Abstract
특정 리간드로 자극시 후각 감각 뉴런의 생리적 반응 (OSN)를 분석하는 것은 후각 구동 동작과 그 변조의 기초를 이해하는 것이 중요하다. 이러한 코딩 특성은 냄새 분자와 후각 수용체 (OR) 사이의 초기 상호 작용에 크게 의존하는 OSNs로 표현. 명시 적 또는 중요한의 ID, 특이 리간드 스펙트럼. 또는의 리간드를 찾을 수있는 확률은 상피 내에서 무작위로 선택된 OSN 매우 낮은 표현했다. 이러한 과제를 해결하기 위해,이 프로토콜은 전적으로 정의 논리합의 프로모터의 제어하에 형광 단백질 GFP를 발현하는 태깅 된 마우스를 사용한다. OSNs는 이웃 세포가 자신의 성숙과 기능에 영향을 미치는으로, 비강 안감 꽉 및 조직 상피에 있습니다. 여기에서 우리는 OSNs 전자의 속성을 그대로 후각 상피를 분리하고 패치 클램프 녹음을 기록하는 방법을 설명정의 후각 수용체를 xpressing. 프로토콜은 인접한 조직의 영향을 유지하면서 하나 OSN 막 성질을 특성화 할 수있다. 패치 클램프 결과의 분석은 리간드 / 또는 상호 작용, 전달 경로 및 약리학, OSNs '코딩 특성과 막 수준에서 자신의 변조의 정확한 정량을 산출한다.
Introduction
후각 감각 뉴런 (OSN)는 후각 인식의 첫 번째 단계를 나타냅니다. 설치류의 비강에 선을 긋고있는 후각 상피에 위치한, 그들은 뇌에 자신의 축삭을 통해 전송 활동 전위에 냄새 물질의 화학적 정보를 변환. 더 후각 부호화 메커니즘을 이해하기 위해서는 OSNs의 전달 및 막 특성을 특성화하는 것이 필요하다. 최근까지, 포유 동물 OSNs의 성질을 특성화하기 위해 사용되는 기법은 대부분 해리 OSNs 1-4에서 수행 하였다. 해리 과정은 자신의 환경에서 OSNs을 확보하기 위해 다양한 기계 및 화학 물질 (즉, 효소) 프로세스를 사용합니다. 이러한 과정은 녹화 가능 세포의 낮은 번호를 유도한다. 이러한 낮은 수는 GFP 표지 된 세포의 경우에 훨씬 더 중요 할 수있다. 해리도 및 OSNs surviv 중을 상승시킬 수 후각 상피의 다른 셀 간의 로컬 세포 간 상호 작용을 제거알과 OSNs '속성의 변조. 해리 과정을 생략하기 위해, 제제는 그대로 5 개발되었다.
각 OSN은 큰 multigene 가족 (6)에서 선택 (OR) 하나의 후각 수용체를 표현한다. 마우스의 주요 후각 상피 세포에서 발현 1,000 관찰 보고서는 ~가 있습니다. 인해 야생형 동물 OR의 다수에, 기회는 동일한 발현 OSNs 기록 OR 매우 낮은한다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 유전자 표적으로 마우스를 사용할 수있는 식별 또는 형광 단백질 7-9로 표시되어 표현하는 모든 OSNs. 이 표시 OSNs는 해리 준비 앞에서 언급 한 단점과 7,10,11에 기능 분석을 수행 하였다. 유전자 표지 된 마우스의 상피 손상 5- 따라서 이러한 문제를 회피. 이것은 VI에서에 가까운 환경에서 정확하게 정의 논리합을 표현 OSNs의 활동의 모니터링을 허용가능한 한 VO. 게다가, OSNs의 패치 클램프 녹음도 막 특성, 전달 경로의 약리학, 리간드 / 또는 상호 작용의 정확한 분석을 할 수 있습니다. 이러한 모든 항목은 거의 세포 외 녹음을 사용하여 분석 할 수 없습니다. 우리 취제 수용체 SR1 및 MOR23 12,13 발현 OSNs의 응답을 모니터링하기 위해이 기술을 사용했다. 기술의 실현 가능성은 뉴런 15,16 표현 OSNs 14 발현 MOR23에 다른 그룹뿐만 아니라 다른 논리합에 의해 확인 하였다. OSNs의 정의 인구의 모니터링 (17) 노화, 이러한 개발 (14)와 같은 많은 다른 상황에서 그 특성의 분석으로 이어질 수, 부 취제 유도 소성 (18), 15 코딩 냄새에 후각 수용체의 서열 변화의 역할. 이 프로토콜은, 따라서 멤브레인 레벨에서 정의 OSNs의 기능적 특성을 모니터링하는 강력한 도구를 제공한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
이 프로토콜은 Université 드 부르고뉴의 동물 보호 지침을 다음과 Université 드 부르고뉴 윤리위원회에 의해 승인되었다.
1. 동물
- 잭슨 연구소 가능한 유전자 조작 또는-IRES-tauGFP 마우스를 사용합니다. 이러한 마우스는 후각 기관 (19)의 축삭 타겟팅 및 개발을 분석하기 위해 닥터 피터 Mombaerts '실험실에서 개발되었다. 예를 들어, MOR23-IRES-tauGFP 라인, 재고 번호 006643는 공식 변형 이름 B6 곰, 129P2- Olfr16 tm2Mom / MomJ을; 유사하게, SR1-IRES-tauGFP 라인은 재고 번호 6717의 공식 이름 B6 곰, 129P2- Olfr124 tm1Mom / MomJ을.
- 동물의 연령에 대해서는 : 프로토콜의 더 나은 결과를 위해, 생후 2 4 주 사이에 동물을 사용한다. 이 연령 그룹에서 해부 쉽게 (부드러운 뼈, 탄력있는 후각 상피 세포)와 수지상 노브는 양방향입니다입니다gger 오래된 동물에 비교합니다.
전극 및 솔루션 2. 준비
- 자극 피펫의 경우 : 구입 피펫을 자극 prepulled. 그렇지 않으면, 수동으로 준비합니다.
- 화염을 사용하여, 선단에서 약 1cm의 6 1mm 유리 피펫을 구부리. 구멍에 의해 강화 1.5 CM 열 수축 관에이 여섯 피펫 플러스 바로 7 번째를 삽입합니다.
- 열은 배럴 함께 접착을 유지하기 위해 수축 배관. 배럴의 다른 말단에 추가로 열 수축 튜브를 연결합니다. 멀티 배럴 풀러와 함께이 자극 피펫을 당깁니다.
- 굽 팁을 강화하기 위해 구멍 주위에 약간의 흰색 액체 접착제를 추가합니다. 건조 O를 /의 N하자.
- 일반 링어의 세포 외 액의 1 또는 2 L 준비 (MM에서 : 염화나트륨 (124)의 KCl 3, 황산 1.3, CaCl2를 2, NaHCO3를 26의 NaH 2 PO 4 1.25, 포도당 (15), pH가 7.6, 305 mOsm). 4 ° C에서 유지사용할 때까지.
- (MM)에 세포 원액 준비 : KCl을 70, KOH (53), 메탄 설 폰산 (30), EGTA 5, HEPES (10), 수 크로스 (70); pH가 7.2 (KOH), 310 mOsm. 사용까지 4 ℃에서 보관하십시오. 몇 주에 대 한 좋은.
- 실험 전에 (마지막 순간) 즉흥적 니 스타틴과 세포 내 기록 솔루션을 준비합니다.
- DMSO의 50 μl를 추가, 니 스타틴의 3 mg의 무게; 완전히 희석 될 때까지 소용돌이 20 초 후 2 ~ 3 분을 초음파 처리.
- 세포 내 원액 5ml에 DMSO-니 스타틴 용액 20 μl를 추가합니다. 소용돌이 20 초 후 3 분을 초음파 처리. 4 ° C에서이 솔루션을 유지하고 직사광선으로부터 보호, 니 스타틴은 빛에 민감한입니다. 이 용액을 몇 시간 동안 사용할 수있다. 매일 교체합니다.
- 후각 상피 준비가 현미경되면, 전극을 채우기 위해 불꽃 긴 노란색 팁 1 ML의 주사기에이 솔루션의 일부를 가지고; 직사광선으로부터 보호합니다. RT에서, 니 스타틴 용액 일단안정되지; 매 시간마다 주사기 또는 얼음에 보관 ㎖로 1 솔루션을 교체합니다.
- 내부 니 스타틴 솔루션을 15 ~ 20 MΩ의 저항과 긴 목과 작은 팁 (~ 2 μm의)를 얻기 위해 풀러와 기록 전극을 당깁니다.
- 흄 후드 아래에 DMSO 0.5 M에서 취제 솔루션을 준비; 나누어지는 및 사용할 때까지 -20 ° C에서 보관하십시오. 원하는 농도까지 링거액에 부 취제를 희석. 자극 피펫을 채 웁니다.
후각 상피 3. 준비
주 : OR-IRES-tauGFP 마우스는 OR 프로모터의 제어하에 tauGFP 표현. 이 마우스에서 관심의 또는를 표현하는 모든 신경 세포는 GFP로 표시되어 있습니다. 이 프로토콜은 모든 영역에서 발현 논리합하도록 구성된다. 그러나, 해부 및 녹음 등의 영역에서 표현 관찰 보고서에 대한 쉽다.
- 자일 라진 및 케타민 (150 ㎎ / ㎏ 및 10 ㎎ / ㎏ BOD의 혼합 주사하여 동물을 마취Y 무게, 각각). 참수는 젊은 쥐에 대한 이상 마우스에 대한 제대로 관리 설치류 단두대와 날카로운 가위로 수행 할 수 있습니다.
- 사용 링 해부 가위는 등쪽 피부를 통해 종 방향 내측 절개를합니다. 그것을 떨어져 당겨 피부를 제거합니다. 가위를 사용하여 턱 관절에서 아래턱을 잘라. 치아 관상 컷 병렬로 위 앞니를 제거합니다.
- 눈 뒤에 머리의 관상 컷을 확인하고 머리의 앞쪽 부분을 유지. 범위에서 해부를위한 얼음처럼 차가운 링거 용액에 담근다.
- 범위에서 해부 : 복부 측면에서, 위 턱 / 이빨을 따라 길이 절단을합니다. 비강 배측-외측부 다음, 종 지느러미 뼈를 잘라. 대부분의 뼈와 미각을 제거; 실온에서 산소 벨소리에 부착 된 격벽과 상피 세포를 전송합니다.
- 최종 절개의 경우 : 마우스 오른쪽 버튼으로 녹화를 시작하기 전에세션은, 집게로 기본 격막에서 상피를 벗겨. 집게와의 접착 성이 강한 격막의 앞쪽 부분에 두 4-5mm의 가위 컷 (사용 microvannas 가위)와 상피를 분리합니다.
- 조심스럽게 중격 상피에 그 등의 연결을 따라 밖으로 절단하여 골코 (vomeronasal) 기관을 제거합니다. 위로 향하게 점액층으로 기록 챔버로 이동 상피; 하프와 챔버에 평면을 유지.
- 형광 광학 및 민감한 카메라가 장착 된 수직 현미경 실을 설치합니다. 40X 물 침지 목표 (개구 0.8) 및 확대 렌즈에 의해 달성 여분의 2 배 또는 4 배 확대를 통해 높은 배율에서 컴퓨터 화면의 준비를 시각화. 실온에서 산소 벨소리 (1-2 ml / 분)와 함께 지속적으로 관류.
4. 녹음 세션
- 형광 셀에 대한 검색 : 480에서 준비를 자극530-550 nm의 범위에서 발광 용 나노 EGFP; 형광의 밝은 분야에서 확실하게 볼 수 있습니다 하나 수지상 노브를 대상으로.
- 니 스타틴과 세포 내 솔루션 전극을 채우기; 부드럽게 전극에 눌러 거품을 제거합니다.
- , 전극 홀더에 전극을 삽입 피펫에 긍정적 인 압력을 적용; 저항은 15 ~ 20 MΩ해야한다.
- 셀에 가까운 전극을 가져와; 저항 ~ 40 MΩ에 도달하면, 긍정적 인 압력을 해제하고 기가 시일에 도달하려면 약간의 부정적인 압력을 적용합니다.
- 시일에 도달하면, 약 -75 MV의 막 전위를 설정;
- 셀이 열리면 자극 프로토콜 약리 치료 진행. 단일 자극 취제, 기록 자발 활동 200-500 밀리에 대한 응답을 측정하기 위해 500 msec의 자극과 최대 10 초 13 대 세포의 반응을 측정한다. 약물 치료의 경우에서 약리 에이전트를 관류원하는 농도 (20).
5. 데이터 분석
- 그 다음으로 취제 자극 유도 전류를 분석 (밀리 초에서 최대 진폭의 90 %에 도달하는데 필요한 시간)의 최대 진폭, 상승 시간, 전체 전류 (PAS의 곡선 아래 영역), 시간을 50 % (개시 및 밀리에서 최대 진폭의 50 %의 응답 시간 사이의 오프셋).
- 그리는 힐 방정식을 이용하여 투여 량 반응 곡선에 맞는 서로 다른 농도 (최대 진폭에 도달) 피크 전달 전류를 사용 : I = 아이 맥스 / (1 + (K 1/2 / C) N) I는 피크 전류를 나타내고, , 최대 반응의 절반에 도달되었을 때의 K1 / 2 농도, C 취제의 농도이고; n은 힐 (Hill) 계수를 포화 농도에서 최대 반응을 IMAX.
- 최대 탈분극의 현재 클램프자는 tota을 막 전위의 기록을 분석L 전위 (mVsec에서 곡선 아래 면적)를 유발; 30 초 ~ 1 분 녹음을 통해 기록 자발적인 급상승 활동; 전류 (5 ~ 10 PA)의 주입에 의해 유도 스파이크를 통해 기록 흥분.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
이 프로토콜의 결과는 절개의 품질에 따라 달라집니다. 이 해부 단계는 짧은 (이하 10 분 ~ 15) 및 (즉, 상피 세포의 손상을 방지하기 위해) 정확해야합니다. 그림 1은 이상적인 준비가 다른 배율 수준에서처럼 보이는 방법을 보여줍니다. 밝은 필드 아래 낮은 배율 (예컨대 세포를지지 OSNs의 손잡이와 같은) 다른 유형의 세포는 구별 (도 1A)이다. 최대 배율 수준에서, 일반적으로 80X 160X에, 밝은 필드에 OSNs의 수지상 노브는지지 세포 (그림 1B)에서 명확하게 구별해야한다. 형광등 아래 만 수지상 노브와 GFP 표지 세포의 섬모 (그림 1C) 볼 수 있습니다. 두 이미지를 비교함으로써, 표지화 된 세포는 기록 피펫 (도 1D)으로 접근 할 수있다.
