر عن tauGFP تحت سيطرة أو المروج. في هذه الفئران، وصفت جميع الخلايا العصبية معربا عن OR في المصالح مع GFP. ويتم تكييف هذا البروتوكول لنسب الأرجحية التي أعرب عنها في جميع المناطق. ومع ذلك، تشريح والتسجيلات هي أسهل للنسب الأرجحية أعرب في المنطقة الظهرية.

  1. تخدير الحيوان عن طريق حقن مزيج من الكيتامين وزيلازين (150 ملغ / كغ و 10 ملغم / كغم بودالوزن ذ، على التوالي). قطع الرأس يمكن القيام بها مع مقص حاد للفئران شابة أو مع المقصلة القوارض وتصان بشكل مناسب لالفئران الأكبر سنا.
    1. باستخدام مقص حلقة تشريح جعل شق وسطي طولية من خلال الجلد الظهرية. إزالة الجلد عن طريق سحب إربا. باستخدام مقص، وقطع أقل الفكين في مفصل الفك. إزالة الأسنان الأمامية العلوية التي كتبها خفض مواز الاكليلية للأسنان.
    2. اجراء خفض الاكليلية من الرأس خلف العينين وتبقي فقط على الجزء الأمامي من الرأس. تراجع في حل قارع الأجراس المثلج للتشريح ضمن نطاق.
  2. تشريح تحت النطاق: في الجانب البطني، وجعل قطع طولية على طول الفك العلوي / الأسنان. قطع العظام الظهرية طوليا، في أعقاب الجانب ظهراني الجانبي للتجويف الأنف. إزالة معظم العظام والحنك. نقل الحاجز وظهارة المرتبطة به في الاوكسيجين قارع الأجراس في RT.
  3. لتشريح النهائي: الحق قبل البدء في تسجيلالدورة، قشر بعيدا ظهارة من الحاجز الأساسي بالملقط. فصل ظهارة مع ملقط ومع اثنين من 4-5 ملم تخفيضات مقص (microvannas استخدام مقص) في الجزء الأمامي من الحاجز حيث التصاق أقوى.
    1. إزالة بعناية الجهاز الميكعي بقطع عليه على طول اتصال ظهري لظهارة الحاجز. نقل الظهارة إلى غرفة تسجيل مع طبقة المخاط مواجهة. يبقيه شقة في غرفة مع القيثارة.
  4. تثبيت غرفة تحت المجهر تستقيم مجهزة البصريات مضان وكاميرا حساسة. تصور إعداد على شاشة الكمبيوتر في تضخم عالية من خلال 40X الهدف الغمر بالمياه (الفتحة العددية 0.8) و2X أو 4X التكبير اضافية من خلال عدسة مكبرة تحقيقه. يروي باستمرار مع الاوكسيجين قارع الأجراس في RT (1-2 مل / دقيقة).

4. تسجيل الدورة

  1. بحث عن الخلية الفلورسنت: تثير إعداد 480نانومتر لEGFP، التي تنبعث الضوء في نطاق 530-550 نانومتر. هدف واحد مقبض شجيري وهو أمر واضح بشكل صحيح في مضان وتحت حقل مشرق.
  2. ملء القطب مع الحل الخلايا مع النيستاتين. إزالة الفقاعات من خلال استغلال بلطف على القطب.
  3. إدراج القطب على حامل الكهربائي، وتطبيق الضغط الايجابي في ماصة. يجب أن تكون المقاومة 15-20 MΩ.
  4. جلب الكهربائي بالقرب من الخلية؛ عند بلوغ المقاومة ~ 40 MΩ، والإفراج عن الضغط الإيجابي والضغط السلبي طفيف للوصول إلى gigaseal.
  5. حالما يتم التوصل إلى ختم، تعيين غشاء المحتملة بنحو -75 بالسيارات.
  6. مرة واحدة يتم فتح الخلية، والمضي قدما مع بروتوكولات التحفيز، والعلاجات الدوائية. لقياس استجابة لتحفيز الرائحة واحد، سجل 200-500 ميللي ثانية من النشاط العفوي، وتحفيز لمدة 500 ميللي ثانية وقياس استجابة الخلايا لمدة تصل إلى 10 ثانية (13). لعلاجات الدوائية، يروي كلاء الدوائية فيالتركيز المطلوب 20.

