Abstract
Analisando as respostas fisiológicas de neurônios olfatórios (OSN) quando estimulados com ligantes específicos é fundamental para compreender a base dos comportamentos olfativos-driven e sua modulação. Estas propriedades de codificação dependem muito da interação inicial entre as moléculas de odor e do receptor olfativo (OR) expressa nas ORS. A identidade, especificidade e ligando espectro da expressa ou são críticos. A probabilidade de encontrar o ligando do ou expresso em um OSN escolhido aleatoriamente dentro do epitélio é muito baixo. Para responder a este desafio, este protocolo utiliza ratinhos geneticamente marcadas que expressam a proteína fluorescente GFP sob o controlo do promotor de RUP definidos. ORS estão localizadas no epitélio apertado e organizada que reveste a cavidade nasal, com as células vizinhas influenciar a sua maturação e função. Aqui nós descrevemos um método para isolar um epitélio olfativo intacta e gravar através de gravações de patch-clamp as propriedades de ORS expressing receptores olfativos definidos. O protocolo permite que um para caracterizar as propriedades de membrana OSN, mantendo a influência do tecido vizinho. A análise dos resultados de patch-clamp produz uma quantificação precisa de ligando / ou interações, vias de transdução e farmacologia, propriedades de codificação 'ORS e sua modulação em nível da membrana.
Introduction
Neurônios olfatórios (OSN) representam o primeiro passo de percepção olfativa. Localizado no epitélio olfativo que reveste a cavidade nasal nos roedores, eles transformam a informação química dos odores em potenciais de ação enviadas através do seu axônio para o cérebro. Para compreender melhor os mecanismos de codificação olfativas, é necessário caracterizar as propriedades de transdução de membrana e de ORS. Até recentemente, a maioria das técnicas usadas para caracterizar as propriedades de ORS de mamífero foram realizadas em dissociado ORS 1-4. O processo de dissociação usa vários (ou seja, enzimas) processos mecânicos e químicos para libertar os ORS de seu ambiente. Estes processos induzem um baixo número de células disponíveis para as gravações. Este número baixo pode ser ainda mais crítica no caso de células GFP rotulados. Dissociação também remove as interações locais célula-a-célula entre ORS e outras células do epitélio olfactivo, que pode melhorar survival e modulação das propriedades "ORS. A fim de evitar o procedimento de dissociação, uma preparação intacta foi desenvolvido 5.
Cada OSN expressa um receptor olfativo (OR) seleccionados a partir de uma grande família multigene 6. Há ~ 1000 RUP expressos no epitélio olfatório principal no mouse. Devido ao grande número de, ou em animais de tipo selvagem, as possibilidades para gravar ORS que expressam o mesmo ou são muito baixos. Para superar estas limitações, os ratinhos alvo do gene estão disponíveis em todas as ORS que expressam um identificado ou estão marcados com uma proteína fluorescente 7-9. Estes ORS marcadas foram usadas para fazer análise funcional em preparações dissociadas 7,10,11 com os inconvenientes mencionados anteriormente. Uma preparação epitélio intacto 5 de camundongos geneticamente marcadas, portanto, contorna essas questões. Ele permite o monitoramento da atividade de ORS expressam RUP definidos com precisão em um ambiente tão perto no vivo possível. Além disso, gravações de patch-clamp de ORS também permitir uma análise precisa das propriedades da membrana, via de transdução de farmacologia, ligando / ou interações. Todos estes tópicos dificilmente podem ser analisadas usando gravações extracelular. Nós usamos essa técnica para monitorar as respostas dos ORS que expressam os receptores olfativos SR1 e MOR23 12,13. A viabilidade da técnica foi confirmada por outros grupos em MOR23 expressam ORS 14, bem como em outras RUP neurónios que expressam 15,16. O controlo de uma população definida de ORS pode levar à análise das suas propriedades em muitos contextos diferentes, tais como o desenvolvimento 14, 17 envelhecimento, odorante induzida plasticidade 18, e o papel de variações na sequência do receptor olfactivo, em odor de codificação 15. Este protocolo proporciona assim uma ferramenta poderosa para monitorizar as propriedades funcionais de ORS definidas ao nível da membrana.
