Perfurado gravação patch-clamp de rato Olfactory neurônios sensoriais na Intact neuroepitélio: Análise Funcional do Neurônios Expressando uma Odorant Receptor Identificados
Summary
Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.
Abstract
Analisando as respostas fisiológicas de neurônios olfatórios (OSN) quando estimulados com ligantes específicos é fundamental para compreender a base dos comportamentos olfativos-driven e sua modulação. Estas propriedades de codificação dependem muito da interação inicial entre as moléculas de odor e do receptor olfativo (OR) expressa nas ORS. A identidade, especificidade e ligando espectro da expressa ou são críticos. A probabilidade de encontrar o ligando do ou expresso em um OSN escolhido aleatoriamente dentro do epitélio é muito baixo. Para responder a este desafio, este protocolo utiliza ratinhos geneticamente marcadas que expressam a proteína fluorescente GFP sob o controlo do promotor de RUP definidos. ORS estão localizadas no epitélio apertado e organizada que reveste a cavidade nasal, com as células vizinhas influenciar a sua maturação e função. Aqui nós descrevemos um método para isolar um epitélio olfativo intacta e gravar através de gravações de patch-clamp as propriedades de ORS expressing receptores olfativos definidos. O protocolo permite que um para caracterizar as propriedades de membrana OSN, mantendo a influência do tecido vizinho. A análise dos resultados de patch-clamp produz uma quantificação precisa de ligando / ou interações, vias de transdução e farmacologia, propriedades de codificação 'ORS e sua modulação em nível da membrana.
Introduction
Neurônios olfatórios (OSN) representam o primeiro passo de percepção olfativa. Localizado no epitélio olfativo que reveste a cavidade nasal nos roedores, eles transformam a informação química dos odores em potenciais de ação enviadas através do seu axônio para o cérebro. Para compreender melhor os mecanismos de codificação olfativas, é necessário caracterizar as propriedades de transdução de membrana e de ORS. Até recentemente, a maioria das técnicas usadas para caracterizar as propriedades de ORS de mamífero foram realizadas em dissociado ORS 1-4. O processo de dissociação usa vários (ou seja, enzimas) processos mecânicos e químicos para libertar os ORS de seu ambiente. Estes processos induzem um baixo número de células disponíveis para as gravações. Este número baixo pode ser ainda mais crítica no caso de células GFP rotulados. Dissociação também remove as interações locais célula-a-célula entre ORS e outras células do epitélio olfactivo, que pode melhorar survival e modulação das propriedades "ORS. A fim de evitar o procedimento de dissociação, uma preparação intacta foi desenvolvido 5.
Cada OSN expressa um receptor olfativo (OR) seleccionados a partir de uma grande família multigene 6. Há ~ 1000 RUP expressos no epitélio olfatório principal no mouse. Devido ao grande número de, ou em animais de tipo selvagem, as possibilidades para gravar ORS que expressam o mesmo ou são muito baixos. Para superar estas limitações, os ratinhos alvo do gene estão disponíveis em todas as ORS que expressam um identificado ou estão marcados com uma proteína fluorescente 7-9. Estes ORS marcadas foram usadas para fazer análise funcional em preparações dissociadas 7,10,11 com os inconvenientes mencionados anteriormente. Uma preparação epitélio intacto 5 de camundongos geneticamente marcadas, portanto, contorna essas questões. Ele permite o monitoramento da atividade de ORS expressam RUP definidos com precisão em um ambiente tão perto no vivo possível. Além disso, gravações de patch-clamp de ORS também permitir uma análise precisa das propriedades da membrana, via de transdução de farmacologia, ligando / ou interações. Todos estes tópicos dificilmente podem ser analisadas usando gravações extracelular. Nós usamos essa técnica para monitorar as respostas dos ORS que expressam os receptores olfativos SR1 e MOR23 12,13. A viabilidade da técnica foi confirmada por outros grupos em MOR23 expressam ORS 14, bem como em outras RUP neurónios que expressam 15,16. O controlo de uma população definida de ORS pode levar à análise das suas propriedades em muitos contextos diferentes, tais como o desenvolvimento 14, 17 envelhecimento, odorante induzida plasticidade 18, e o papel de variações na sequência do receptor olfactivo, em odor de codificação 15. Este protocolo proporciona assim uma ferramenta poderosa para monitorizar as propriedades funcionais de ORS definidas ao nível da membrana.