5. تحليل البيانات

  1. تحليل التيارات التي تسببها التحفيز الرائحة على النحو التالي: الحد الأقصى للسعة، لمرة وارتفاع (الوقت اللازم لتصل إلى 90٪ من الحد الأقصى للسعة، في مللي ثانية)، ومجموع (منطقة تحت منحنى في PAS) الحالية، والوقت بنسبة 50٪ (الوقت بين بداية وإزاحة استجابة بنسبة 50٪ من الحد الأقصى للسعة، في مللي ثانية).
    1. باستخدام التيارات ذروة تنبيغ (بلغت أقصى اتساع) بتركيزات مختلفة، ورسم وتناسب منحنى الاستجابة للجرعة باستخدام المعادلة هيل: I = ايماكس / (1 ​​+ (K 02/01 / C) ن)، حيث كنت يمثل الذروة الحالية ، IMAX أكبر عدد من الردود في تركيزات تشبع، K1 / 2 تركيز الذي تم التوصل نصف الحد الأقصى للاستجابة، C تركيز الرائحة ون معامل هيل.
  2. تحليل تسجيلات لغشاء المحتملة في المشبك الحالي لتحقيق أقصى قدر من الاستقطاب، وTOTAل إمكانات أثارت (منطقة تحت منحنى في mVsec)؛ سجل النشاط العفوي ارتفاعه أكثر من 30 ثانية إلى 1 التسجيلات دقيقة. استثارة سجل عن طريق المسامير التي تسببها الحقن التيارات (5-10 باسكال).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

نتائج هذا البروتوكول يعتمد على نوعية تشريح. يجب أن يكون هذا الخطوات تشريح قصيرة (أقل من 10 إلى 15 دقيقة) ودقيق (أي، لتجنب أضرار من ظهارة). يوضح الشكل 1 كيف يمكن إعداد مثالية يشبه في مستويات التكبير المختلفة. في تضخم منخفض تحت حقل مشرق أنواع مختلفة من الخلايا (مثل المقابض من OSNs، ودعم الخلايا) يمكن تمييزها (الشكل 1A). على أعلى مستوى التكبير، وعادة 80X إلى 160X، في حقل مشرق، المقابض شجيري من OSNs ينبغي أن يكون التمييز بوضوح بين الخلايا الداعمة (الشكل 1B). تحت ضوء الفلورسنت، إلا أن المقابض شجيري وأهداب الخلايا GFP المسمى مرئية (الشكل 1C). من خلال مقارنة الصور 2، والخلايا المسمى يمكن تناولها مع تسجيل ماصة (الشكل 1D).

درجة حرارة تشريح ذلكlution وتوقيت تشريح حاسمة. الجزء الأول من التشريح، ويجب إعداد الحاجز (القسم 3.1.1 إلى 3.2) ستجري في غضون 5 إلى 10 دقيقة في محلول الجليد الباردة. تشريح النهائي (3.3) يجب أن تستمر أقل من 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. في حال استمر تشريح لفترة طويلة جدا، أو أجريت في حل تشريح حارة جدا، وإعداد دائما يبدو تلف بسرعة: المقابض شجيري تطفو فوق سطح البشرة، وتشبه الخلايا الميتة.

حالما يتم التوصل إلى ختم ويفتح الخلية تحت تأثير نيستاتين، والجهد بوابات التيارات نموذجية يمكن ملاحظة (الشكل 2A). شكل وخصائص هذه التيارات يمكن استخدامها لرصد صحة الخلية: في زنزانة الموت أو إذا كانت جودة ختم آخذ في التناقص، وسعة هذه التيارات نقصان. تحت التكوين المشبك الحالي، إمكانات العمل يمكن تسجيلها إما تلقائيا (الشكل 2B) أو عن طريق الحقن من depolarizing الحالية (الشكل 2C). خصائص اطلاق الناجم عن حقن الحالي تميز استثارة الخلايا العصبية المسجلة. ويمكن مقارنة استثارة السكان OSNs مختلفة "(باستخدام تردد الكلاسيكية وحسابات ISI).