해부의 온도 때문에lution과 절개의 타이밍이 중요하다. 해부의 첫 부분은, 격벽 (3.2 섹션 3.1.1)의 제조는 빙냉 용액에 5 내지 10 분 이내에 이루어져야. 최종 해부 (3.3)을 실온에서 5 분 이하로 지속한다. 수지상 노브는 상피 세포의 표면 위에 떠 있으며, 죽은 세포를 닮은 : 경우에 절개가 너무 오래 지속, 또는 해부 솔루션 너무 따뜻한에서 수행하고, 준비는 변함없이 빠른 속도로 손상 보인다.
시일에 도달하고 전지가 니 스타틴의 영향하에 열리면 전압 전형적인 게이트 전류 (도 2a)를 관찰 할 수있다. 이러한 형상 및 전류 특성이 셀의 상태를 모니터링하는데 사용될 수있다 : 씰의 품질이 저하되는 셀 또는 죽어있는 경우,이 전류 '진폭은 감소한다. 현재 클램프 구성에서 활동 전위가 어느 자발적으로 기록 할 수있다 (그림 2B) 또는 탈분극 전류 (도 2C)의 주사에 의해. 전류 주입에 의한 소성 특성이 기록 된 신경 세포의 흥분성을 특징. 다른 OSNs '인구의 흥분성이 (고전 주파수 및 ISI 계산을 사용)과 비교 될 수있다.
다른 냄새 물질 및 / 또는 상이한 농도의 방향제 로케이션 multibarrel 피펫 토출 압력에 의해 세포를 자극하는데 사용될 수있다. 이 취제 유도 반응을 측정 할 수 있습니다. 또는 관심의 세포에서 발현에 냄새 물질 및 농도는 예를 들어 리랄는 MOR23, M71에 대한 아세토 페논, mOREG에 대한 유제 놀에 대한 리간드, 따라 선택해야합니다. 도 3에 도시 된 실험에서, 기록 MOR23-IRES-tauEGFP 뉴런도 (전류 클램프 모드 (도 3A) 하에서 또는 전압 클램프 모드에서, 리랄, MOR23 대한 리간드의 다양한 농도에 반응URE의 3B). 전압 클램프 모드 녹음에서, 서로 다른 특성 (시간 증가, 현재 총 유도, 등., 최대 진폭) 전기 생리학에 고전을 수행하면서 응답을 정량화하는 모니터링 할 수 있습니다. 취제 유발 반응의 최대 진폭을 사용하여 용량 반응 플롯과 힐 방정식을 이용하여 장착 할 수있다. 감지 임계 값, 시간 동적, 동적 범위와 채도 수준 : 이러한 결과는 각 OSN의 인코딩 속성에 대한 정보를 제공합니다. 용량 - 반응 곡선의 예는도 3C에 도시되어있다. 이러한 모든 세부 사항은 인구 내에서 잠재적 인 이질성을 측정하기 위해 개별 OSNs 사이에 비교 될 수있다; 그들은 또한 잠재적으로 또는 변조 및 가소성을 측정하는 처리의 적용없이 OSNs 사이에 비교 될 수있다.
도 1 : 건강한 제제의 대표적인 이미지 40X 배율 시야 조건 하에서 관찰 SR1-IRES-tauGFP 트랜스 제닉 마우스의 비강으로부터 추출 (A) 본래의 후각 상피.. OSN 수지상 노브 (검은 색 화살표 머리)를 지원하는 세포 (SC)와 보 우먼 땀샘 (BG)의 메쉬로 묶습니다. 시야 조건 (흰색과 빨간색 화살표 머리)으로 관찰 OSNs을 표현 SR1의 (B) 수지상 노브. (C) SR1 표현 OSNs의 수지상 노브를 보여주는 형광 빛 아래 (B)과 동일한 필드. (D) 시야에서 SR1 발현 OSN 접근 기록 피펫. (- D B) 빨간색 화살표는 동일한 SR1 OSN을 나타냅니다. 스케일 바 : 5 μm의.
그림 2 : 프로토콜로 얻은 대표 막 특성 결과 :. 40에 막 잠재적 -67 MV를 탈분극 단계를 증가시켜 유도 SR1-IRES-tauGFP OSN의 수지상 손잡이에 패치 클램프 녹음 (A) 전압 게이트 전류 MV. (B) 전류 클램프 구성에 기록 운동량; 활동 전위는 15 초 기록 에포크 동안 관찰 될 수있다. 7 pA를 흥분성의 전류에 의해 유도 (C) 활동 전위; 이 프로토콜은 세포의 흥분에 대한 정보를 제공합니다.
도 3 :. 리랄, MOR23 수용체 리간드의 MOR23-IRES-tauEGFP 뉴런에서 취제 유도 반응의 대표적인 예 농도 증가는 전류 클램프 (A)와 전압 클램프 (B) 모두에서 반응을 증가 유도한다. 막 전위는 -67 MV에 고정시켰다. (C) 힐 방정식 페논의 농도 증가에 응답하여 세 M71 뉴런에 취득 끼워 개별 투여 량 - 반응 곡선의 예.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
올바르게 건강한 OSNs의 특성을 모니터링이 프로토콜의 능력은 제제의 품질에 크게 의존한다. 따라서, 해부 단계는 매우 중요하다. 첫째는 품질 (PH, 삼투압), 산소 및 온도 (빙냉하지만 냉동 생략) 해부 배지에 주목하는 것이 중요하다. 둘째, 해부 도구 상피의 조작 등의 손상을 피하기 위해 가능한 한 제한해야한다. 마지막으로, 가능한 최대 OSN 인구를 액세스하기 위해 가능한 한 평탄 제제를 얻는 것이 중요하다.
해부 품질은 건강한 준비를 얻기 위해 필수적입니다. 해부를 지느러미 여기 우리는 복부를 제공하지만 일부 사용자는 빠르게 비강을 열고 후각 상피의 중격 홈에 빠르게 액세스 할 수있는 해부 등쪽을 시작하는 것을 선호 할 수 있습니다 그러나, 다른 방법은 절개 사용할 수 있습니다. 각 사용자는 따라서 홍보를 적용 할 수 있습니다관심 영역의 제조 건강한 도달하는 가장 효율적인 전략 otocol.
제제 현미경되면 제제의 건강 영구 모니터링이 요구된다. 실제로, 건강에 해로운 준비 기가 시일에 도달하는 확률이 낮은 리드. gigaseals 구해진 저효율 건강한 OSNs를 찾기 위해 제제에 관심 영역을 변경함으로써 개선 될 수있다. 더 급격한 용액 새로운 것으로 전적으로 제제를 대체하는 것이다. 시일에 도달하면 낮은 확률은 "개방"상태가 발생할 수에 도달한다. 이것은 내부 솔루션의 품질에 기인 할 수있다. 내부 솔루션은 실험 직전에 준비를해야합니다. 니 스타틴의 용해성이 낮기 때문에 오히려 와류 및 초음파의 사용은 중요하다. 개구의 가능성을 향상시키기 위해, 내부 용액을 다시 10 초 동안 볼 텍싱하고 30 내지 60 초 동안 초음파 처리한다. 이 우스동맹은 셀 개방의 효율성을 향상시킨다.
취기와 기록 OSN을 자극하기 위해 제시 한 프로토콜은 7 통 자극 피펫을 사용합니다. 피펫이 유형의 방향제 및 / 또는 일곱 각 셀에 기록 된 테스트 취기 농도의 수가 제한을 의미한다. 이 농도의 로그 7 대까지 커버 할 수 있기 때문에 이러한 제한은 투여 량 반응 곡선의 경우에는 상대적으로 중요하지 않다. 그러나, 다른 취기가 테스트되는 스크리닝 실험의 경우에는, 일곱 배럴 피펫 한계를 표시 할 수있다. 실험을 스크리닝, 목표는 고아 OR 발현 표지 OSNs 대한 리간드를 찾는 것이다. 이 프로토콜을 사용하는 부 취제의 혼합물의 사용을 필요로 할 것이다. 반응을 유도 한 다음 각 혼합물을 개별 취기로 분할한다. 이것은 OSNs 16 표현 TAAR에 아민 냄새 물질을 선별하기 위해 이루어졌다. 이들 실험에서, 형광 뉴런 TAARs 표현과 리간드 UNK이었다nown. 프로토콜을 사용하여, 저자는 혼합물에 아민 냄새 물질의 수십 화면 수 있습니다. 반응을 유도 한 다음 혼합물은 가장 효율적인 리간드를 발견하기 위해 하나의 취기로 세분화 하였다.
기록 부위와 피펫 자극 사이의 거리가 셀 (20)의 기계적인 자극을 최소화하기 위해 현명하게 선택되어야한다. 압력 및 / 또는 (20 μm의 아래)가 너무 작은 거리 (30 우리의 기록 조건에서 PSI 이상)이 너무 높으면, 일부 OSNs의 기계적 응답도 응답 취제를 마스크 할 수있다. 피고 피펫과 기록 사이트 사이의 압력과 거리도 자극 동안 솔루션 교환을 제어하는 것이 중요하다. 신경 세포에 도달하는 농도는 이전 테스트 (13)의 일련의 피펫 농도 본 최대한 가까운 것으로 평가 하였다. 이 테스트 솔루션은 발병을 측정하는 파란색 염료로 착색 및 T의 오프셋 (offset) 사용그는 자극. 20 psi의 압력 및 30 ㎛의 거리를 사용하여, 자극의 강도는 최대 300 밀리 초 이내에 도달 하였다. 자극의 오프셋 (offset)는 조심스럽게 평가 하였다 : 준비 관류 솔루션의 지속적인 흐름에 따라이기 때문에, 자극이 0.8-0.9 초 (13) 내에서 세척 하였다.
OSNs의 속성을 코딩 냄새는 역사적으로 생체 내에서 세포 외 녹음을 통해 또는 분리 된 세포에 대한 실험을 통해 중 하나를 측정 하였다. 포유 동물에서 세포 외 녹음은 쥐 21 생체 내에서 처음 시행 하였다. 세포 외 기록에서, OR은 기록 세포에서 발현 따라서 시험 취제에 응답하는 셀을 찾을 성공률을 제한 알려지지 않았다. 프로토콜은 상피 세포의 환경에서 뉴런 기록 및 정의 수용체의 특성을 허용한다. 수용체의 속성 따라서 서로 다른 수준에서 분석 할 수 있습니다 : 특정 리간드전달 경로의 제 1 단계 동안 / 또는 상호 작용; 결과적으로, 작용제 / 시험 다양한 리간드의 상호 작용 안타고니스트; 혼합물의 정의 관찰 보고서의 통합 및 OSNs '특이성의 전달 경로의 역할의 특성; 상피 내의 (예 GAP 접합 등) 세포 간 상호 작용의 후각 코딩에 대한 영향; 최종적으로 전달 경로의 조절은 약리학 적 제제를 사용.
해리 된 세포 레코딩에서, 앞서 언급 한 바와 같이, 분리 공정은 점액과 후각 상피 내의 세포 간 상호 작용을 제거한다. 이 OSNs의 코딩 특성의 변화를 야기 할 수 있음. 분리 된 세포에 칼슘 이미징 실험을 자주보고되었다. 예를 들어, M71는 아세토 페논에 응답 OSNs 발현의 투여 량 - 반응 곡선 (7)에보고되었다. 이러한 용량 - 반응 곡선은 프로토콜을 사용하여 얻은 용량 - 반응 곡선보다 가파른 아르여기에 4 발표했다. 이러한 불일치 때문에 그대로 제조에서 세포 간 상호 작용과 같은 분리 된 세포에서 점액의 제거 일 수있다. 점액은 후각 전달 (22, 23)에 대한 기본적인 perireceptor 이벤트에 관련된 많은 단백질과 효소를 포함하는 것으로 알려져있다. 프로토콜은 여기에보고에서, 후각 상피의 구조의 보존과 점액의 존재는 추정 OSNs에 취제 코딩의 기본 기능을 유지하는 데 기여한다. 프로토콜에서 사용되는 농도는 몰 / L에 나타낸 통상 10-7 -3 -10 범위에있다. 이 농도는 공기 단계적으로 녹음 (중 로컬 필드 전위 또는 세포 외 녹음에)에 사용되는 농도보다 높다. 이러한 불일치는) 내가 때문일 수 (따라서) 자극의 레코딩의 액상 및 수도 II) 녹음하는 동안 재관류에 의한 점액의 느린 유실. MUC의 사실, 유실우리와 해부 동안 OSNs '축삭의 섹션을 제시 준비가 잠재적으로 "의사 그대로"보다는 "완전 그대로"준비로서 자격이 있음을 지원할 수있다. 이 혼합물은, 그러나, 가능한 생체 내에서에 가까운 아직 도출 촬영 조건 패치 클램프 녹음을 나타냅니다. 포유 동물 유기체에서 어떤 시험관 준비로, 생존 기간 한정으로 남아있다. 이 제한은 점액의 유실로 인해 수 있습니다, OSNs '축삭의 부분뿐만 아니라 준비 내의 혈액 순환의 부재.
여기에 제시된 프로토콜은 하나의 후각 감각 뉴런의 막 특성을 기록 할 수 있습니다. 이 기술은 막 OSNs의 특성, OSNs의 약리 연구, OSNs의 부 취제 코딩 특성의 조절 및 관찰 보고서의 deorphanization의 분석과 같은 여러 응용 프로그램을 사용할 수 있습니다. 칼슘 이미징 동안 기록 된 이벤트는 SLO된다W 및 오래 지속. 막 수준에서 후각 전달 경로의 빠른 이벤트에 대한 데이터를 본 프로토콜 리드 패치 클램프 녹음.
여기에 제시된 기록은 패치 클램프 구성에서 수행된다. 이 구성에서는 셀의 기록 막 특성은 후각 전달 경로 또는 기계 관련된 게이트 전압 전류인지, 분석 될 수있다. 이 프로토콜을 이용하여 실험 OSNs 특성 부호화 부 취제의 변조에 대한 데이터를 제공 할 수있다. 약리 제제는 상이한 조건에서 후각 전달을 조사하기 위해 사용될 수있다 : 예를 들어, MDL12330A, 아데 닐 레이트 사이 클라 제 III (ACIII) (24, 25)의 차단은 취제 답변 ACIII의 역할을 조사하기 위해 관류 용액에 적용될 수있다. 또한,이 프로토콜 <같은 후각 환경으로 코딩 특성이 서로 다른 조건에 변조 방법 후각 조사하는데 사용될 수있다SUP> 18 26 공급 동작에 관련된 호르몬의 영향. 마지막으로,이 프로토콜은 / 리간드 상호 작용과 정의 관찰 보고서에 또는 무작위로 선택된 수용체 27 작용제 / 길항제 활동을 해독 또는에 대한 데이터로 이어질 수 있습니다.
마지막으로, 7 배럴 자극 피펫에 의한 제한으로,이 프로토콜은 또한 deorphanizing 논리합을 위해 사용될 수있다. 이전에,이 경우에 언급 한 바와 같이, 여러 취제 혼합물을 시험 할 수있다. 반응을 유도 한 다음 혼합물을 다른 셀 테스트에서 개별 취기로 분할되어야한다.
정의 관찰 보고서를 표현 OSNs을 대상으로,이 프로토콜은 관찰 보고서, 리간드의 / 관찰 보고서의 상호 작용, 전달 경로 속성에 대한 강력한 데이터를 제공하고, 다른 조건에서 OSNs의 정의 인구의 특성을 비교.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| vibration table with Faraday cage | TMC | 63-500 SERIES | required : isolates the recording system from vibrations induced by the environment (movements of experimenter, vibrations of equipment such as fans for cooling computers, etc); can also be purchased with a Faraday cage, or equipped by a custom made Faraday cage; this cage is recommended to avoid electric noise from the environment |
| optics | |||
| microscope | Olympus | BX51WI | upright microcope equipped with epifluorescence; fixed or moving stage depending on the user's preference |
| objectives | Olympus | LUMPLFL40XW | at least 2 objectives required: a 4X or 10X for coarse approach to the cell; and a 40X immersion long distance example Olympus LUMPLFL40XW / IR /0,8 / WD:3.3 MM |
| magnifier | Olympus | U-TVCAC | ABSOLUTELY REQUIRED: placed in the light path between the objective and the camera; allows to magnify the image on the screen in order to reach precisely the knob with the recording electrode |
| camera | Olympus | DP72 | a good camera is required to see the neurons in fluorescence as well as in bright field; the controlling software is simple and allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell. An ultrasensitive camera is not necessary |
| filters | Olympus/Chroma | depending on the fluorescent protein used in the mice; example for GFP: excitation : BP460-490: emission: HQ530/50m | |
| amplifier | HEKA | EPC10 USB | monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the puffing by sending a TTL signal to the spritzer; the EPC10 setup is controled by computer |
| software | HEKA | Patchmaster | controls the amplifier during the experiment |
| micromanipulator | Sutter | MP225 | precision micromanipulator, allows precise movements down to 1/10th of a micrometer; this model is very stable; avoid hydraulic manipulators that may drift |
| electrode puller | Sutter | P97 | with a FT345-B wide trough filament; to prepare recording pipets of about 2µm diameter with a long tip to reach the cells; the resistance should be 15 to 20Mohm with perforated patch clamp solution |
| glass | Sutter | BF120-69-10 | in our recording conditions, this glass is ideal for recording pipets |
| recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | a chamber is needed to set the preparation under the microscope. To maintain the preparation in the center of the chamber, a net/anchor should be used. |
| stimulation | |||
| glass | WPI | TW100F-4 | attached in groups of 7, these pipettes are used to prepare prepulled stimulating pipettes |
| multibarrel puller | MDI | PMP-107-Z | by association of pull and twist, this puller allows us to prepare puffing electrodes with 7 barrels |
| precision pressure injector | Toohey Company | P/N T25-1-900 Single Channel | this precision pressure injector controls the pressure ejected in the multibarrel puller; it is controlled manually or by the amplifier by a 5V TTLs |
| micromanipulator | Narishige | YOU-1 | a coarse manipulator is enough to bring the puffing electrode close to the recording site |
| tubings | N/A | tygon tubing to bring the pressure from the puffer to the puffing pipette | |
| solutions/perfusion/chemicals | |||
| vacuum pump | gardner denver | 300 series | a vibrating membrane pump is more quiet and efficient than other types of pumps |
| perfusion system | N/A | N/A | gravity perfusion system with polyethlylen tubing to bring in and out the external solution from the recording chamber |
| nystatin | Sigma-Aldrich | N3503 | mandatory to perpare internal solution for perforated patch clamp |
| DIMETHYL SULFOXIDE | Sigma-Aldrich | D5879 | used to disolve nystatin for internal solution for perforated patch |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | extracellular solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | intracellular/extracellular solution |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | extracellular solution |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S9638 | extracellular solution |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4 7H2O) | Sigma-Aldrich | 63140 | extracellular solution |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | extracellular solution |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | extracellular solution |
| EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) | Sigma-Aldrich | E3889 | internal solution |
| Potassium hydroxyde | Sigma-Aldrich | P1767 | internal solution |
| Methyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | W387509 | intracellular solution |
| Hepes-Na | Sigma-Aldrich | H7006 | intracellular solution |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | intracellular solution |
References
- Lowe, G., Gold, G. H. Nonlinear amplification by calcium-dependent chloride channels in olfactory receptor cells. Nature. 366 (6452), 283-286 (1993).
- Ponissery Saidu, S., Dibattista, M., Matthews, H. R. Odorant-induced responses recorded from olfactory receptor neurons using the suction pipette technique. J Vis Exp. (62), e3862 (2012).
- Moss, R. L., et al. Electrophysiological and biochemical responses of mouse vomeronasal receptor cells to urine-derived compounds: possible mechanism of action. Chem Senses. 23 (4), 483-489 (1998).
- Kaur, A., Dey, S. Live cell calcium imaging of dissociated vomeronasal neurons. Methods Mol Biol. 1068, 189-200 (2013).
- Ma, M., Chen, W. R. Electrophysiological characterization of rat and mouse olfactory receptor neurons from an intact epithelial preparation. J Neurosci Methods. 92 (1-2), 31-40 (1999).
- Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C. Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system. J Neurosci. 22 (8), 3033-3043 (2002).
- Bozza, T., et al. Mapping of class I and class II odorant receptors to glomerular domains by two distinct types of olfactory sensory neurons in the mouse. Neuron. 61 (2), 220-233 (2009).
- Vassalli, A., Rothman, A., Feinstein, P., Zapotocky, M. Minigenes impart odorant receptor-specific axon guidance in the olfactory bulb. Neuron. 35 (4), 681-696 (2002).
- Feinstein, P., Bozza, T., Rodriguez, I., Vassalli, A. Axon guidance of mouse olfactory sensory neurons by odorant receptors and the beta2 adrenergic receptor. Cell. 117 (6), 833-846 (2004).
- Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat Rev Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).
- Grosmaitre, X., et al. SR1, a mouse odorant receptor with an unusually broad response profile. J Neurosci. 29 (46), 14545-14552 (2009).
- Grosmaitre, X., Vassalli, A., Mombaerts, P., Shepherd, G. M. Odorant responses of olfactory sensory neurons expressing the odorant receptor MOR23: a patch clamp analysis in gene-targeted mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (6), 1970-1975 (2006).
- Lam, R. S. Odorant responsiveness of embryonic mouse olfactory sensory neurons expressing the odorant receptors S1 or MOR23. Eur J Neurosci. 38 (2), 2210-2217 (2013).
- Zhang, J., Huang, G., Dewan, A., Feinstein, P. Uncoupling stimulus specificity and glomerular position in the mouse olfactory system. Mol Cell Neurosci. 51 (3-4), 79-88 (2012).
- Zhang, J., Pacifico, R., Cawley, D., Feinstein, P. Ultrasensitive detection of amines by a trace amine-associated receptor. J Neurosci. 33 (7), 3228-3239 (2013).
- Lee, A. C., Tian, H., Grosmaitre, X. Expression patterns of odorant receptors and response properties of olfactory sensory neurons in aged mice. Chem Senses. 34 (8), 695-703 (2009).
- Cadiou, H., et al. Postnatal odorant exposure induces peripheral olfactory plasticity at the cellular level. J Neurosci. 34 (14), 4857-4870 (2014).
- Mombaerts, P. Axonal wiring in the mouse olfactory system. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 713-737 (2006).
- Grosmaitre, X., Santarelli, L. C., Tan, J., Luo, M. Dual functions of mammalian olfactory sensory neurons as odor detectors and mechanical sensors. Nat Neurosci. 10 (3), 348-354 (2007).
- Duchamp-Viret, P., Chaput, M. A. Odor response properties of rat olfactory receptor neurons. Science. 284 (5423), 2171-2174 (1999).
- Heydel, J. M., et al. Odorant-binding proteins and xenobiotic metabolizing enzymes: implications in olfactory perireceptor events. Anat Rec (Hoboken). 296 (9), 1333-1345 (2013).
- Pelosi, P. Perireceptor events in olfaction). J Neurobiol. 30 (1), 3-19 (1996).
- Spehr, M., Wetzel, C. H., Hatt, H. 3-phosphoinositides modulate cyclic nucleotide signaling in olfactory receptor neurons. Neuron. 33, 731-739 (2002).
- Chen, S., Lane, A. P., Bock, R., Leinders-Zufall, T. Blocking adenylyl cyclase inhibits olfactory generator currents induced by 'IP(3)-odors. J Neurophysiol. 84 (1), 575-580 (2000).
- Savigner, A., et al. Modulation of spontaneous and odorant-evoked activity of rat olfactory sensory neurons by two anorectic peptides, insulin and leptin. J Neurophysiol. 101 (6), 2898-2906 (2009).
- Ukhanov, K., Brunert, D., Corey, E. A. Phosphoinositide 3-kinase-dependent antagonism in mammalian olfactory receptor neurons. J Neurosci. 31 (1), 273-280 (2011).