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Protocol
Este protocolo segue as diretrizes de cuidados de animais da Université de Bourgogne e foi aprovado pelo comitê de ética Université de Bourgogne.
1. Os animais
- Use geneticamente camundongos OR-IRES-tauGFP disponíveis no Laboratório Jackson. Estes murganhos foram desenvolvidos no laboratório Dr. Peter Mombaerts ', a fim de analisar a segmentação do axónio e desenvolvimento do sistema olfactivo 19. Por exemplo, a linha MOR23-IRES-tauGFP, o número de ações 006.643, leva o nome oficial estirpe B6; 129P2- Olfr16 tm2Mom / MomJ; Da mesma forma, a linha SR1-IRES-tauGFP, número de estoque 6717 leva o nome oficial B6; 129P2- Olfr124 tm1Mom / MomJ.
- Em relação à idade dos animais: para um melhor resultado do protocolo, utilizar animais entre 2 e 4 semanas de idade. Nesta faixa etária, a dissecção é mais fácil (ossos mais macios, mais firme do epitélio olfatório) e os botões dendríticas são bigger comparar com animais mais velhos.
2. Preparação de eletrodos e Soluções
- Para as pipetas estimulantes: compra prepulled estimulando pipetas. Caso contrário, prepará-los manualmente.
- Usando uma chama, dobrar um milímetro seis pipetas de vidro em cerca de 1 cm da ponta. Insira estes seis pipetas além de uma linha reta 7 th em 1,5 centímetros de calor encolher tubulação fortalecer por um orifício.
- Calor encolher o tubo para manter os barris ligados juntos. Anexar um tubo de calor psiquiatra adicional para a outra extremidade dos barris. Puxe este pipeta estimulante, com um puxador de multi-barril.
- Adicione um pouco de cola líquida branca à volta do orifício para fortalecer as pontas dobradas. Deixe secar O / N.
- Prepare 1 ou 2 L de solução de Ringer extracelular normal (em mM: NaCl 124, KCl 3, MgSO4 1,3, CaCl2 2, NaHCO3 26, NaH 2 PO 4 1,25, glicose 15; pH 7,6 e 305 mOsm). Mantenha a 4 ° Caté à sua utilização.
- Preparar a solução estoque intracelular (em mM): KCl 70, KOH 53, ácido metanossulfónico 30, EGTA 5, HEPES 10, 70 sacarose; pH 7,2 (KOH) e 310 mOsm. Manter a 4 ° C até à sua utilização. Bom para várias semanas.
- Preparar a solução intracelular de gravação com nistatina extemporaneamente (no último minuto) antes de experimento.
- Pesar 3 mg de nistatina, adicionar 50 ul de DMSO; vortex 20 seg depois sonicar 2-3 minutos até completamente diluída.
- Adicionar 20 ul de solução de DMSO-de nistatina em 5 ml de solução de reserva intracelular. Vortex 20 seg, depois sonicar 3 min. Conservar esta solução a 4 ° C e proteger da luz direta, nistatina é sensível à luz. Esta solução pode ser utilizada por algumas horas. Substituir todos os dias.
- Uma vez que a preparação epitélio olfativo é sob o microscópio, tirar um pouco dessa solução em uma seringa de 1 ml com uma ponta amarela alongado-chama para preencher os eletrodos; proteger da luz direta. Uma vez que, à TA, a solução nistatinanão é estável; substituir a solução na seringa de 1 mL a cada hora ou mantê-lo em gelo.
- Puxe eléctrodos de registo com um puxador de obter longo pescoço e uma pequena ponta (~ 2 mm) com uma resistência de 15-20 mohms com a solução de nistatina interno.
- Preparar a solução odorante em 0,5 M em DMSO sob exaustor; aliquota e manter a -20 ° C até à sua utilização. Diluir odorante em solução de Ringer, até à concentração desejada. Encha a pipeta estimulante.