ماصة multibarrel محملة عطور مختلفة و / أو تركيزات مختلفة من عطر يمكن أن تستخدم لتحفيز الخلايا عن طريق الضغط قذف. وهذا يسمح لقياس الرائحة الناجمة عن الردود. يجب اختيار عطر وتركيزات اعتمادا على أعربت OR في خلية من الاهتمام، على سبيل المثال Lyral هو يجند لMOR23، acetophenone لM71، الأوجينول لmOREG. في التجربة هو موضح في الشكل 3، ردت سجلت الخلايا العصبية MOR23-IRES-tauEGFP لتركيزات مختلفة من Lyral، ليجند لMOR23، في ظل الوضع الحالي المشبك (الشكل 3A) أو في ظل وضع المشبك الجهد (الشكل لدى عودتهم 3B). في الجهد التسجيلات وضع المشبك، يمكن رصد الخصائص المختلفة لقياس استجابة (السعة القصوى، وارتفاع الوقت، المجموع الحالي أثارت، الخ.) كما يقوم كلاسيكيا في الكهربية. استخدام السعة القصوى للاستجابة الناجم عن الرائحة، الاستجابة للجرعة يمكن رسم وتركيبها باستخدام المعادلة هيل. وتوفر هذه النتائج معلومات حول الخصائص ترميز كل OSN: عتبة الكشف، ودينامية الزمنية، مجموعة ديناميكية ومستوى التشبع. وترد أمثلة على منحنيات الاستجابة للجرعة على الشكل 3C. ويمكن مقارنة كل هذه التفاصيل بين OSNs الفردية لقياس التباين المحتملة بين السكان. يمكن أيضا أن تكون مقارنة بين OSNs مع أو بدون تطبيق العلاج لقياس التشكيل المحتمل واللدونة.

الشكل 1

ف together.within صفحة = "دائما"> الرقم 1B
الشكل 1: صور الممثل مستحضر صحي (A) الظهارة الشمية السليمة المستخرجة من تجويف الأنف من الفئران المحورة جينيا SR1-IRES-tauGFP وحظ تحت ظروف الحقل مشرق في التكبير 40X. أرفقت OSN المقابض شجيري (رؤساء السهم الأسود) في شبكة من الخلايا الداعمة (SC) والغدد بومان (BG). (B) المقابض شجيري SR1 معربا عن OSNs وحظ تحت ظروف الحقل مشرق (رؤساء السهم الأبيض والأحمر). (C) نفس المجال كما هو الحال في (B) تحت ضوء الفلورسنت تظهر المقابض شجيري من SR1 OSNs معربا. (D) تسجيل ماصة تقترب من OSN، معربا عن SR1 تحت حقل مشرق. يمثل السهم الأحمر نفس SR1 OSN في (B - D). شريط النطاق: 5 ميكرون.

"دائما"> الرقم 2
الشكل 2: نتائج خصائص الغشاء التمثيلية التي تم الحصول عليها مع بروتوكول: التسجيلات التصحيح، المشبك على مقبض شجيري من SR1-IRES-tauGFP OSN (A) الجهد بوابات التيارات التي تسببها زيادة الخطوات depolarizing من الغشاء المحتملة -67 بالسيارات إلى +40 بالسيارات. (B) النشاط العفوي سجلت في تكوين المشبك الحالي. ويمكن ملاحظة إمكانات العمل خلال 15 ثانية تسجيل الحقبة. (C) إمكانات العمل التي تسببها ل+7 السلطة الفلسطينية مثير الحالية. يوفر هذا البروتوكول المعلومات حول استثارة الخلية.

الشكل 3A

الشكل 3B

together.within صفحة = "دائما"> الرقم 3C
الرقم 3: أمثلة التمثيلية للردود الرائحة الناجمة في الخلايا العصبية MOR23-IRES-tauEGFP زيادة تركيزات Lyral، ليجند للمستقبلات MOR23، تحفز زيادة استجابات سواء في المشبك الحالي (A) والمشبك الجهد (B). وقد فرضت غشاء المحتملة في -67 بالسيارات. (C) أمثلة فردية منحنيات الاستجابة للجرعة حصلت على ثلاثة الخلايا العصبية M71 ردا على زيادة تركيزات acetophenone ومزودة المعادلة هيل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

قدرة هذا البروتوكول لرصد خصائص OSNs صحية بشكل صحيح تعتمد بشكل كبير على جودة إعداد. ولذلك، فإن الخطوات تشريح حاسمة. أولا من المهم جدا أن تولي اهتماما لنوعية (الرقم الهيدروجيني، الأسمولية)، الأوكسجين ودرجة الحرارة (المثلج ولكن ليس المجمدة) من المتوسط ​​تشريح. ثانيا، التلاعب في ظهارة مع أدوات تشريح يجب محدودة بقدر الإمكان لتجنب الأضرار. وأخيرا، من المهم جدا للحصول على إعداد شقة ممكن من أجل الوصول إلى أكبر عدد من السكان OSN وقت ممكن.