Protocol
Representative Results
Discussion
A capacidade deste protocolo para monitorar corretamente as propriedades de ORS saudáveis depende muito da qualidade da preparação. Por conseguinte, os passos de dissecação são críticos. Em primeiro lugar, é fundamental prestar atenção à qualidade (pH, osmolaridade), oxigenação e temperatura (gelo-frio, mas não congelado) do meio de dissecção. Em segundo lugar, a manipulação do epitélio com ferramentas de dissecação deve ser tão limitada quanto possível, para evitar danos. Finalmente, é ess…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors would like to thank Peter Mombaerts for the generous gift of OR-GFP mice; Anne Lefranc and the CSGA animal facility for excellent animal care. Funding was provided by CNRS through an ATIP and ATIP Plus grants, by Conseil Régional de Bourgogne (FABER and PARI grants), by Université de Bourgogne (BQR program).
Materials
| heavy equipment | |||
| vibration table with Faraday cage | TMC | 63-500 SERIES | required : isolates the recording system from vibrations induced by the environment (movements of experimenter, vibrations of equipment such as fans for cooling computers, etc); can also be purchased with a Faraday cage, or equipped by a custom made Faraday cage; this cage is recommended to avoid electric noise from the environment |
| optics | |||
| microscope | Olympus | BX51WI | upright microcope equipped with epifluorescence; fixed or moving stage depending on the user's preference |
| objectives | Olympus | LUMPLFL40XW | at least 2 objectives required: a 4x or 10x for coarse approach to the cell; and a 40x immersion long distance example Olympus LUMPLFL40XW/IR/0,8/WD:3.3 MM |
| magnifier | Olympus | U-TVCAC | ABSOLUTELY REQUIRED: placed in the light path between the objective and the camera; allows to magnify the image on the screen in order to reach precisely the knob with the recording electrode |
| camera | Olympus | DP72 | a good camera is required to see the neurons in fluorescence as well as in bright field; the controlling software is simple and allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell. An ultrasensitive camera is not necessary |
| filters | Olympus/Chroma | depending on the fluorescent protein used in the mice; example for GFP: excitation : BP460-490: emission: HQ530/50m | |
| recording electrodes /system | |||
| amplifier | HEKA | EPC10 USB | monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the puffing by sending a TTL signal to the spritzer; the EPC10 setup is controled by computer |
| software | HEKA | Patchmaster | controls the amplifier during the experiment |
| micromanipulator | Sutter | MP225 | precision micromanipulator, allows precise movements down to 1/1Oth of a micrometer; this model is very stable; avoid hydraulic manipulators that may drift |
| electrode puller | sutter | P97 | with a FT345-B wide trough filament; to prepare recording pipets of about 2µm diameter with a long tip to reach the cells; the resistance should be 15 to 20Mohm with perforated patch clamp solution |
| glass | sutter | BF120-69-10 | in our recording conditions, this glass is ideal for recording pipets |
| recording chamber | warner instruments | RC-26G | a chamber is needed to set the preparation under the microscope. To maintain the preparation in the center of the chamber, a net/anchor should be used. |
| stimulation | |||
| glass | WPI | TW100F-4 | attached in groups of 7, these pipettes are used to prepare prepulled stimulating pipettes |
| multibarrel puller | MDI | PMP-107-Z | by association of pull and twist, this puller allows us to prepare puffing electrodes with 7 barrels |
| precision pressure injector | Toohey Company | P/N T25-1-900 Single Channel | this precision pressure injector controls the pressure ejected in the multibarrel puller; it is controlled manually or by the amplifier by a 5V TTLs |
| micromanipulator | Narishige | YOU-1 | a coarse manipulator is enough to bring the puffing electrode close to the recording site |
| tubings | N/A | tygon tubing to bring the pressure from the puffer to the puffing pipette | |
| solutions/perfusion/chemicals | |||
| vacuum pump | gardner denver | 300 series | a vibrating membrane pump is more quiet and efficient than other types of pumps |
| perfusion system | N/A | N/A | gravity perfusion system with polyethlylen tubing to bring in and out the external solution from the recording chamber |
| nystatin | Sigma-Aldrich | N3503 | mandatory to perpare internal solution for perforated patch clamp |
| DIMETHYL SULFOXIDE | Sigma-Aldrich | D5879 | used to disolve nystatin for internal solution for perforated patch |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | extracellular solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | intracellular/extracellular solution |
| Calcium chloride di hydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | extracellular solution |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S9638 | extracellular solution |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4 7H2O) | Sigma-Aldrich | 63140 | extracellular solution |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | extracellular solution |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | extracellular solution |
| EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) | Sigma-Aldrich | E3889 | internal solution |
| Potassium hydroxyde | Sigma-Aldrich | P1767 | internal solution |
| MethylSulfoxide | Sigma-Aldrich | 47,135-6 | intracellular solution |
| Hepes-Na | Sigma-Aldrich | H7006 | intracellular solution |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | intracellular solution |
References
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