3. Preparação de epitélio olfatório
Nota: os ratos OR-IRES-tauGFP expressar o tauGFP sob o controlo do promotor OU. Nesses camundongos, todos os neurônios que expressam o OR de interesse são marcadas com GFP. Este protocolo é adaptado para as RUP expressos em todas as zonas. No entanto, dissecções e gravações são mais fáceis para as RUP expressas na zona dorsal.
- Anestesiar os animais por injecção de uma mistura de cetamina e xilazina (150 mg / kg e 10 mg / kg BODy de peso, respectivamente). Decapitação pode ser realizada com uma tesoura afiada para ratos jovens ou com uma guilhotina roedor mantido adequadamente para ratos mais velhos.
- Usando anel tesouras de dissecção fazer uma incisão medial longitudinal através da pele dorsal. Retire a pele, puxando-o para além. Usando a tesoura, corte as mandíbulas inferiores na articulação da mandíbula. Remover os dentes frontais superiores por um corte coronal paralelo aos dentes.
- Faça um corte coronal da cabeça atrás dos olhos e manter apenas a parte anterior da cabeça. Mergulhá-lo em solução de Ringer gelada para a dissecação sob o âmbito de aplicação.
- Dissecar no âmbito: no lado ventral, faça um corte longitudinal ao longo do maxilar superior / os dentes. Cortar os ossos dorsais longitudinalmente, seguindo o lado dorso-lateral da cavidade nasal. Remover a maioria dos ossos e paladar; transferir o septo e o epitélio ligado a ele em oxigenado Ringer a RT.
- Para a dissecção final: Logo antes de iniciar a gravaçãosessão, descascar o epitélio do septo subjacente com uma pinça. Retire o epitélio com uma pinça e com dois cortes 4-5 mm de tesoura (uso microvannas tesoura) na parte anterior do septo onde a adesão é mais forte.
- Retire cuidadosamente o órgão vomeronasal, cortando-a ao longo da sua ligação ao epitélio dorsal do septo. Transferir o epitélio para uma câmara de registo com a camada da mucosa voltada para cima; mantê-lo liso na câmara com uma harpa.
- Câmara de instalar sob um microscópio vertical equipado com óptica de fluorescência e uma câmera sensível. Visualize a preparação na tela do computador com alta ampliação de 40X através de um objetivo de imersão em água (abertura numérica 0,8) e uma ampliação de 2X ou 4X adicional conseguido por uma lente de aumento. Perfundir continuamente oxigenado com Ringer a RT (1-2 mL / min).
4. A gravação da sessão
- Procurar célula fluorescente: excitar a preparação em 480nm para EGFP, que emite luz no intervalo de 530-550 nm; alvo um botão dendrítica que é fiável visível na fluorescência e sob campo claro.
- Preencha eléctrodo com solução intracelular com nistatina; remover as bolhas batendo suavemente sobre o eletrodo.
- Insira eletrodo no suporte do eléctrodo, aplique pressão positiva na pipeta; A resistência deve ser de 15-20 mohms.
- Traga eletrodo perto do celular; uma vez que a resistência atinge ~ 40 mohms, libere pressão positiva e aplicar uma ligeira pressão negativa para chegar a um gigaseal.
- Uma vez que o selo é atingido, definir o potencial de membrana a cerca de -75 mV;
- Uma vez que a célula se abre, prosseguir com protocolos de estimulação, tratamentos farmacológicos. Para medir a resposta a uma única estimulação odorante, 200-500 ms ficha de actividade espontânea, para estimular a 500 ms e medir a resposta da célula para até 10 seg 13. Para tratamentos farmacológicos, perfundir os agentes farmacológicos naa concentração desejada de 20.
Análise 5. Dados
- Analisar as correntes induzidas por estimulação odorante como se segue: a amplitude máxima, o tempo de subida (tempo necessário para atingir 90% da amplitude máxima, em mseg), a corrente total (área sob a curva em Pas), a hora a 50% (tempo entre o início e o deslocamento da resposta a 50% da amplitude máxima, em mseg).