جودة تشريح أساسية للحصول على إعداد صحي. ومع ذلك، نهج مختلفة يمكن استخدامها للتشريح: هنا نقدم بطني إلى الظهرية تشريح ولكن يمكن لبعض المستخدمين يفضلون بدء ظهريا تشريح لفتح تجويف الأنف بسرعة ويكون الوصول السريع إلى عطلة الحاجز من الظهارة الشمية. يمكن لكل مستخدم وبالتالي التكيف مع العلاقات العامةotocol لاستراتيجية أكثر كفاءة للوصول إلى إعداد صحي للمنطقة من الفائدة.

مرة واحدة إعداد تحت المجهر، مطلوب الرصد الدائم للصحة إعداد و. في الواقع، وإعداد غير صحي يؤدي إلى احتمال ضعيف للوصول إلى gigaseal. وانخفاض الكفاءة في الحصول على gigaseals يمكن تحسينها عن طريق تغيير مجال الفائدة على إعداد من أجل إيجاد OSNs صحة. حل أكثر جذرية هو استبدال إعداد بالكامل من قبل واحدة جديدة. مرة واحدة يتم الوصول إلى ختم، وهو احتمال ضعيف للوصول يمكن للدولة أن "فتح" تأخذ مكان. قد يكون هذا يرجع إلى نوعية الحل الداخلي لل. يجب أن يكون مستعدا للحل داخلي قبل وقت قصير من التجربة. استخدام دوامة وصوتنة حاسمة منذ ذوبان نيستاتين منخفضة إلى حد ما. لتحسين احتمال فتح، والحل الداخلي ينبغي vortexed مرة أخرى لمدة 10 ثانية ثم sonicated لمدة 30 إلى 60 ثانية. هذا أوسوحليف يحسن كفاءة افتتاح الخلية.

لتحفيز OSN سجلت مع عطر، وبروتوكول المعروضة يستخدم تحفيز ماصة 7 برميل. هذا النوع من ماصة يعني وجود قيود في عدد من عطر و / أو تركيز عطور اختبارها على كل الخلايا المسجلة إلى سبعة. هذا القيد هو نسبيا ليس كبيرا في حالة وجود منحنى الاستجابة للجرعة لأنه يمكن أن تغطي ما يصل إلى 7 وحدات سجل التركيز. ومع ذلك، في حالة من التجارب الفرز، حيث يتم اختبار عطور مختلفة، ماصة سبعة برميل قد تظهر القيود. في فحص التجارب، والهدف هو العثور على يجند لOSNs المسمى معربا عن يتيم OR. وباستخدام هذا البروتوكول تتطلب استخدام خليط من الرائحة. سيتم بعد ذلك تقسيم كل خليط حصول على استجابة إلى عطر الفردية. وقد تم ذلك لفحص عطور الأمينات على TAAR معربا عن OSNs 16. في هذه التجارب، أعربت الخلايا العصبية الفلورسنت TAARs وكان يجند UNKnown. باستخدام بروتوكول، يمكن أن الكتاب الشاشة عدة عشرات من عطر الأمينات في مخاليط. مخاليط حصول على استجابة ثم تم تقسيمها إلى عطر واحدة من أجل العثور على يجند أكثر كفاءة.

