Abstract
Analizzando le risposte fisiologiche dei neuroni sensoriali olfattivi (OSN) quando stimolato con specifici ligandi è fondamentale per comprendere la base dei comportamenti olfattive-driven e la loro modulazione. Queste proprietà di codifica dipendono fortemente dalla interazione iniziale tra molecole di odore e il recettore olfattivo (OR) espresse nei OSNs. L'identità, specificità e ligando spettro della espressa o sono critici. La probabilità di trovare il ligando della OR esprime in OSN scelto casualmente all'interno dell'epitelio è molto bassa. Per affrontare questa sfida, questo protocollo utilizza geneticamente i topi con tag che esprimono la proteina fluorescente GFP sotto il controllo del promotore di RUP definiti. OSNs sono situati in un epitelio stretto e organizzato che riveste la cavità nasale, con le cellule vicine che influenzano la loro maturazione e funzione. Qui si descrive un metodo per isolare un epitelio olfattivo intatto e registrare tramite patch-clamp le proprietà di OSNs expressing recettori olfattivi definiti. Il protocollo consente di caratterizzare le proprietà della membrana OSN mantenendo l'influenza del tessuto adiacente. Analisi dei risultati di patch-clamp produce una precisa quantificazione del ligando / o interazioni, vie di trasduzione e farmacologia, codifica le proprietà OSN e la loro modulazione a livello della membrana.
Introduction
Neuroni sensoriali olfattivi (OSN) rappresentano il primo passo della percezione olfattiva. Situato nell'epitelio olfattivo rivestimento della cavità nasale nei roditori, trasformano l'informazione chimica di odori in potenziali d'azione inviati attraverso il loro assone al cervello. Per meglio comprendere i meccanismi di codifica olfattive, è necessario caratterizzare le proprietà di trasduzione e membrana di OSNs. Fino a poco tempo fa, la maggior parte delle tecniche utilizzate per caratterizzare le proprietà di OSNs mammiferi sono stati effettuati su dissociato OSNs 1-4. Il processo di dissociazione utilizza diversi (ad esempio, enzimi) processi meccanici e chimici per liberare i OSNs dal loro ambiente. Questi processi inducono un basso numero di cellule disponibili per le registrazioni. Questo numero basso può essere ancora più critico nel caso di cellule GFP etichettati. Dissociazione rimuove anche le interazioni locali cellula-cellula tra OSNs e altre cellule dell'epitelio olfattivo che possono aumentare survivabilityAl e modulazione delle proprietà OSN. Al fine di bypassare la procedura di dissociazione, una preparazione intatto è stato sviluppato 5.
Ogni OSN esprime un recettore olfattivo (OR) selezionati da una famiglia numerosa multigene 6. Ci sono ~ 1000 RUP espresse nella principale epitelio olfattivo nel topo. A causa del gran numero di OR in tipo animali selvatici, le possibilità di registrare OSNs esprimono la stessa OR sono molto basse. Per superare queste limitazioni, gene targeting topi sono disponibili in cui tutti OSNs esprimono un identificato o sono etichettati con una proteina fluorescente 7-9. Questi OSNs etichettati sono stati usati per fare l'analisi funzionale in preparazioni dissociate 7,10,11 con gli inconvenienti citati in precedenza. Un intatto preparazione epitelio 5 da topi geneticamente etichettati elude quindi questi problemi. Esso consente il monitoraggio dell'attività di OSNs esprimenti RUP precisamente definite in un ambiente il più vicino in vivo possibile. Inoltre, patch-clamp di OSNs consentono anche l'analisi precisa di proprietà di membrana, via di trasduzione del farmacologia, ligando / o interazioni. Tutti questi argomenti difficilmente possono essere analizzati utilizzando registrazioni extracellulari. Abbiamo usato questa tecnica per monitorare le risposte dei OSNs che esprimono i recettori olfattivi SR1 e MOR23 12,13. La fattibilità della tecnica è stata confermata da altri gruppi su MOR23 esprimenti OSNs 14 nonché su altri RUP esprimenti neuroni 15,16. Il monitoraggio di una popolazione definita di OSNs può portare alla analisi delle loro proprietà in diversi contesti quali lo sviluppo 14, invecchiamento 17, odorizzante indotta plasticità 18, e il ruolo delle variazioni di sequenza del recettore odorizzante in odore codifica 15. Questo protocollo prevede quindi un potente strumento per monitorare le proprietà funzionali di OSNs definiti a livello della membrana.
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Protocol
Questo protocollo segue le linee guida per la cura degli animali della Université de Bourgogne ed è stato approvato dal comitato etico Université de Bourgogne.
1. Gli animali
- Utilizzare tecniche di ingegneria genetica topi OR-IRES-tauGFP disponibili presso il laboratorio di Jackson. Questi topi sono stati sviluppati in laboratorio Dr. Peter Mombaerts 'al fine di analizzare il targeting degli assoni e lo sviluppo del sistema olfattivo 19. Ad esempio, la linea di MOR23-IRES-tauGFP, fotografia numero 006.643, porta il nome della razza ufficiale B6; 129P2- Olfr16 tm2Mom / MomJ; allo stesso modo, la linea SR1-IRES-tauGFP, fotografia numero 6717 porta il nome di B6 ufficiale; 129P2- Olfr124 tm1Mom / MomJ.
- Per quanto riguarda l'età degli animali: per un migliore risultato del protocollo, utilizzare animali tra 2 e 4 settimane di età. In questa fascia di età, la dissezione è più facile (ossa più morbide, più solida epitelio olfattivo) e le manopole dendritiche sono bigger confrontare animali più vecchi.
2. Preparazione di elettrodi e soluzioni
- Per le pipette stimolanti: acquisto prepulled stimolante pipette. In caso contrario, li prepara manualmente.
- Utilizzando una fiamma, piegare sei pipette di vetro di 1 mm circa 1 cm dalla punta. Inserire queste sei pipette più un diritto 7 ° in 1,5 centimetri termoretraibile tubi rafforzare da un occhiello.
- Termoretraibile il tubo per mantenere i barili legati insieme. Collegare un guaina termoretraibile supplementare agli altri estremità delle canne. Tirare la pipetta stimolante con un estrattore multi-barile.
- Aggiungete un po 'di liquido colla bianca intorno l'occhiello di rafforzare le punte piegate. Lasciate asciugare O / N.
- Preparare 1 o 2 L di soluzione extracellulare normale di Ringer (in mM: NaCl 124, KCl 3, MgSO4 1,3, CaCl 2 2, NaHCO3 26, NaH 2 PO 4 1.25, glucosio 15; pH 7,6 e 305 mOsm). Conservare a 4 ° Cfino al momento dell'uso.
- Preparare soluzione madre intracellulare (in mm): KCl 70, KOH 53, acido metansolfonico 30, EGTA 5, HEPES 10, di saccarosio 70; pH 7.2 (KOH) e 310 mOsm. Conservare a 4 ° C fino al momento dell'uso. Buon per diverse settimane.
- Preparare la soluzione intracellulare di registrazione con nistatina estemporanea (all'ultimo minuto) prima dell'esperimento.
- Pesare 3 mg di nistatina, aggiungere 50 ml di DMSO; vortex 20 sec poi sonicare 2-3 minuti fino a quando tutto diluito.
- Aggiungere 20 ml di soluzione di DMSO-nystatin in 5 ml di soluzione madre intracellulare. Vortex 20 sec, poi sonicare 3 min. Conservare questa soluzione a 4 ° C e proteggere dalla luce diretta, nistatina è sensibile alla luce. Questa soluzione può essere utilizzata per alcune ore. Sostituire ogni giorno.
- Una volta che la preparazione epitelio olfattivo è sotto il microscopio, prendere alcuni di questa soluzione in una siringa da 1 ml con una punta gialla allungata fiamma per riempire gli elettrodi; proteggere dalla luce diretta. Una volta a RT, la soluzione nistatinanon è stabile; sostituire la soluzione nella siringa da 1 ml ogni ora o tenerlo in ghiaccio.
- Tirare elettrodi di registrazione con un estrattore per ottenere il collo lungo e piccola mancia (~ 2 micron) con una resistenza di 15-20 MW con la soluzione nistatina interna.
- Preparare la soluzione odorizzante a 0,5 M in DMSO sotto cappa; Un'aliquota e conservare a -20 ° C fino al momento dell'uso. Diluire odorizzante in soluzione di Ringer fino alla concentrazione desiderata. Riempire la pipetta stimolante.
3. Preparazione di epitelio olfattivo
Nota: i topi OR-IRES-tauGFP esprimono il tauGFP sotto il controllo del promotore OR. In questi topi, tutti i neuroni che esprimono l'OR di interesse sono etichettati con GFP. Questo protocollo è adattato per RUP espressi in tutte le zone. Tuttavia, dissezioni e registrazioni sono più facili per RUP espresse nella zona dorsale.
- Anestetizzare l'animale iniettando una miscela di ketamina e xilazina (150 mg / kg e 10 mg / kg bodPeso y, rispettivamente). Decapitazione può essere effettuata con forbici affilate per i topi giovani o con ghigliottina roditore corretta manutenzione per i topi più anziani.
- Utilizzando anelli forbici dissezione fare una incisione longitudinale mediale attraverso la pelle dorsale. Togliere la pelle tirandolo a parte. Utilizzando le forbici, tagliare le ganasce inferiori alla mandibola. Rimuovere i denti anteriori superiori da un taglio coronale parallelo ai denti.
- Fare un taglio coronale della testa dietro gli occhi e mantenere solo la parte anteriore della testa. Immergerlo in soluzione di Ringer ghiacciata per la dissezione nell'ambito di applicazione.
- Sezionare nell'ambito di applicazione: nel lato ventrale, un taglio longitudinale lungo la mascella superiore / i denti. Tagliare le ossa dorsali longitudinalmente, seguendo il lato dorso-laterale della cavità nasale. Rimuovere la maggior parte delle ossa e del palato; trasferire il setto e l'epitelio collegato ad esso in ossigenato Ringer a RT.
- Per la dissezione finale: Poco prima di iniziare la registrazionesessione, staccarsi l'epitelio dal setto sottostante con una pinza. Staccare l'epitelio con una pinza e con due tagli 4-5 mm forbice (uso microvannas forbici) alla parte anteriore del setto, dove l'adesione è più forte.
- Rimuovere con cautela l'organo vomeronasale, tagliando fuori lungo il suo collegamento dorsale all'epitelio settale. Trasferire l'epitelio ad una camera di registrazione con lo strato di muco rivolto verso l'alto; tenere piatta nella camera con l'arpa.
- Installare camera sotto un microscopio verticale dotato di ottica di fluorescenza e una macchina fotografica sensibile. Visualizzare la preparazione sullo schermo del computer ad alto ingrandimento attraverso un obiettivo 40X acqua-immersion (apertura numerica 0,8) e un 2X o 4X supplementare ottenuto da una lente di ingrandimento. Profumato continuamente con ossigenato Ringer a RT (1-2 ml / min).
4. sessione di registrazione
- Cerca cell fluorescente: eccitare la preparazione a 480nm per EGFP, che emette luce nel range 530-550 nm; indirizzare una manopola dendritiche, che è affidabile visibile in fluorescenza e in campo luminoso.
- Riempire l'elettrodo con la soluzione intracellulare con nystatin; rimuovere le bolle picchiettando delicatamente sul dell'elettrodo.
- Inserire elettrodo sul portaelettrodo, applicare una pressione positiva nella pipetta; La resistenza dovrebbe essere 15-20 MW.
- Portare l'elettrodo vicino alla cella; una volta che la resistenza raggiunge ~ 40 MW, scaricare la pressione positiva e applicare una leggera pressione negativa per raggiungere un gigaseal.
- Raggiunta sigillo, impostare il potenziale di membrana a circa -75 mV;
- Una volta che la cellula si apre, procedere con protocolli di stimolazione, trattamenti farmacologici. Per misurare la risposta ad una singola stimolazione odorizzante, annotazione 200-500 msec di attività spontanea, stimolare per 500 msec e misurare la risposta della cella fino a 10 sec 13. Per i trattamenti farmacologici, profumato gli agenti farmacologici inla concentrazione desiderata 20.
Analisi 5. I dati
- Analizzare correnti indotte da stimolazione odorizzante come seguito: l'ampiezza massima, il tempo di salita (tempo necessario per raggiungere il 90% della massima ampiezza, in msec), la corrente totale (area sotto la curva in PAS), il tempo al 50% (tempo tra l'inizio e l'offset della risposta al 50% della massima ampiezza, in msec).
- Utilizzando le correnti di picco di trasduzione (ampiezza massima raggiunta) a diverse concentrazioni, disegnare e montare una curva dose-risposta con la seguente equazione Hill: I = Imax / (1 + (K 1/2 / C) n), dove I rappresenta la corrente di picco , Imax la massima risposta a concentrazioni saturazione, K1 / 2 la concentrazione alla quale è stato raggiunto metà della risposta massima, C la concentrazione di odorizzante ed n il coefficiente di Hill.
- Analizzare registrazioni di potenziale di membrana a pinza per la massima depolarizzazione, la totapotenziale l suscitato (area sotto la curva in mVsec); registrazione spontanea attività spiking oltre 30 sec a 1 min registrazioni; record di eccitabilità attraverso picchi indotte da iniezione di correnti (5-10 Pa).
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Representative Results
Il risultato di questo protocollo dipende dalla qualità della dissezione. Questa procedura dissezione deve essere breve (meno di 10 a 15 minuti) e preciso (ad esempio, per evitare danni del epitelio). La figura 1 illustra come una preparazione ideale assomiglia a diversi livelli di ingrandimento. Ad un basso ingrandimento in campo luminoso i diversi tipi di cellule (ad esempio le manopole di OSNs, sostenendo le cellule) sono distinguibili (Figura 1A). Al livello più alto ingrandimento, tipicamente 80X a 160X, in campo chiaro, le manopole dendritiche dei OSNs devono essere chiaramente distinguibili dalle cellule di supporto (Figura 1B). In luce fluorescente, solo le manopole dendritiche e le ciglia delle cellule GFP etichettati sono visibili (Figura 1C). Confrontando le due immagini, le cellule marcate può essere affrontato con la pipetta di registrazione (Figura 1D).
La temperatura della dissezione cosìluzione e la tempistica della dissezione sono critici. La prima parte della dissezione, la preparazione del setto (sezione 3.1.1 a 3.2) deve avvenire entro 5 a 10 min in soluzione ghiacciata. La dissezione finale (3.3) dovrebbe durare meno di 5 min a temperatura ambiente. Nel caso la dissezione durato troppo a lungo, o è stata eseguita in soluzione dissezione troppo caldo, la preparazione invariabilmente appare rapidamente danneggiato: manopole dendritiche galleggiano sopra la superficie dell'epitelio, e assomigliano cellule morte.
Una volta che una guarnizione viene raggiunto e la cella si apre sotto l'effetto di nistatina, correnti tipiche voltaggio dipendenti possono essere osservati (Figura 2A). La forma e le caratteristiche di tali correnti possono essere utilizzati per monitorare lo stato della cella: in una cella morire o se la qualità del sigillo è in diminuzione, ampiezza queste correnti 'diminuirà. Sotto la configurazione pinza, potenziali d'azione possono essere registrati sia spontaneamente (Figura 2B) o per iniezione di una corrente depolarizzante (Figura 2C). Le proprietà di cottura indotte da iniezione di corrente caratterizzano l'eccitabilità del neurone registrato. L'eccitabilità della popolazione differenti OSNs 'può essere paragonato (con frequenza classica e calcoli ISI).
Una pipetta multibarrel caricato con differenti odoranti e / o diverse concentrazioni di odori può essere utilizzato per stimolare le cellule mediante espulsione pressione. Ciò consente di misurare le risposte odorizzante indotta. Le odoranti e concentrazioni devono essere scelti a seconda delle OR espressa nella cella di interesse, per esempio Lyral è il ligando per MOR23, acetofenone per M71, eugenolo per mOREG. Nell'esperimento illustrato nella figura 3, i neuroni MOR23-IRES-tauEGFP registrati risposto a diverse concentrazioni di Lyral, un ligando per MOR23, in modalità pinza amperometrica (Figura 3A) o sotto il modo pinza tensione (Figure 3B). In tensione la registrazione in modalità morsetto, caratteristiche diverse possono essere monitorati per quantificare la risposta (ampiezza massima, salire in tempo, corrente totale suscitato, ecc.), Come eseguito classicamente in elettrofisiologia. Utilizzando la massima ampiezza della risposta odorizzante indotta, dose-risposta può essere tracciata e montato utilizzando l'equazione Hill. Questi risultati forniscono informazioni sulle proprietà di codifica di ogni OSN: soglia di rilevamento, dinamiche temporali, gamma dinamica e livello di saturazione. Esempi di curve dose-risposta sono mostrati nella Figura 3C. Tutti questi dettagli possono essere confrontati tra i singoli OSNs per misurare il potenziale eterogeneità all'interno di una popolazione; essi possono anche essere confrontati tra OSNs con o senza applicazione di un trattamento per misurare il potenziale modulazione e plasticità.