- Usando as correntes de pico de transdução (amplitude máxima atingida), em diferentes concentrações, desenhar e ajustar uma curva de resposta à dose utilizando a equação de Hill: Imax = I / (1 + (K 1/2 / C) n), em que I representa a corrente de pico , Imax a resposta máxima nas concentrações saturantes, K1 / 2 a concentração para a qual metade da resposta máxima foi alcançada, C a concentração do odorante e n o coeficiente de Hill.
- Analisar gravações de potencial de membrana em pinça de corrente para a despolarização máxima, o total potencial provocada (área sob a curva em mVsec); registro de atividade spiking espontânea longo de 30 s para um mínimo de gravações; excitabilidade registro através picos gerado pela injeção de correntes (10/05 PA).
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Representative Results
O resultado deste protocolo depende da qualidade da dissecção. A dissecção passos deve ser curto (menos do que 10 a 15 min) e preciso (isto é, para evitar danos do epitélio). A figura 1 ilustra como uma preparação ideal parece em diferentes níveis de ampliação. Numa ampliação baixa sob condições de campo brilhante os diferentes tipos de células (tais como botões de células ORS, apoiando) são distinguíveis (Figura 1A). Ao mais alto nível de ampliação, normalmente 80X a 160X, em campo claro, os botões dendríticas dos ORS deve ser claramente distinguíveis das células de suporte (Figura 1B). Sob luz fluorescente, apenas os botões dendríticas e as células de cílios GFP marcado são visíveis (Figura 1C). Ao comparar as duas imagens, as células marcadas podem ser abordados com a pipeta de gravação (Figura 1D).
A temperatura da dissecção assimlução e ao momento da dissecção são críticos. A primeira parte da dissecção, a preparação do septo (seção 3.1.1 para 3.2) deve ocorrer dentro de 5 a 10 minutos em solução gelada. A dissecção final (3.3) deverá durar menos de 5 minutos à temperatura ambiente. No caso de a dissecção durou durante demasiado tempo, ou em solução foi realizada dissecção muito quente, a preparação invariavelmente parece rapidamente danificado: botões dendríticas são flutuantes acima da superfície do epitélio, e assemelham-se as células mortas.
Uma vez que o selo é alcançado e a célula se abre sob o efeito da nistatina, correntes típicos dependentes da voltagem pode ser observado (Figura 2A). A forma e as características destas correntes podem ser utilizados para monitorizar a saúde da célula: em uma célula a morrer ou se a qualidade do selo está a diminuir, a amplitude destas correntes irá diminuir. Sob a configuração atual da braçadeira, potenciais de ação podem ser gravadas quer espontaneamente (Figura 2B) ou por injecção de uma corrente de despolarização (Figura 2C). As propriedades de queima induzidas pela injecção de corrente de caracterizar a excitabilidade de neurónio gravado. A excitabilidade da população de diferentes ORS pode ser comparado (por meio de freqüência clássica e cálculos ISI).
Uma pipeta multibarrel carregado com diferentes odorantes e / ou concentrações diferentes de odores pode ser usado para estimular as células por ejecção da pressão. Isto permite medir as respostas olfactivos induzido. Os odorantes e concentração deve ser escolhido dependendo do ou expressa na célula de interesse, por exemplo Lyral é o ligando para MOR23, acetofenona para M71, eugenol para mOREG. Na experiência ilustrada na Figura 3, os neurónios MOR23-IRES-tauEGFP gravados respondeu a diferentes concentrações de Lyral, um ligando para MOR23, no modo de fixação de corrente (Figura 3A) ou no modo de fixação de tensão (Figure 3B). Em gravações em modo braçadeira de tensão, características diferentes pode ser monitorado para quantificar a resposta (amplitude máxima, subir a tempo, corrente total suscitou, etc.) Como classicamente realizado em eletrofisiologia. Usando a amplitude máxima da resposta induzida por odorante, dose-resposta podem ser traçados e ajustada utilizando a equação de Hill. Estes resultados fornecem informações sobre as propriedades de codificação de cada OSN: limiar de detecção, dinâmicas temporais, faixa dinâmica e nível de saturação. Exemplos de curvas de dose-resposta estão apresentados na Figura 3C. Todos estes detalhes podem ser comparados entre ORS individuais para medir potencial heterogeneidade dentro de uma população; Eles também podem ser comparados entre ORS com ou sem aplicação de um tratamento para medir potencial de modulação e plasticidade.
Figura 1: Imagens representativas de uma preparação saudável (A) epitélio olfactivo Intacto extraído a partir da cavidade nasal de um ratinho transgénico SR1-IRES-tauGFP observado sob condições de campo brilhante com a ampliação de 40X.. OSN botões dendríticas (cabeças de seta preta) são colocados em uma malha de células de suporte (SC) e glândulas Bowman (BG). (B) botões de SR1 dendríticas expressando ORS observados em condição de campo brilhante (cabeças de seta branca e vermelha). (C) O mesmo campo como em (B) sob luz fluorescente mostrando maçanetas dendríticas de SR1 expressam ORS. (D) pipeta de gravação se aproximando de uma OSN-expressando SR1 em campo brilhante. A seta vermelha representa o mesmo SR1 OSN em (B - D). Barra de escala: 5 um.
Figura 2: Representante propriedades da membrana resultados obtidos com o protocolo:. Gravações de patch-clamp na maçaneta dendrítica de um SR1-IRES-tauGFP OSN correntes dependentes da voltagem (A) induzidos pelo aumento etapas de despolarização da membrana potencial -67 mV para +40 mV. (B) A atividade espontânea gravado na configuração pinça de corrente; potenciais de ação pode ser observada durante a gravação época 15 seg. (C) Os potenciais de acção induzidos por uma corrente excitatória 7 pA; este protocolo fornece informações sobre a excitabilidade da célula.
Figura 3:. Exemplos representativos de respostas olfactivos induzida em um neurónio MOR23-IRES-tauEGFP concentrações crescentes de Lyral, um ligando do receptor MOR23, induzir o aumento das respostas tanto na pinça de corrente (A) e em fixador de tensão (B). O potencial de membrana foi fixada em -67 mV. (C) Os exemplos de curvas de dose-resposta individuais adquiridos em três neurónios M71 em resposta a concentrações crescentes de acetofenona e equipados com a equação de Hill.
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Discussion
A capacidade deste protocolo para monitorar corretamente as propriedades de ORS saudáveis depende muito da qualidade da preparação. Por conseguinte, os passos de dissecação são críticos. Em primeiro lugar, é fundamental prestar atenção à qualidade (pH, osmolaridade), oxigenação e temperatura (gelo-frio, mas não congelado) do meio de dissecção. Em segundo lugar, a manipulação do epitélio com ferramentas de dissecação deve ser tão limitada quanto possível, para evitar danos. Finalmente, é essencial para se obter uma preparação tão plana quanto possível, a fim de aceder a maior população OSN quanto possível.
A qualidade dissecção é fundamental para se obter uma preparação saudável. No entanto, diferentes abordagens podem ser utilizadas para a dissecção: aqui apresentamos um ventral para dorsal dissecção mas alguns utilizadores podem preferir iniciar a dissecção dorsalmente para abrir a cavidade nasal rapidamente e têm um rápido acesso ao recesso do septo do epitélio olfactivo. Cada usuário pode, portanto, adaptar o protocol para a estratégia mais eficiente para alcançar uma preparação saudável da área de interesse.