وينبغي اختيار المسافة بين الموقع تسجيل وماصة تحفيز بحكمة من أجل تقليل التحفيز الميكانيكي للخلية 20. إذا كان الضغط مرتفع جدا (فوق 30 رطل في ظروف التسجيل لدينا) و / أو مسافة صغيرة جدا (أقل من 20 ميكرون)، واستجابة ميكانيكية في بعض OSNs يمكن حتى تحجب استجابة الرائحة. الضغط والمسافة بين ماصة النفخ وموقع تسجيل حاسمة للسيطرة على صرف حل خلال التحفيز أيضا. تركيز الوصول إلى الخلايا العصبية وتقييمها من قبل لتكون قريبة قدر الإمكان حتى الوقت الحاضر التركيز في ماصة من خلال سلسلة من الاختبارات 13. تستخدم هذه الاختبارات حل الملونة مع صبغة زرقاء لقياس بداية وتعويض رانه التحفيز. باستخدام 20 رطل ضغط و 30 ميكرون بعد، تم التوصل إلى كثافة القصوى للتحفيز على مسافة 300 مللي ثانية. الإزاحة من التحفيز وأيضا تقييمها بعناية: منذ إعداد تحت التدفق المستمر للحل perfused ل، وجرفت التحفيز في غضون 0،8-0،9 ثانية (13).

رائحة الترميز خصائص OSNs تم قياس تاريخيا إما من خلال التسجيلات خارج الخلية في الجسم الحي أو من خلال التجارب على الخلايا المعزولة. في الثدييات، وأجريت التسجيلات خارج الخلية في البداية في الجسم الحي في الفئران 21. في التسجيلات خارج الخلية، أعرب OR في الخلية تسجيل غير معروف مما يحد من نسبة النجاح للعثور على خلية الاستجابة إلى الرائحة التي تم اختبارها. بروتوكول يسمح للتسجيل وتوصيف مستقبلات محددة في الخلايا العصبية في البيئة الخلوية من الظهارة. وبالتالي يمكن تحليل خصائص المستقبلات "على مستويات مختلفة: يجند محدد/ أو التفاعلات خلال الخطوة الأولى من مسار ترنسدوكأيشن. بالتالي، ناهض / التفاعلات خصم من بروابط متنوعة اختبار؛ خصائص خليط من التكامل من نسب الأرجحية محددة ودور مسار ترنسدوكأيشن لخصوصية OSNs '؛ تأثير على الترميز حاسة الشم من خلية الى خلية التفاعلات (مثل GAP مفرق) داخل الظهارة. وأخيرا تعديل لمسار ترنسدوكأيشن باستخدام عوامل الدوائية.

في الخلية التسجيلات فصلها، كما ذكر سابقا، فإن عملية التفكك يزيل المخاط والتفاعلات الخلية الى خلية داخل الظهارة الشمية. هذا ربما تتسبب في تغيرات في خصائص الترميز من OSNs. وذكرت في كثير من الأحيان تجارب التصوير الكالسيوم في الخلايا المعزولة. على سبيل المثال، تم الإبلاغ عن منحنيات الاستجابة للجرعة من M71 معربا عن OSNs ردا على acetophenone 7. هذه المنحنيات الجرعة والاستجابة هي أشد انحدارا من منحنيات جرعة الردود التي تم الحصول عليها باستخدام بروتوكولالمقدمة هنا 4. قد تكون هذه التناقضات بسبب التفاعلات الخلية الى خلية في إعداد سليمة، وكذلك لإزالة المخاط في الخلايا المعزولة. ومن المعروف المخاط لاحتواء العديد من البروتينات والأنزيمات المشاركة في الأحداث perireceptor الأساسية للتنبيغ حاسة الشم 22،23. في الإبلاغ عن بروتوكول هنا، والحفاظ على هيكل الظهارة الشمية وجود المفترضة من المخاط تسهم في الحفاظ على الملامح الأصلية للترميز الرائحة في OSNs. يشار إلى التركيزات المستخدمة في البروتوكول في مول / لتر وعادة ما تكون في 10 -7 -10 -3 النطاق. هذه التركيزات أعلى من التراكيز المستخدمة في التسجيلات الموزعة على الهواء (إما في إمكانات الميدانية المحلية أو تسجيلات خارج الخلية). قد تكون هذه التناقضات يرجع إلى i) الطور السائل من التسجيلات (وبالتالي من التحفيز) والثاني) لتبييض البطيء للمخاط من قبل التروية خلال التسجيلات. في الواقع، فإن فشل من MUCيمكن أن تدعم الولايات المتحدة وقسم من المحاور من OSNs 'أثناء تشريح أن إعداد عرض يكون مؤهلا يحتمل بأنها "شبه سليمة" بدلا من مستحضر "، سليمة تماما". هذا المستحضر يمثل إلا أن الظروف تسجيل أقرب إلى المجراة وقت ممكن، وبعد انتزاع تسجيلات التصحيح المشبك. مثل أي إعداد في المختبر من كائن الثدييات، لا يزال البقاء على قيد الحياة فترة محدودة. قد يكون هذا الحد يرجع إلى فشل من المخاط، وقسم من المحاور OSNs "فضلا عن غياب الدورة الدموية داخل الإعداد.