Figura 1: Immagini rappresentative di un preparato sano (A) epitelio olfattivo intatto estratto dalla cavità nasale di un topo transgenico SR1-IRES-tauGFP osservato in condizioni di campo luminoso presso l'ingrandimento 40X.. OSN manopole dendritiche (teste freccia nera) sono racchiusi in una maglia di cellule di supporto (SC) e le ghiandole Bowman (BG). (B) manopole dendritiche di SR1 esprimere OSNs osservati in condizioni di campo luminoso (punte di freccia bianca e rossa). (C) Lo stesso campo come in (B) sotto una luce fluorescente che mostra le manopole dendritiche di SR1 OSNs esprimono. (D) pipetta di registrazione si avvicina un OSN-SR1 esprime in campo luminoso. La freccia rossa rappresenta la stessa SR1 OSN a (B - D). Scala bar: 5 micron.
Figura 2: Rappresentante proprietà membrana risultati ottenuti con il protocollo:. Patch-clamp sulla manopola dendritiche di un SR1-IRES-tauGFP OSN (A) Tensione gated correnti indotte da crescente passi depolarizzanti dal potenziale di membrana -67 mV a +40 mV. (B) L'attività spontanea registrata nella configurazione pinza amperometrica; potenziali d'azione possono essere osservati durante l'epoca di registrazione 15 sec. (C) I potenziali d'azione indotte da una corrente +7 pA eccitatorio; questo protocollo fornisce informazioni sulla eccitabilità della cellula.
Figura 3:. Esempi rappresentativi di odorizzante indotta risposte in un neurone MOR23-IRES-tauEGFP concentrazioni crescenti di Lyral, un ligando del recettore MOR23, inducono risposte aumentando sia in pinza (A) e in tensione morsetto (B). Il potenziale di membrana è stata fissata a -67 mV. (C) Esempi di singoli curve dose-risposta acquisiti su tre neuroni M71 in risposta a concentrazioni crescenti di acetofenone e montati con l'equazione Hill.
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Discussion
La capacità di questo protocollo per monitorare correttamente le proprietà di OSNs sani dipende fortemente dalla qualità della preparazione. Pertanto, la procedura di dissezione sono fondamentali. Innanzitutto è fondamentale prestare attenzione alla qualità (pH, osmolarità), l'ossigenazione e temperatura (ghiacciata ma non congelato) del mezzo dissezione. In secondo luogo, la manipolazione dell'epitelio con strumenti di dissezione deve essere limitata come possibile per evitare danni. Infine, è fondamentale per ottenere un preparato più piatta possibile al fine di accedere alla grande popolazione OSN possibile.
La qualità dissezione è fondamentale per ottenere un preparato sano. Tuttavia, diversi approcci possono essere utilizzati per la dissezione: qui presentiamo una ventrale dorsale dissezione ma alcuni utenti possono preferire di avviare il dorsalmente dissezione per aprire la cavità nasale rapidamente ed avere un rapido accesso al vano del setto dell'epitelio olfattivo. Ogni utente può quindi adattare la protocol per la strategia più efficace per raggiungere una preparazione sana della zona di interesse.
Una volta che la preparazione è sotto il microscopio, è necessario il monitoraggio permanente della salute del preparato. Infatti, una preparazione malsano porta ad una bassa probabilità di raggiungere un gigaseal. Una bassa efficienza nell'ottenimento gigaseals può essere migliorata modificando l'area di interesse sulla preparazione per trovare OSNs sani. Una soluzione più drastica è quella di sostituire la preparazione interamente da uno nuovo. Una volta raggiunto il sigillo, una bassa probabilità di raggiungere lo stato "aperto" può avvenire. Ciò può essere dovuto alla qualità della soluzione interna. La soluzione interno deve essere preparata poco prima dell'esperimento. L'uso di vortice e sonicazione sono critiche in quanto la solubilità di nistatina è piuttosto bassa. Per migliorare la probabilità di apertura, la soluzione interna dovrebbe essere ancora in agitazione per 10 sec e poi sonicato per 30 a 60 sec. Questo usually migliora l'efficienza della apertura di cella.
Per stimolare la OSN registrato con odoranti, il protocollo presentato utilizza una pipetta stimolante 7 barile. Questo tipo di pipetta implica una limitazione del numero di odoranti e / o concentrazione di odoranti testati su ciascuno cellule registrate a sette. Questa limitazione è relativamente non significativa nel caso di una curva dose-risposta quanto può coprire fino a 7 unità logaritmiche di concentrazione. Tuttavia, nel caso di esperimenti di screening, in cui differenti odoranti vengono testati, una pipetta sette barilotto può mostrare limitazioni. In proiezione esperimenti, l'obiettivo è quello di trovare un ligando per OSNs etichettati esprimono un orfano OR. Usando questo protocollo richiede l'uso di miscele aromatiche. Ogni miscela luogo ad una risposta sarà poi suddiviso in singoli odori. Ciò è stato fatto per lo screening odori amine su TAAR esprimere OSNs 16. In questi esperimenti, i neuroni fluorescenti espressi Taars e il ligando era unknown. Utilizzando il protocollo, gli autori potrebbero vagliare diverse decine di odoranti ammine in miscele. Le miscele provochino una risposta sono stati poi suddivisi per singoli odori per trovare il ligando più efficiente.
La distanza tra il sito registrazione e la pipetta stimolante dovrebbe essere scelto con saggezza per minimizzare la stimolazione meccanica della cella 20. Se la pressione è troppo elevata (superiore a 30 psi nelle nostre condizioni di registrazione) e / o la distanza troppo piccola (inferiore a 20 micron), la risposta meccanica in alcuni OSNs può anche mascherare la risposta odorizzante. La pressione e la distanza tra la pipetta sbuffando e il sito di registrazione è anche fondamentale per controllare lo scambio soluzione durante la stimolazione. La concentrazione raggiunge il neurone è stato valutato per essere il più vicino possibile alla concentrazione presente nella pipetta attraverso una serie di test 13. Questi test hanno utilizzato una soluzione colorato con colorante blu per misurare l'inizio e l'offset di tegli stimolazione. Utilizzando 20 pressione psi e 30 micron di distanza, l'intensità massima dello stimolo è stato raggiunto entro 300 msec. L'offset dello stimolo è stato anche valutato accuratamente: poiché la preparazione è sotto flusso continuo di soluzione perfuso, lo stimolo è stato lavato entro 0,8-0,9 sec 13.
L'odore di codifica le proprietà di OSNs sono stati storicamente misurata attraverso registrazioni extracellulari in vivo o attraverso esperimenti su cellule isolate. Nei mammiferi, registrazioni extracellulari sono state eseguite in un primo in vivo in ratti 21. In registrazioni extracellulari, OR espresso nella cella registrata è sconosciuto limitando così la percentuale di successo per trovare una cella rispondendo al odorizzante testato. Il protocollo consente la registrazione e la caratterizzazione dei recettori definiti nei neuroni del ambiente cellulare dell'epitelio. Proprietà dei recettori possono quindi essere analizzati a diversi livelli: il ligando specifico/ o interazioni durante la prima fase del percorso di trasduzione; di conseguenza, l'agonista / antagonista interazioni di diversi ligandi testati; le proprietà di miscele di integrazione RUP definiti e il ruolo della via di trasduzione della specificità OSNs '; l'influenza sulla codifica olfattiva di cellula-cellula interazioni (come GAP junction) all'interno dell'epitelio; ed infine la modulazione della via di trasduzione utilizzando agenti farmacologici.
Nelle registrazioni cellule dissociate, come accennato in precedenza, il processo di dissociazione rimuove il muco e le interazioni cellula-cellula all'interno epitelio olfattivo. Questo può indurre cambiamenti nelle proprietà di codifica dei OSNs. Esperimenti di imaging di calcio su cellule isolate sono stati riportati frequentemente. Ad esempio, le curve dose-risposta di M71 esprimere OSNs in risposta a acetofenone sono stati riportati 7. Queste curve dose-risposta sono più ripida delle curve dose-risposte ottenute utilizzando il protocollopresentato qui 4. Queste differenze possono essere dovute alle interazioni cellula-cellula nella preparazione intatto e anche alla rimozione del muco in cellule isolate. Muco è nota la presenza di molti di proteine ed enzimi coinvolti in eventi perireceptor fondamentali per la trasduzione olfattiva 22,23. Nel protocollo qui riportato, la conservazione della struttura dell'epitelio olfattivo e la presenza putativo del muco contribuiscono a preservare le caratteristiche native di codifica odorizzante in OSNs. Le concentrazioni usate nel protocollo sono indicati in mol / L e di solito sono nella gamma 10 -3 -7 -10. Queste concentrazioni sono superiori concentrazioni usate nelle registrazioni aria fasi (sia nel potenziale campo locale o registrazioni extracellulari). Queste differenze possono essere dovute a i) la fase liquida delle registrazioni (e quindi della stimolazione) e ii) il lento washout del muco dalla perfusione durante le registrazioni. Infatti, il dilavamento dei MUCnoi e la sezione degli assoni dei OSN 'durante la dissezione può sostenere che la preparazione presentata essere potenzialmente qualificato come "pseudo-intatto" piuttosto che una preparazione "completamente intatto". Questa preparazione rappresenta, tuttavia, condizioni di registrazione il più vicino in vivo il più possibile e ancora che provochino patch-clamp. Come ogni preparazione in vitro da un organismo dei mammiferi, la sopravvivenza resta limitato nel tempo. Questo limite potrebbe essere dovuto al dilavamento del muco, la sezione di assoni OSN 'così come l'assenza di circolazione del sangue all'interno della preparazione.
Il protocollo presentato qui permette di registrare le proprietà di membrana dei neuroni sensoriali olfattivi. Questa tecnica può avere molteplici applicazioni quali l'analisi delle proprietà di membrana di OSNs, ricerche farmacologiche di OSN, la modulazione di odorizzante proprietà di codifica di OSNs e deorphanization delle RUP. Gli eventi registrati durante l'imaging calcio sono slow e di lunga durata. Registrazioni di patch-clamp in piombo presente protocollo per i dati sugli eventi rapidi trasduzione olfattiva a livello di membrana.
Le registrazioni qui presentati sono eseguite nella configurazione patch-clamp. In questa configurazione, le proprietà della membrana della cellula registrati possono essere analizzati, se è il meccanismo di trasduzione olfattiva o le correnti voltaggio-dipendenti coinvolti. Gli esperimenti che utilizzano questo protocollo in grado di fornire dati sulla modulazione del odorizzante codifica le proprietà di OSNs. Agenti farmacologici possono essere usati per studiare la trasduzione olfattiva in condizioni diverse: ad esempio, MDL12330A, un bloccante di adenilato ciclasi III (ACIII) 24,25 può essere applicato nella soluzione di perfusione per studiare il ruolo di ACIII in una risposta odorizzante. Inoltre, questo protocollo può essere usato per studiare come olfattiva proprietà di codifica sono modulati in diverse condizioni quali l'ambiente olfattiva <sup> 18 o sotto l'influenza di ormoni coinvolti nel comportamento alimentare 26. Infine, questo protocollo può anche portare a dati relativi OR interazione / ligando e decifrare agonisti / attività antagonista su RUP definiti o anche in recettori scelti a caso 27.
Infine, con le limitazioni dovute alla pipetta stimolante 7 barilotto, questo protocollo può essere anche essere utilizzato per deorphanizing RUP. Come accennato in precedenza, in questo caso, diverse miscele aromatiche possono essere testati. Le miscele che provochino una risposta dovrebbe poi essere divisi in singoli odori sperimentati su altre cellule.
Prendendo di mira OSNs esprimere RUP definiti, questo protocollo fornisce dati potenti sulle RUP, ligandi / RUP interazioni, trasduzione proprietà pathway e per confrontare le proprietà delle popolazioni definite di OSNs in diverse condizioni.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| vibration table with Faraday cage | TMC | 63-500 SERIES | required : isolates the recording system from vibrations induced by the environment (movements of experimenter, vibrations of equipment such as fans for cooling computers, etc); can also be purchased with a Faraday cage, or equipped by a custom made Faraday cage; this cage is recommended to avoid electric noise from the environment |
| optics | |||
| microscope | Olympus | BX51WI | upright microcope equipped with epifluorescence; fixed or moving stage depending on the user's preference |
| objectives | Olympus | LUMPLFL40XW | at least 2 objectives required: a 4X or 10X for coarse approach to the cell; and a 40X immersion long distance example Olympus LUMPLFL40XW / IR /0,8 / WD:3.3 MM |
| magnifier | Olympus | U-TVCAC | ABSOLUTELY REQUIRED: placed in the light path between the objective and the camera; allows to magnify the image on the screen in order to reach precisely the knob with the recording electrode |
| camera | Olympus | DP72 | a good camera is required to see the neurons in fluorescence as well as in bright field; the controlling software is simple and allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell. An ultrasensitive camera is not necessary |
| filters | Olympus/Chroma | depending on the fluorescent protein used in the mice; example for GFP: excitation : BP460-490: emission: HQ530/50m | |
| amplifier | HEKA | EPC10 USB | monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the puffing by sending a TTL signal to the spritzer; the EPC10 setup is controled by computer |
| software | HEKA | Patchmaster | controls the amplifier during the experiment |
| micromanipulator | Sutter | MP225 | precision micromanipulator, allows precise movements down to 1/10th of a micrometer; this model is very stable; avoid hydraulic manipulators that may drift |
| electrode puller | Sutter | P97 | with a FT345-B wide trough filament; to prepare recording pipets of about 2µm diameter with a long tip to reach the cells; the resistance should be 15 to 20Mohm with perforated patch clamp solution |
| glass | Sutter | BF120-69-10 | in our recording conditions, this glass is ideal for recording pipets |
| recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | a chamber is needed to set the preparation under the microscope. To maintain the preparation in the center of the chamber, a net/anchor should be used. |
| stimulation | |||
| glass | WPI | TW100F-4 | attached in groups of 7, these pipettes are used to prepare prepulled stimulating pipettes |
| multibarrel puller | MDI | PMP-107-Z | by association of pull and twist, this puller allows us to prepare puffing electrodes with 7 barrels |
| precision pressure injector | Toohey Company | P/N T25-1-900 Single Channel | this precision pressure injector controls the pressure ejected in the multibarrel puller; it is controlled manually or by the amplifier by a 5V TTLs |
| micromanipulator | Narishige | YOU-1 | a coarse manipulator is enough to bring the puffing electrode close to the recording site |
| tubings | N/A | tygon tubing to bring the pressure from the puffer to the puffing pipette | |
| solutions/perfusion/chemicals | |||
| vacuum pump | gardner denver | 300 series | a vibrating membrane pump is more quiet and efficient than other types of pumps |
| perfusion system | N/A | N/A | gravity perfusion system with polyethlylen tubing to bring in and out the external solution from the recording chamber |
| nystatin | Sigma-Aldrich | N3503 | mandatory to perpare internal solution for perforated patch clamp |
| DIMETHYL SULFOXIDE | Sigma-Aldrich | D5879 | used to disolve nystatin for internal solution for perforated patch |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | extracellular solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | intracellular/extracellular solution |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | extracellular solution |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S9638 | extracellular solution |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4 7H2O) | Sigma-Aldrich | 63140 | extracellular solution |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | extracellular solution |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | extracellular solution |
| EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) | Sigma-Aldrich | E3889 | internal solution |
| Potassium hydroxyde | Sigma-Aldrich | P1767 | internal solution |
| Methyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | W387509 | intracellular solution |
| Hepes-Na | Sigma-Aldrich | H7006 | intracellular solution |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | intracellular solution |
References
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