Uma vez que a preparação está sob o microscópio, é necessário um controlo permanente da saúde da preparação. De fato, uma preparação saudável leva a uma baixa probabilidade de chegar a um gigaseal. A baixa eficiência na obtenção gigaseals pode ser melhorado alterando a área de interesse na preparação, a fim de encontrar ORS saudáveis. Uma solução é mais drástica para substituir a preparação inteiramente por um novo. Uma vez que o selo é atingido, uma baixa probabilidade de atingir o estado "aberta" pode ter lugar. Isto pode ser devido à qualidade da solução interna. A solução interna tem de ser preparadas pouco tempo antes da experiência. O uso de vórtice e sonicação são críticos desde que a solubilidade de nistatina é bastante baixo. Para melhorar a probabilidade de abertura, a solução interna deve ser novamente agitada em vórtice durante 10 seg e em seguida sonicada durante 30 a 60 segundos. Este usualiado melhora a eficiência da abertura de células.
Para estimular a OSN gravado com odorants, o protocolo apresentada utiliza uma pipeta estimulante 7 barril. Este tipo de pipeta implica uma limitação no número de odores e / ou concentração de substâncias odoríferas testado em células gravadas para cada um de sete. Esta limitação não é relativamente significativa, no caso de uma curva dose-resposta, uma vez que podem cobrir até 7 unidades log da concentração. No entanto, no caso das experiências de rastreio, em que diferentes odorantes são testadas, uma pipeta de sete tambor pode apresentar limitações. Na triagem experimentos, o objetivo é encontrar um ligando para ORS marcadas que expressam um órfão OR. Usando este protocolo irá requerer a utilização de misturas de odores. Cada mistura de desencadear uma resposta será, em seguida, dividido em odorantes individuais. Isso foi feito para a tela Fragrância de amina em Taar expressar ORS 16. Nestas experiências, os neurónios fluorescentes expressa Taars e o ligando foi unknown. Usando o protocolo, os autores poderia rastreio de várias dezenas de odores de amina em misturas. As misturas que desencadeiem uma resposta foram então divididos para odorants individuais, a fim de encontrar o ligando mais eficiente.
A distância entre o local de gravação e a pipeta estimulante devem ser escolhidos criteriosamente a fim de minimizar a estimulação mecânica da célula 20. Se a pressão for demasiado elevada (acima de 30 psi nas nossas condições de gravação) e / ou a distância muito pequena (inferior a 20 um), a resposta mecânica em alguns ORS podem mesmo mascarar a resposta odorante. Pressão e distância entre a pipeta de sopro e o local de gravação também são críticos para controlar o câmbio solução durante a estimulação. A concentração alcançar o neurónio foi previamente avaliada para estar tão perto quanto possível a concentração presente na pipeta através de uma série de testes de 13. Estes testes usaram uma solução colorida com corante azul para determinar o início eo deslocamento de tele estimulação. Usando 20 psi de pressão e 30 mm distância, a intensidade máxima do estímulo foi alcançado dentro de 300 ms. O deslocamento do estímulo também foi cuidadosamente avaliada: dado que a preparação está sob o fluxo contínuo da solução de perfusão, o estímulo foi lavada para fora dentro de 0,8 a 0,9, 13 seg.
O odor de codificação propriedades de ORS foram medidos historicamente através de gravações extracelular in vivo ou através de experimentos em células isoladas. Nos mamíferos, as gravações extracelulares foram realizadas a primeira in vivo em ratos 21. Em gravações extracelulares, o ou expresso na célula gravado é desconhecido limitando assim a taxa de sucesso para encontrar uma célula para responder a odorante testado. O protocolo permite o registo e caracterização dos receptores definidos em neurónios no ambiente celular do epitélio. Propriedades dos receptores pode, por conseguinte, ser analisadas em diferentes níveis: o ligando específico/ OU interacções durante o primeiro passo da via de transdução; consequentemente, o agonista / antagonista de diversas interações ligandos testados; as propriedades de integração misturas de RUP definidos e o papel da via de transdução de especificidade 'ORS; a influência sobre a codificação olfactivo de célula-a-célula interacções (tais como junções de hiato) dentro do epitélio; e, finalmente, a modulação da via de transdução usando agentes farmacológicos.
Nos gravações de células dissociadas, como mencionado anteriormente, o processo de dissociação remove o muco e as interacções célula-a-célula dentro do epitélio olfactivo. Isto pode induzir mudanças nas propriedades de codificação das ORS. Experimentos com imagens de cálcio em células isoladas foram freqüentemente relatados. Por exemplo, as curvas dose-resposta de M71 expressando ORS em resposta a acetofenona foram relatados 7. Estas curvas de dose-resposta estão mais íngreme do que as curvas de dose-resposta obtidas utilizando o protocoloaqui apresentado 4. Estas discrepâncias podem ser devido às interacções célula-célula na preparação intacto e também para a remoção de muco em células isoladas. O muco é conhecido por conter muitas proteínas e enzimas envolvidas em eventos perireceptor fundamentais para a transdução olfactivo 22,23. No protocolo relatado aqui, a manutenção da estrutura do epitélio olfactivo putativo e a presença do muco contribui para preservar as características nativas de codificação odorante no ORS. As concentrações utilizadas no protocolo estão indicados em mol / L e, geralmente, estão na gama de 10 -3 -10 -7. Estas concentrações são mais elevadas do que as concentrações usadas nas gravações faseada ao ar (ou no potencial de campo local ou gravações extracelular). Estas discrepâncias podem ser devidos a: i) a fase líquida das gravações (e, portanto, da estimulação) e ii) a lavagem lenta do muco pela perfusão durante gravações. De facto, a lavagem das MUCnós ea seção de axônios dos ORS durante a dissecção pode apoiar que a preparação apresentado potencialmente ser qualificado como um "pseudo-intacta" ao invés de uma preparação "totalmente intacta". Esta preparação representa, no entanto, condições de gravação como perto de in vivo quanto possível e ainda provocando gravações de patch-clamp. Como qualquer preparação in vitro a partir de um organismo de mamífero, a sobrevivência permanece limitado no tempo. Este limite pode ser devido à lavagem do muco, a secção de axónios 'ORS, bem como a ausência de circulação do sangue no interior da preparação.
O protocolo aqui apresentado permite gravar propriedades da membrana dos neurônios sensoriais olfativos. Esta técnica pode ter várias aplicações, tais como análise de propriedades da membrana de ORS, investigações farmacológicas de ORS, a modulação das propriedades de codificação olfativos de ORS e deorphanization das RUP. Os eventos registrados durante o exame de cálcio são slow e de longa duração. Gravações de patch-clamp no presente protocolo liderança para dados sobre eventos rápidos na via de transdução olfatória em nível de membrana.
As gravações aqui apresentados são realizadas na configuração de patch-clamp. Nesta configuração, as propriedades da membrana da célula gravado pode ser analisada, se é a via de transdução de máquinas olfactiva ou as correntes dependentes da voltagem envolvidos. Experiências usando este protocolo pode fornecer dados sobre a modulação do odorante codificação propriedades de ORS. Os agentes farmacológicos podem ser usados para investigar a transdução olfactiva em diferentes condições: por exemplo, MDL12330A, um bloqueador de adenilato ciclase III (ACIII) 24,25 pode ser aplicado na solução de perfusão para investigar o papel de ACIII numa resposta odorante. Além disso, este protocolo pode ser utilizado para investigar como as propriedades de codificação olfactivo são modulados em diferentes condições, tais como o ambiente olfactivo <sup> 18 ou sob a influência de hormônios envolvidos em comportamentos alimentares 26. Finalmente, este protocolo também pode levar a dados sobre OU interação e decifrar agonistas / antagonistas atividades no RUP definidos ou mesmo em receptores escolhidos aleatoriamente 27 / ligando.
Finalmente, com as limitações devido à pipeta estimulante 7 barril, esse protocolo também pode ser usado para deorphanizing RUP. Como mencionado anteriormente, neste caso, várias misturas de odores pode ser testado. Misturas que desencadeiem uma resposta deve então ser dividido em odorants individuais testados em outras células.
Ao direcionar ORS expressar RUP definidos, este protocolo fornece dados poderosas sobre as RUP, ligantes / RUP interações, via de transdução de propriedades e comparar as propriedades de populações definidas de ORS em diferentes condições.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| vibration table with Faraday cage | TMC | 63-500 SERIES | required : isolates the recording system from vibrations induced by the environment (movements of experimenter, vibrations of equipment such as fans for cooling computers, etc); can also be purchased with a Faraday cage, or equipped by a custom made Faraday cage; this cage is recommended to avoid electric noise from the environment |
| optics | |||
| microscope | Olympus | BX51WI | upright microcope equipped with epifluorescence; fixed or moving stage depending on the user's preference |
| objectives | Olympus | LUMPLFL40XW | at least 2 objectives required: a 4X or 10X for coarse approach to the cell; and a 40X immersion long distance example Olympus LUMPLFL40XW / IR /0,8 / WD:3.3 MM |
| magnifier | Olympus | U-TVCAC | ABSOLUTELY REQUIRED: placed in the light path between the objective and the camera; allows to magnify the image on the screen in order to reach precisely the knob with the recording electrode |
| camera | Olympus | DP72 | a good camera is required to see the neurons in fluorescence as well as in bright field; the controlling software is simple and allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell. An ultrasensitive camera is not necessary |
| filters | Olympus/Chroma | depending on the fluorescent protein used in the mice; example for GFP: excitation : BP460-490: emission: HQ530/50m | |
| amplifier | HEKA | EPC10 USB | monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the puffing by sending a TTL signal to the spritzer; the EPC10 setup is controled by computer |
| software | HEKA | Patchmaster | controls the amplifier during the experiment |
| micromanipulator | Sutter | MP225 | precision micromanipulator, allows precise movements down to 1/10th of a micrometer; this model is very stable; avoid hydraulic manipulators that may drift |
| electrode puller | Sutter | P97 | with a FT345-B wide trough filament; to prepare recording pipets of about 2µm diameter with a long tip to reach the cells; the resistance should be 15 to 20Mohm with perforated patch clamp solution |
| glass | Sutter | BF120-69-10 | in our recording conditions, this glass is ideal for recording pipets |
| recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | a chamber is needed to set the preparation under the microscope. To maintain the preparation in the center of the chamber, a net/anchor should be used. |
| stimulation | |||
| glass | WPI | TW100F-4 | attached in groups of 7, these pipettes are used to prepare prepulled stimulating pipettes |
| multibarrel puller | MDI | PMP-107-Z | by association of pull and twist, this puller allows us to prepare puffing electrodes with 7 barrels |
| precision pressure injector | Toohey Company | P/N T25-1-900 Single Channel | this precision pressure injector controls the pressure ejected in the multibarrel puller; it is controlled manually or by the amplifier by a 5V TTLs |
| micromanipulator | Narishige | YOU-1 | a coarse manipulator is enough to bring the puffing electrode close to the recording site |
| tubings | N/A | tygon tubing to bring the pressure from the puffer to the puffing pipette | |
| solutions/perfusion/chemicals | |||
| vacuum pump | gardner denver | 300 series | a vibrating membrane pump is more quiet and efficient than other types of pumps |
| perfusion system | N/A | N/A | gravity perfusion system with polyethlylen tubing to bring in and out the external solution from the recording chamber |
| nystatin | Sigma-Aldrich | N3503 | mandatory to perpare internal solution for perforated patch clamp |
| DIMETHYL SULFOXIDE | Sigma-Aldrich | D5879 | used to disolve nystatin for internal solution for perforated patch |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | extracellular solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | intracellular/extracellular solution |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | extracellular solution |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S9638 | extracellular solution |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4 7H2O) | Sigma-Aldrich | 63140 | extracellular solution |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | extracellular solution |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | extracellular solution |
| EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) | Sigma-Aldrich | E3889 | internal solution |
| Potassium hydroxyde | Sigma-Aldrich | P1767 | internal solution |
| Methyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | W387509 | intracellular solution |
| Hepes-Na | Sigma-Aldrich | H7006 | intracellular solution |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | intracellular solution |
References
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