بروتوكول المعروضة هنا يسمح احد لتسجيل خصائص غشاء الخلايا العصبية الحسية الشمية. هذه التقنية يمكن أن يكون لها تطبيقات متعددة مثل تحليل خصائص الغشاء من OSNs والتحقيقات الدوائية من OSNs، تعديل خصائص الترميز الرائحة من OSNs، وdeorphanization من نسب الأرجحية. الأحداث المسجلة خلال التصوير الكالسيوم وسلوفاكياث وطويلة الأمد. تسجيلات التصحيح المشبك في الصدارة البروتوكول إلى بيانات حول الأحداث السريعة في تنبيغ السبيل الشمي على مستوى الغشاء.

يتم تنفيذ التسجيلات المقدمة هنا في التكوين التصحيح، المشبك. في هذا التكوين، خصائص غشاء الخلية المسجلة يمكن تحليلها، سواء كانت حاسة الشم آلية المسار ترنسدوكأيشن أو الجهد بوابات التيارات المعنية. يمكن التجارب باستخدام هذا البروتوكول توفير بيانات حول التشكيل من الرائحة الترميز خصائص OSNs. وكلاء الدوائية يمكن استخدامها لتحقيق تنبيغ حاسة الشم في ظروف مختلفة: على سبيل المثال، MDL12330A، وهو مانع للمحلقة الأدينيلات III (ACIII) 24،25 يمكن تطبيقها في حل نضح للتحقيق في دور ACIII في رد الرائحة. بالإضافة إلى ذلك، هذا البروتوكول يمكن استخدامها للتحقق من مدى حاسة الشم والتضمين خصائص الترميز في ظروف مختلفة مثل البيئة الشمية <سوب> 18 أو تحت تأثير الهرمونات المعنية في سلوكيات التغذية 26. أخيرا، يمكن هذا البروتوكول يؤدي أيضا إلى بيانات حول OR / التفاعل يجند وفك رموز ناهض / الأنشطة المتعارضة على نسب الأرجحية محددة أو حتى في مستقبلات اختيارها عشوائيا 27.

أخيرا، مع القيود الناجمة عن 7 برميل تحفيز ماصة، هذا البروتوكول يمكن أن تستخدم أيضا لdeorphanizing نسب الأرجحية. كما ذكر في وقت سابق، في هذه الحالة، يمكن أن يتم اختبار العديد من المخاليط الرائحة. وينبغي بعد ذلك تقسيم مخاليط حصول على استجابة إلى عطر الفردية اختبارها على خلايا أخرى.

من خلال استهداف OSNs معربا عن نسب الأرجحية محددة، هذا البروتوكول يوفر بيانات قوية عن نسب الأرجحية، بروابط / نسب الأرجحية التفاعلات، تنبيغ خصائص الطريق ومقارنة خصائص السكان محددة من OSNs في ظروف مختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
vibration table with Faraday cage TMC 63-500 SERIES required : isolates the recording system from vibrations induced by the environment (movements of experimenter, vibrations of equipment such as fans for cooling computers, etc); can also be purchased with a Faraday cage, or equipped by a custom made Faraday cage; this cage is recommended to avoid electric noise from the environment
optics
microscope Olympus BX51WI upright microcope equipped with epifluorescence; fixed or moving stage depending on the user's preference
objectives Olympus LUMPLFL40XW at least 2 objectives required: a 4X or 10X for coarse approach to the cell; and a 40X immersion long distance example Olympus LUMPLFL40XW / IR /0,8 / WD:3.3 MM
magnifier Olympus U-TVCAC ABSOLUTELY REQUIRED: placed in the light path between the objective and the camera; allows to magnify the image on the screen in order to reach precisely the knob with the recording electrode
camera Olympus DP72 a good camera is required to see the neurons in fluorescence as well as in bright field; the controlling software is simple and allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell. An ultrasensitive camera is not necessary
filters Olympus/Chroma depending on the fluorescent protein used in the mice; example for GFP: excitation : BP460-490: emission: HQ530/50m
amplifier HEKA EPC10 USB monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the puffing by sending a TTL signal to the spritzer; the EPC10 setup is controled by computer
software HEKA Patchmaster controls the amplifier during the experiment
micromanipulator Sutter MP225 precision micromanipulator, allows precise movements down to 1/10th of a micrometer; this model is very stable; avoid hydraulic manipulators that may drift
electrode puller Sutter P97 with a FT345-B wide trough filament;  to prepare recording pipets of about 2µm diameter with a long tip to reach the cells; the resistance should be 15 to 20Mohm with perforated patch clamp solution
glass Sutter BF120-69-10 in our recording conditions, this glass is ideal for recording pipets
recording chamber Warner Instruments RC-26G a chamber is needed to set the preparation under the microscope. To maintain the preparation in the center of the chamber, a net/anchor should be used.
stimulation
glass WPI TW100F-4 attached in groups of 7, these pipettes are used to prepare prepulled stimulating pipettes
multibarrel puller MDI PMP-107-Z by association of pull and twist, this puller allows us to prepare puffing electrodes with 7 barrels
precision pressure injector  Toohey Company P/N T25-1-900 Single Channel    this precision pressure injector  controls the pressure ejected in the multibarrel puller; it is controlled manually or by the amplifier by a 5V  TTLs
micromanipulator Narishige YOU-1 a coarse manipulator is enough to bring the puffing electrode close to the recording site
tubings N/A tygon tubing to bring the pressure from the puffer to the puffing pipette
solutions/perfusion/chemicals
vacuum pump gardner denver 300 series a vibrating membrane pump is more quiet and efficient than other types of pumps
perfusion system N/A N/A gravity perfusion system with polyethlylen tubing to bring in and out the external solution from the recording chamber
nystatin Sigma-Aldrich N3503 mandatory to perpare internal solution for perforated patch clamp
DIMETHYL SULFOXIDE Sigma-Aldrich D5879 used to disolve nystatin for internal solution for perforated patch 
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9625 extracellular solution
Potassium chloride Sigma-Aldrich P4504 intracellular/extracellular solution
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich C7902 extracellular solution
Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4) Sigma-Aldrich S9638 extracellular solution
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4 7H2O) Sigma-Aldrich 63140 extracellular solution
Glucose Sigma-Aldrich G8270 extracellular solution
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6297 extracellular solution
EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) Sigma-Aldrich E3889 internal solution
Potassium hydroxyde Sigma-Aldrich P1767 internal solution
Methyl Sulfoxide Sigma-Aldrich W387509 intracellular solution
Hepes-Na Sigma-Aldrich H7006 intracellular solution
Sucrose Sigma-Aldrich S0389 intracellular solution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lowe, G., Gold, G. H. Nonlinear amplification by calcium-dependent chloride channels in olfactory receptor cells. Nature. 366 (6452), 283-286 (1993).
  2. Ponissery Saidu, S., Dibattista, M., Matthews, H. R. Odorant-induced responses recorded from olfactory receptor neurons using the suction pipette technique. J Vis Exp. (62), e3862 (2012).
  3. Moss, R. L., et al. Electrophysiological and biochemical responses of mouse vomeronasal receptor cells to urine-derived compounds: possible mechanism of action. Chem Senses. 23 (4), 483-489 (1998).
  4. Kaur, A., Dey, S. Live cell calcium imaging of dissociated vomeronasal neurons. Methods Mol Biol. 1068, 189-200 (2013).
  5. Ma, M., Chen, W. R. Electrophysiological characterization of rat and mouse olfactory receptor neurons from an intact epithelial preparation. J Neurosci Methods. 92 (1-2), 31-40 (1999).
  6. Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
  7. Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C. Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system. J Neurosci. 22 (8), 3033-3043 (2002).
  8. Bozza, T., et al. Mapping of class I and class II odorant receptors to glomerular domains by two distinct types of olfactory sensory neurons in the mouse. Neuron. 61 (2), 220-233 (2009).
  9. Vassalli, A., Rothman, A., Feinstein, P., Zapotocky, M. Minigenes impart odorant receptor-specific axon guidance in the olfactory bulb. Neuron. 35 (4), 681-696 (2002).
  10. Feinstein, P., Bozza, T., Rodriguez, I., Vassalli, A. Axon guidance of mouse olfactory sensory neurons by odorant receptors and the beta2 adrenergic receptor. Cell. 117 (6), 833-846 (2004).
  11. Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat Rev Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).
  12. Grosmaitre, X., et al. SR1, a mouse odorant receptor with an unusually broad response profile. J Neurosci. 29 (46), 14545-14552 (2009).
  13. Grosmaitre, X., Vassalli, A., Mombaerts, P., Shepherd, G. M. Odorant responses of olfactory sensory neurons expressing the odorant receptor MOR23: a patch clamp analysis in gene-targeted mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (6), 1970-1975 (2006).
  14. Lam, R. S. Odorant responsiveness of embryonic mouse olfactory sensory neurons expressing the odorant receptors S1 or MOR23. Eur J Neurosci. 38 (2), 2210-2217 (2013).
  15. Zhang, J., Huang, G., Dewan, A., Feinstein, P. Uncoupling stimulus specificity and glomerular position in the mouse olfactory system. Mol Cell Neurosci. 51 (3-4), 79-88 (2012).
  16. Zhang, J., Pacifico, R., Cawley, D., Feinstein, P. Ultrasensitive detection of amines by a trace amine-associated receptor. J Neurosci. 33 (7), 3228-3239 (2013).
  17. Lee, A. C., Tian, H., Grosmaitre, X. Expression patterns of odorant receptors and response properties of olfactory sensory neurons in aged mice. Chem Senses. 34 (8), 695-703 (2009).
  18. Cadiou, H., et al. Postnatal odorant exposure induces peripheral olfactory plasticity at the cellular level. J Neurosci. 34 (14), 4857-4870 (2014).
  19. Mombaerts, P. Axonal wiring in the mouse olfactory system. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 713-737 (2006).
  20. Grosmaitre, X., Santarelli, L. C., Tan, J., Luo, M. Dual functions of mammalian olfactory sensory neurons as odor detectors and mechanical sensors. Nat Neurosci. 10 (3), 348-354 (2007).
  21. Duchamp-Viret, P., Chaput, M. A. Odor response properties of rat olfactory receptor neurons. Science. 284 (5423), 2171-2174 (1999).
  22. Heydel, J. M., et al. Odorant-binding proteins and xenobiotic metabolizing enzymes: implications in olfactory perireceptor events. Anat Rec (Hoboken). 296 (9), 1333-1345 (2013).
  23. Pelosi, P. Perireceptor events in olfaction). J Neurobiol. 30 (1), 3-19 (1996).
  24. Spehr, M., Wetzel, C. H., Hatt, H. 3-phosphoinositides modulate cyclic nucleotide signaling in olfactory receptor neurons. Neuron. 33, 731-739 (2002).
  25. Chen, S., Lane, A. P., Bock, R., Leinders-Zufall, T. Blocking adenylyl cyclase inhibits olfactory generator currents induced by 'IP(3)-odors. J Neurophysiol. 84 (1), 575-580 (2000).
  26. Savigner, A., et al. Modulation of spontaneous and odorant-evoked activity of rat olfactory sensory neurons by two anorectic peptides, insulin and leptin. J Neurophysiol. 101 (6), 2898-2906 (2009).
  27. Ukhanov, K., Brunert, D., Corey, E. A. Phosphoinositide 3-kinase-dependent antagonism in mammalian olfactory receptor neurons. J Neurosci. 31 (1), 273-280 (2011).

Tags

علم الأعصاب، العدد 101، علم الأعصاب، الكهربية، مثقب التصحيح، المشبك، الخلايا العصبية الحسية الشمية، التي تستهدف جينات الفأر، تنبيغ، والصيدلة.
مثقب تسجيل التصحيح، المشبك من الماوس العصبونات الحسية الشمية في الظهارة العصبية السليمة: التحليل الوظيفي من الخلايا العصبية التي تم تحديدها إبداء الرائحة مستقبلات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jarriault, D., Grosmaitre, X.… More

Jarriault, D., Grosmaitre, X. Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor. J. Vis. Exp. (101), e52652, doi:10.3791/52652 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter