Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Bozulmamış neuroepithelium Fare Koku Duyu Nöronlar Delikli Patch-kelepçe Kayıt: Bir Belirlenen Odorant Reseptör ifade Nöronlar Fonksiyonel Analiz

doi: 10.3791/52652 Published: July 13, 2015

Abstract

Özel bağ ile uyarıldıkları zaman koku duyu nöronlarının fizyolojik tepkilerini (OSN) analiz koku tahrikli davranışları ve modülasyon temelini anlamak önemlidir. Bu kodlama özellikleri koku molekülleri ve koku reseptörü (OR) arasındaki ilk etkileşim ağır bağımlı OSNs olarak ifade edilmiştir. ifade YA kritik kimliği, özgünlüğü ve ligand spektrumu. OR ligandı bulmak için olasılık epitel içinde rastgele seçilen bir OSN çok düşüktür dile getirdi. Bu sorunu çözmek için, bu protokol, genetik olarak tanımlanmış ORs promoterinin kontrolü altında floresan protein GFP ifade isim levhası fareler kullanır. OSNs komşu hücrelerin olgunlaşması ve fonksiyonu etkileyen ile burun boşluğuna astar sıkı ve organize epitel yer almaktadır. Burada OSNs e özelliklerini sağlam bir koku epiteli izole ve patch-kelepçe kayıtları ile kaydetmek için bir yöntem tariftanımlanan koku reseptörü xpressing. protokol komşu dokuya etkisi tutarken tek OSN membran özelliklerini karakterize sağlar. Patch-kelepçe sonuçlarının analizi ligand / VEYA etkileşimleri, iletim yollarının ve farmakoloji, OSNs 'kodlama özellikleri ve membran düzeyde modülasyon kesin miktarının verir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Koku alma duyu nöronları (OSN) koku algı ilk adımı temsil etmektedir. Kemirgenlerde burun boşluğunu çevreleyen koku epiteli bulunan beyinle kendi akson yoluyla gönderilen aksiyon potansiyelleri içine koku kimyasal bilgi dönüşümü. Daha iyi koku kodlama mekanizmaları anlamak için, OSNs iletimi ve membran özelliklerini karakterize etmek gereklidir. Yakın zamana kadar, memeli OSNs özelliklerini karakterize etmek için kullanılan teknikler çok ayrışmış OSNs 1-4 üzerinde gerçekleştirilmiştir. ayrışma süreci çevrelerinden OSNs boşaltmak için çeşitli mekanik ve kimyasal (yani enzimler) süreçleri kullanır. Bu işlemler, kayıtlar için uygun bir hücre, düşük uyarmaktadır. Bu az sayıda GFP etiketli hücrelerin durumunda daha da kritik öneme sahip olabilir. Aynşması da OSNs ve Surviv artırabilir koku epitel başka hücreler arasındaki yerel hücre-hücre etkileşimleri ortadan kaldırırEl ve OSNs 'özelliklerinin modülasyonu. Ayrışma işlemini atlamak için, sağlam bir preparat 5 geliştirilmiştir.

Her OSN büyük bir çoklu gen ailesi 6 arasından seçildiği (OR), bir koku reseptörü ifade eder. Fare ana koku epiteli olarak ifade 1,000 OR ~ vardır. Nedeniyle vahşi tip hayvanlarda OR çok sayıda, büyük ihtimalle aynı ifade OSNs kayıt YA çok düşük etmek. Bu sınırlamaları aşmak için, gen hedeflenen fareler mevcut olduğu bir tespit VEYA floresan proteini 7-9 ile etiketlenmiş ifade tüm OSNs. Bu etiketli OSNs ayrışmış hazırlıkları Daha önce de belirttiğimiz sakıncaları ile 7,10,11 fonksiyonel analiz yapmak için kullanıldı. Genetik etiketli farelerden alınan sağlam bir epitel hazırlık 5 Dolayısıyla bu sorunları circumvents. Vi yakın olarak bir ortamda tam olarak tanımlanmış ORs ifade OSNs aktivitesi izlenmesine olanak sağlarmümkün olduğunca vo. Ayrıca, OSNs patch-kelepçe kayıtları da zar özellikleri, iletim yolu farmakoloji, ligand / VEYA etkileşimlerinin hassas analiz sağlar. Bütün bu konular pek dışı kayıtları kullanılarak analiz edilebilir. Biz koku reseptörü SR1 ve MOR23 12,13 ifade OSNs yanıtları izlemek için bu tekniği kullanılır. teknik fizibilite nöronlar 15,16 ifade OSNs 14 eksprese eden MOR23 üzerinde diğer gruplar yanı sıra, diğer ORs ile teyit edilmiştir. OSNs tanımlanmış bir nüfus izleme 17 yaşlanma, böyle bir gelişme 14 gibi pek çok farklı bağlamlarda özelliklerinin analizi yol açabilir, odorant indüklenen plastisite 18 ve 15 kodlama koku odorant reseptörün dizilimindeki rolü. Bu protokol, böylece zar düzeyinde tanımlanan OSNs fonksiyonel özelliklerini izlemek için güçlü bir araç sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu protokol Université de Bourgogne hayvan bakım kuralları takip ve Université de Bourgogne etik kurul tarafından onaylandı.

1. Hayvanlar

  1. Jackson Laboratuvarı'nda mevcut genetik olarak OR-IRES-tauGFP fareler kullanın. Bu fareler koku alma sisteminin 19 akson hedefleme ve gelişimini analiz etmek için Dr. Peter Mombaerts 'laboratuvarda geliştirilmiştir. Örneğin, MOR23-IRES-tauGFP hattı, stok numarası 006643, resmi gerilme adı B6 taşır; 129P2- Olfr16 tm2Mom / MomJ; Benzer şekilde, SR1-IRES-tauGFP hattı, stok numarası 6717 resmi adı B6 taşır; 129P2- Olfr124 tm1Mom / MomJ.
  2. Hayvanların yaşı ile ilgili olarak: protokolünün daha iyi bir sonuç için, yaş 2 ve 4 hafta arasında hayvanları kullanın. Bu yaş grubunda, diseksiyon daha kolay (yumuşak kemikler, sıkı koku epiteli) ve dendritik topuzlar bi olmasıdırgger yaşlı hayvanlarda karşılaştırın.

Elektrotlar ve Çözümleri 2. Hazırlık

  1. Uyarıcı pipetler için: Satın alma pipetler uyarıcı prepulled. Aksi takdirde, elle onları hazırlamak.
    1. Bir alevi kullanarak, ucundan yaklaşık 1 cm altı 1 mm cam pipetler bükün. Bir delikten tarafından güçlendirmek 1,5 cm ısıyla daralan boru bu altı pipetler artı düz 7 inci takın.
    2. Isı birlikte ekli varil korumak için boru küçültmek. Varil diğer ucuna ek bir ısı shrink boru takın. Çok varil çektirmesi ile bu uyarıcı pipet çekin.
    3. Bükülmüş ipuçları güçlendirmek için deliğinden etrafında bazı beyaz sıvı tutkal ekleyin. Kuru O / N edelim.
  2. Normal Ringer hücre dışı solüsyon, 1 veya 2 L hazırlayın (mM olarak: NaCl 124, KCI 3, MgSO 4 1.3, CaCl2 2, NaHCO 3 26 NaH 2 PO 4 1.25, glükoz 15; pH 7.6, 305 mOsm). 4 ° C'de tutunkullanılıncaya kadar.
  3. (MM olarak) hücre içi bir stok çözelti hazırlayın: KCI 70, KOH 53, metansülfonik asit, 30 EGTA 5, HEPES 10, sukroz 70; pH 7.2 (KOH) ve 310 mOsm. Kullanılana kadar 4 ° C 'de muhafaza edin. Birkaç hafta için iyi.
  4. Deneyden önce (son dakikada) ekstemporane nystatin ile hücre içi kayıt çözeltisi hazırlayın.
    1. DMSO 50 ul ekleyin, nistatin 3 mg tartılır; tamamen seyreltilmiş kadar vorteks 20 sn sonra 2-3 dakika sonikasyon.
    2. Hücre içi stok çözeltisi, 5 ml DMSO-nistatin çözeltisi 20 ul ekle. Vortex 20 sn, daha sonra 3 dakika sonikasyon. 4 ° C 'de, bu çözüm tutun ve doğrudan ışıktan korumak, nistatin ışığa duyarlıdır. Bu çözelti, birkaç saat süre ile kullanılabilir. Her gün değiştirin.
    3. Koku epiteli hazırlık mikroskop altında sonra, elektrotlar doldurmak için bir alev uzatılmış sarı ucu ile 1 ml şırınga içinde bu çözümün bir kısmını almak; Doğrudan ışıktan korumak. Oda sıcaklığında, nistatin çözelti bir kezsabit değildir; her saat şırınga veya buz tutmak ml, 1 çözüm değiştirin.
  5. İç nystatin çözeltisi ile 15-20 M? Bir direnç ile uzun boyun ve küçük bir ipucu (~ 2 mikron) elde etmek için bir çektirmenin ile kayıt elektrotları çekin.
  6. Davlumbaz altında DMSO içinde 0.5 M de odorant çözeltisi hazırlayın; eş-payı ve kullanılana kadar -20 ° C'de saklayın. Istenen konsantrasyona kadar, Ringer çözeltisi içinde Deodorantını seyreltin. Uyarıcı pipet doldurun.

Koku Epitelinin 3. hazırlanması

Not: TD-IRES-tauGFP fareler ya da promotörün kontrolü altında tauGFP ifade eder. Bu farelerde, ilgi OR ifade tüm nöronlar GFP ile etiketlenmiş. Bu protokol tüm bölgeler ifade ameliyathanelerinde için uyarlanmıştır. Ancak, disseksiyonları ve kayıtlar dorsal bölgesinde ifade ameliyathanelerinde için daha kolaydır.

  1. Ketamin ve ksilazin (150 mg / kg ve 10 mg / kg Yönetim Kurulu karışımı enjekte edilerek hayvan anestezisiy ağırlık). Dekapitasyon genç farelerde ya da yaşlı fareler için uygun bir şekilde muhafaza kemirgen giyotinle birlikte keskin bir makasla gerçekleştirilebilir.
    1. Kullanımı halka diseksiyon makas dorsal deri yoluyla uzunlamasına bir medial kesi yapmak. Bunu dışında çekerek cildi çıkartın. Makas kullanarak, çene eklemi alt çene kesti. Dişlere koronal kesim paralel olarak üst ön dişleri çıkarın.
    2. Gözlerinin arkasında başın bir koronal kesim olun ve başın sadece ön kısmını tutun. Kapsamında diseksiyon için buz Ringer çözeltisi içinde bunu batırın.
  2. Kapsamında ayır: ventral tarafında, üst çene / diş boyunca uzunlamasına kesim yapmak. Burun boşluğunun dorso-yan tarafında takip, uzunlamasına sırt kemikleri kesin. En kemikleri ve damak kaldır; oda sıcaklığında oksijenli Ringer buna bağlı septum ve epitel aktarın.
  3. Son diseksiyon için: Sağ kayda başlamadan önceoturum forseps ile altta yatan septum gelen epitel uzak soyun. Forseps ile ve yapışma güçlü septum ön kısmında iki 4-5 mm makas darbeleri (kullanım microvannas makas) ile epitel ayırın.
    1. Dikkatle septal epiteline dorsal bağlantısı boyunca dışarı keserek vomeronasal organı çıkarın. Yukarı bakacak şekilde mukus tabakası ile bir kayıt odasına epitel aktarın; Bir harp ile odasında düz tutun.
  4. Floresan optik ve hassas bir kamera ile donatılmış dik bir mikroskop altında odasını takın. 40X su daldırma hedefi (sayısal açıklık 0.8) ve bir büyüteç ile elde ekstra bir 2X veya 4X büyütme ile yüksek büyütmede bilgisayar ekranında hazırlık gözünüzde canlandırın. Oda sıcaklığında oksijenli Ringer (1-2 ml / dakika) sürekli serpmek.

4. Kayıt Oturumu

  1. Floresan hücreye Ara: 480 de hazırlık heyecanlandırmak530-550 nm aralığında ışık yayar EGFP nm; floresan ve parlak bir alan altında güvenilir görünür tek dendritik topuzu hedef.
  2. Nystatin ile hücre içi çözelti ile elektrot doldurun; hafifçe elektrot üzerinde dokunarak kabarcıkları.
  3. Elektrot tutucu elektrot yerleştirin pipet pozitif basınç uygulayın; Direnç 15-20 M? Olmalıdır.
  4. Hücreye yakın elektrot getirin; Direnç ~ 40 M? ulaştığında, pozitif basınç serbest bırakın ve bir gigaseal ulaşmak için hafif negatif basınç uygulayın.
  5. Conta ulaşıldığında, yaklaşık -75 mV zar potansiyeli ayarlanır;
  6. Hücre açıldıktan sonra, stimülasyon protokolleri, farmakolojik tedaviler ile devam edin. Tek bir odorant stimülasyon, kayıt spontan aktivite 200-500 milisaniye kadar yanıtı ölçmek için, 500 milisaniye boyunca canlandırmayı ve 10 saniye 13 hücre yanıtı ölçmek. Farmakolojik tedaviler için de farmakolojik ajanlar serpmekİstenen bir konsantrasyon, 20.

5. Veri Analizi

  1. Olarak takip Odorant uyarılmasıyla ortaya akımları analiz: (msn maksimum genlik% 90 ulaşmak için gerekli zaman,) maksimum genlik, yükselme zamanı, toplam akım (PAS eğrinin altında kalan alan), zaman% 50 (başlangıcı ve msn'de, azami amplitüd% 50 karşılık mahsup arasındaki süre).
    1. Çizip Hill denklemi kullanarak bir doz yanıt eğrisi ayarı, farklı konsantrasyonda (maksimum amplitüd ulaştı) tepe iletim akımları kullanılarak: I = Imax / (1 ​​+ (K 02/01 / C) n-i) tepe akımını temsil eder, , maksimum cevabın yarısı erişildiği K1 / 2 konsantrasyonu, C odorant konsantrasyonu ve n Hill katsayısı doyurarak konsantrasyonlarda maksimum cevap IMAX.
  2. Maksimum depolarizasyon için geçerli kelepçe tota membran potansiyeli kayıtları analizl potansiyeli (mVsec eğrinin altında kalan alan) ortaya çıkardı; 30 sn 1 dk kayıtları üzerinde rekor spontan spike aktivitesi; akımlar (5-10 pA) enjeksiyonu ile ortaya sivri aracılığıyla kayıt heyecanlanma.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu protokolün sonuç diseksiyon kalitesine bağlıdır. Bu diseksiyon adımlar kısa (en az 10 dk 15) ve (yani, epitel zarar görmemesi için) kesin olmalıdır. Şekil 1 ideal hazırlık farklı büyütme seviyelerinde nasıl göründüğünü göstermektedir. Parlak saha altında düşük büyütme (bu tür hücreleri desteklemek OSNs tokmakları gibi), farklı hücre tipleri ayırt (Şekil 1A) 'dir. En yüksek büyütme düzeyinde, genellikle 80X 160x, aydınlık alanda, OSNs dendritik topuzlar destekleyen hücrelerin (Şekil 1B) açıkça ayırt edilebilir olmalıdır. Floresan ışığı altında, sadece dendritik topuzlar ve GFP etiketli hücreleri kirpikler (Şekil 1C) görebilir. 2 fotoğraf karşılaştırarak, etiketli hücreler kayıt pipet (Şekil 1D) ile yaklaşılabilir.

diseksiyon sıcaklığı yanidökülmesinden ve diseksiyon zamanlaması önemlidir. Diseksiyon ilk kısmı, septum (3.2 bölüm 3.1.1) hazırlanması Buz gibi soğuk çözelti içinde 5-10 dakika içinde cereyan etmesi gerekmektedir. Nihai diseksiyonu (3.3), oda sıcaklığında en az 5 dakika sürmelidir. Dendritik topuzlar epitelin yüzey üzerinde yüzen ve ölü hücrelerin benzer: durumunda diseksiyonu çok uzun süren ya da diseksiyon çözüm çok sıcak gerçekleştirilmiştir, hazırlık kaçınılmaz hızla hasarlı görünüyor.

Bir sızdırmazlık ulaşılır ve hücre nistatin etkisi altında bir kere açıldıktan sonra, tipik bir voltaj kapılı akımlar (Şekil 2A) gözlenebilir. şekli ve bu akımların özellikleri, hücrenin sağlığını izlemek için de kullanılabilir: fokun kalite azalıyor ölmekte olan bir hücreye ya da eğer bu akıntılar 'genlik azalacaktır. Geçerli kelepçe yapılandırması altında, aksiyon potansiyelleri ya kendiliğinden kaydedilebilir (Şekil 2B) ya da bu kutuplaşma giderici bir akım (Şekil 2C) enjeksiyonu ile. Geçerli enjeksiyonu ile uyarılan ateşleme özellikleri kaydedildi nöron heyecanlanma karakterize eder. Farklı OSNs 'nüfus eksitabilitesi (klasik frekans ve ISI hesaplamaları kullanarak) mukayese edilebilir.

Farklı koku ve / veya koku farklı konsantrasyonları ile yüklü bir multibarrel pipet basınç ejeksiyon hücreleri uyarmak için kullanılabilir. Bu Odorant kaynaklı tepkileri ölçmek için izin verir. veya ilgi hücrede ifade ilgili koku ve konsantrasyonlar, örneğin liral MOR23, M71 için asetofenon, mOREG için öjenol için bir ligand olan, bağlı seçilmelidir. Şekil 3 üzerinde gösterilen deneyde, kaydedilen MOR23-IRES-tauEGFP nöronlar (Şek mevcut kelepçe modunda (Şekil 3A) altında veya voltaj kenetleme modunda, liral, MOR23 için bir ligand farklı konsantrasyonlarına yanıture 3B). Gerilim kelepçe modunda kayıtları, farklı özellikleri (-yükselme zamanı, mevcut toplam elicited, vb., Maksimum genlik) elektrofizyoloji de klasik gerçekleştirilen şekilde tepkisini ölçmek için izlenebilir. Odorant kaynaklı yanıtın maksimum genliği kullanılarak doz-yanıt çizilen ve Hill denklemi kullanılarak monte edilebilir. Algılama eşiği, zamansal dinamik, dinamik aralık ve doygunluk düzeyi: Bu sonuçlar, her OSN kodlama özellikleri hakkında bilgi vermek. Doz-yanıt eğrileri örnekleri, Şekil 3C'de gösterilmiştir. Tüm bu detaylar bir popülasyon içindeki potansiyel heterojenliğini ölçmek için bireysel OSNs arasında mukayese edilebilir; bunlar, aynı zamanda ya da potansiyel bir modülasyon ve plastiklik ölçmek için bir tedavi uygulaması olmadan OSNs arasında mukayese edilebilir.

Şekil 1


Şekil 1: Sağlıklı bir hazırlama Örnek görüntüler 40X büyütmede parlak alan koşulları altında gözlenen SR1-IRES-tauGFP transjenik farenin burun boşluğunda elde (A) Tam koku epitel.. OSN dendritik topuzlar (siyah ok başları) destekleyen hücrelerin (SC) ve Bowman bezleri (BG) bir örgü içine alınır. Parlak bir alan durumuna (beyaz ve kırmızı ok başları) altında gözlenen OSNs ifade SR1 (B) Dendritik topuzlar. (C) SR1 ifade OSNs dendritik topuzlar gösteren floresan ışığı altında (B) aynı alan. (D), parlak alan altında bir SR1-ifade OSN yaklaşan Kayıt pipet. (- D B) kırmızı ok ucu aynı SR1 OSN temsil eder. Ölçek çubuğu: 5 mikron.


Şekil 2: protokol ile elde edilen Temsilcisi membran özellikleri sonuçlar:. 40 membran potansiyel -67 mV depolarize adımları artırarak ortaya çıkarılan bir SR1-IRES-tauGFP OSN dendritik topuzu patch-kelepçe kayıtları (A) Gerilim kapılı akımlar mV. (B) Mevcut kelepçe yapılandırmasında kaydedilen spontan aktivite; aksiyon potansiyelleri 15 sn kayıt çağında sırasında görülebilir. Bir +7 pA uyarıcı akım tarafından ortaya (C) Aksiyon potansiyelleri; Bu protokol hücrenin uyarılabilirliğinin hakkında bilgi sağlar.

Şekil 3A

Şekil 3B


Şekil 3:. Liral, MOR23 reseptörünün bir ligand, bir MOR23-IRES-tauEGFP nöron odorant uyarılan yanıtların temsili örnekleri artan konsantrasyonları mevcut kelepçenin (A) ve gerilim kelepçe (B) 'de her iki tepkisini arttırma neden olur. Membran potansiyeli -67 mV'de kenetlendi. (C) bir Hill denklemine sahip asetofenon artan konsantrasyonlarına yanıt olarak, üç M71 nöronları üzerinde edinilen ve monte bireysel doz-yanıt eğrileri örnekler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

doğru, sağlıklı OSNs özelliklerini izlemek için bu protokolün yeteneği hazırlık kalitesine büyük ölçüde bağlıdır. Bu nedenle, diseksiyon adımlar önemlidir. Önce kalite (pH, osmolarite), oksijenasyon ve sıcaklık (buz-soğuk ama dondurulmuş değil) diseksiyon orta dikkat etmek önemlidir. İkincisi, diseksiyon araçları ile epitel manipülasyon olarak zarar görmemesi için mümkün olduğunca sınırlı olmalıdır. Son olarak, mümkün olduğunca büyük OSN popülasyonu erişmek amacıyla, mümkün olduğu kadar düz bir preparat elde etmek için kritiktir.

Diseksiyon kalitesi sağlıklı bir hazırlık elde etmek esastır. Diseksiyon dorsal burada bir ventral sunmak ancak bazı kullanıcılar hızla burun boşluğuna açılır ve koku epiteli septal girinti hızlı bir erişim için diseksiyon dorsal başlamayı tercih edebilirsiniz: Ancak, farklı yaklaşımlar diseksiyon için kullanılabilir. Her kullanıcı, dolayısıyla pr uyarlayabilirsinizilgi alanı sağlıklı bir hazırlık ulaşmak için en etkili strateji için otocol.

Hazırlık mikroskop altında olduğunda, preparatın sağlığı sürekli izlenmesi gerekmektedir. Gerçekten de, sağlıksız bir preparasyon, bir gigaseal ulaşmak için düşük olasılık yol açar. Gigaseals elde düşük seviyedeki bir etkisini sağlıklı OSNs bulmak için hazırlık ilgi alanı değiştirilerek artırılabilir. Daha köklü çözüm yeni bir tümüyle hazırlık değiştirmektir. Mühür ulaşıldığında, düşük olasılık "açıldı" devlet gerçekleşebilir ulaşmak için. Bu iç çözümün kalitesi nedeniyle olabilir. iç çözüm deney kısa bir süre önce hazırlanmış olmalıdır. nystatin çözünürlüğü oldukça düşük olduğu girdap ve sonikasyon kullanımı önemlidir. Açma olasılığını arttırmak için iç çözelti yeniden 10 sn için vortekslenir ve daha sonra 30-60 saniye için sonike edilmiş olmalıdır. Bu usually hücre açma verimliliğini artırır.

Koku ile kaydedilen OSN teşvik etmek, sunulan protokol 7 varil uyarıcı pipet kullanır. Pipetin bu tür koku ve / veya yedi kaydedilen her hücreleri üzerinde test koku konsantrasyonu sayısında bir sınırlama ima eder. Bu konsantrasyon 7 log birimi kadar kapsayabilir çünkü bu sınırlama, bir doz tepki eğrisi halinde nispeten önemli değildir. Bununla birlikte, farklı koku test edildiği eleme deneylerinde durumunda, bir yedi varil pipet sınırlamaları gösterebilir. Deneyler tarama, amaç yetim VEYA ifade etiketli OSNs bir ligand bulmaktır. Bu protokol kullanılarak odorant karışımlarının kullanılmasını gerektirir. Ve bir tepki oluşturmuştur Her karışım daha sonra ayrı ayrı koku maddesi bölünecektir. Bu OSNs 16 ifade Taar üzerinde amin Koku moleküllerini taramak için yapıldı. Bu deneylerde, floresan nöronlar Taars ifade ve ligand Unk oldunown. Protokolü kullanarak, yazarlar karışımlarda amin koku düzinelerce taranması olabilir. Bir tepkilerinden karışımlar sonra en verimli ligandı bulmak için tek koku aşağı kırıldı.

kayıt alanı ve uyarıcı pipet arasındaki mesafe hücre 20 mekanik uyarılması en aza indirmek için akıllıca seçilmesi gerekmektedir. Basınç ve / veya (20 um altında) çok küçük bir mesafe (30 eden kayıt koşullarında psi üzerinde) çok yüksekse, bir OSNs mekanik müdahale da odorant yanıt maskeleyebilir. Şişirme pipet ve kayıt sitesi arasındaki basınç ve mesafe de stimülasyon sırasında çözüm değişimini kontrol etmek için kritik öneme sahiptir. nöron ulaşan konsantrasyon önce testler 13 bir dizi pipet konsantrasyon günümüze mümkün olduğunca yakın olarak değerlendirildi. Bu testler, bir çözelti, başlangıcını ölçmek için mavi boya ile renkli ve t ofset kullanılandiye uyarılması. 20 psi basınç ve 30 um mesafeyi kullanarak uyaran maksimum yoğunluğu 300 msn içinde ulaşılmıştır. uyaran ofset da dikkatle değerlendirilmiştir: Hazırlık perfüze çözümün sürekli akış altında olduğundan, uyaran 0,8-0,9 sn 13 içinde yıkandı.

OSNs özelliklerini kodlama koku tarihsel in vivo hücre dışı kayıtlar yoluyla veya izole hücrelerde deneyler yoluyla ya ölçüldü. Memelilerde, hücre dışı kayıtları sıçanlarda 21 in vivo olarak, ilk yapıldı. Dışı kayıtlarda, OR kaydedilen hücrede ifade böylece test odorant yanıt bir hücreyi bulmak için başarı oranı sınırlayan bilinmemektedir. protokol epitel hücre ortamında nöronlarda kayıt ve tanımlanmış reseptörlerin karakterizasyonu sağlar. Reseptörlerin özellikleri bu nedenle farklı düzeylerde analiz edilebilir: özel bir ligandIletim yolunun ilk aşamasında / VEYA etkileşimi; Sonuç olarak, agonist / test, çeşitli ligandlar, antagonist etkileşimlerde; karışımlar tanımlanmış ameliyathanelerinde entegrasyonu ve OSNs 'özgünlük için nakil yolunun rolü özellikleri; epitel içinde (örneğin GAP birleşme gibi), hücre-hücre etkileşimleri koku kodlama etkisi; ve son olarak transdüksiyon yolunun modülasyonu farmakolojik maddeler kullanılarak.

Ayrışmış hücre kayıtları, daha önce belirtildiği gibi, ayrışma süreci mukus ve koku epiteli içinde hücre-hücre etkileşimleri kaldırır. Bu OSNs kodlama özelliklerinde değişikliklere sebep olabilir. İzole hücreleri üzerinde kalsiyum görüntüleme deneyleri sıklıkla bildirilmiştir. Örneğin, M71 asetofenon yanıt olarak OSNs ifade doz-tepki eğrileri, 7 rapor edilmiştir. Bu doz-yanıt eğrileri, protokol kullanılarak elde edilen doz-yanıt eğrileri daha diktirBurada 4 sunuldu. Bu farklılıklar nedeniyle sağlam hazırlanmasında, hücre-hücre etkileşimleri hem de izole edilmiş hücrelerde mukus çıkarılması olabilir. Mukus koku iletimi 22,23 temel perireceptor olaylarda yer alan birçok protein ve enzimler içeren bilinmektedir. Protokol Burada bildirilen ise, koku epiteli yapısı korunması ve mukus varsayımsal varlığı OSNs odorant kodlama yerli özelliklerini korumak için katkıda bulunur. protokolünde kullanılan konsantrasyonlar mol / L gösterilir ve genellikle 10 ila -7 -10 -3 aralığında vardır. Bu konsantrasyonlar hava aşamalı kayıtları (ya yerel alan potansiyeli veya hücre dışı kayıtlarda) kullanılan konsantrasyonlarda daha yüksektir. Bu uyumsuzluklar) i bağlı olduğu (ve dolayısıyla) stimülasyon kayıtları sıvı fazı ve belki ii) kayıtları sırasında perfüzyon ile mukus yavaş arınma. Muc Aslında, arınmaBize ve diseksiyonu sırasında OSNs 'akson bölümünde sunulan hazırlık potansiyel bir "sözde-dokunulmamış" yerine "tam sağlam" hazırlık olarak nitelendirilebilecek bu destekleyebilir. Bu hazırlık, ancak, mümkün olduğunca in vivo olarak yakın ve henüz ortaya çıkaran kayıt koşulları patch-kelepçe kayıtları temsil eder. Bir memeli organizmadan herhangi bir in vitro hazırlık olarak, hayatta kalma süresi-sınırlıdır. Bu sınır mukus arınma nedeniyle olabilir, OSNs 'akson bölüm yanı sıra hazırlık içinde kan dolaşımı olmaması.

Burada sunulan protokol biri koku duyu nöronlarının membran özelliklerini kaydetmenize olanak verir. Bu teknik, zar OSNs özellikleri, OSNs farmakolojik araştırmalarda, OSNs odorant kodlama özellikleri modülasyonu ve ORs ve deorphanization analizi gibi çoklu uygulama olabilir. Kalsiyum görüntüleme sırasında kaydedilen olaylar Slo vardırw ve uzun ömürlü. Membran düzeyinde koku iletim yolunda hızlı olaylarla ilgili verilere mevcut protokol kurşun Patch-kelepçe kayıtları.

Burada yer alan kayıtlar yama klemp yapılandırmasında yapılmaktadır. Bu yapılandırmada, kaydedilen hücrenin membran özellikleri bu koku iletim yolu makineleri veya söz konusu voltaj kapılı akımları olup, analiz edilebilir. Bu protokolü kullanarak deneyler OSNs özelliklerini kodlama odorant modülasyonu hakkında veri sağlayabilir. Farmakolojik maddeler, farklı koşullar içinde koku transdüksiyonunu araştırmak için de kullanılabilir: örneğin, MDL12330A, adenilat siklaz III (ACIII) 24,25 bir engelleyici bir koku verici madde yanıt olarak ACIII rolünü araştırmak için perfüzyon çözeltisi içinde uygulanabilir. Buna ek olarak, bu protokol <örneğin koku çevre kodlama özellikleri farklı koşullarda modüle nasıl koku araştırmak için kullanılabilirsup> 18 veya beslenme davranışları 26 katılan hormonların etkisi altında. Son olarak, bu protokol, aynı zamanda / ligand etkileşim ve tanımlanan ORs ya da rasgele seçilen 27 reseptör agonist / antagonist aktiviteleri deşifre veya yaklaşık veri yol açabilir.

Nihayet, 7 varil uyarıcı pipet nedeniyle sınırlamalar, bu protokol aynı zamanda ORs deorphanizing için kullanılabilir olabilir. Daha önce, bu durumda da belirtildiği gibi, çok sayıda odorant karışımları test edilebilir. Ve bir tepki oluşturmuştur karışımlar daha sonra, diğer hücreler üzerinde test edilen tek tek koku halinde bölünmelidir.

Tanımlı ORs ifade OSNs hedefleyerek, bu protokol OR, ligandlar / OR etkileşimleri, iletim yolu özellikleri hakkında güçlü veriler sağlar ve farklı koşullarda OSNs tanımlanan nüfus özelliklerini karşılaştırmak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
vibration table with Faraday cage TMC 63-500 SERIES required : isolates the recording system from vibrations induced by the environment (movements of experimenter, vibrations of equipment such as fans for cooling computers, etc); can also be purchased with a Faraday cage, or equipped by a custom made Faraday cage; this cage is recommended to avoid electric noise from the environment
optics
microscope Olympus BX51WI upright microcope equipped with epifluorescence; fixed or moving stage depending on the user's preference
objectives Olympus LUMPLFL40XW at least 2 objectives required: a 4X or 10X for coarse approach to the cell; and a 40X immersion long distance example Olympus LUMPLFL40XW / IR /0,8 / WD:3.3 MM
magnifier Olympus U-TVCAC ABSOLUTELY REQUIRED: placed in the light path between the objective and the camera; allows to magnify the image on the screen in order to reach precisely the knob with the recording electrode
camera Olympus DP72 a good camera is required to see the neurons in fluorescence as well as in bright field; the controlling software is simple and allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell. An ultrasensitive camera is not necessary
filters Olympus/Chroma depending on the fluorescent protein used in the mice; example for GFP: excitation : BP460-490: emission: HQ530/50m
amplifier HEKA EPC10 USB monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the puffing by sending a TTL signal to the spritzer; the EPC10 setup is controled by computer
software HEKA Patchmaster controls the amplifier during the experiment
micromanipulator Sutter MP225 precision micromanipulator, allows precise movements down to 1/10th of a micrometer; this model is very stable; avoid hydraulic manipulators that may drift
electrode puller Sutter P97 with a FT345-B wide trough filament;  to prepare recording pipets of about 2µm diameter with a long tip to reach the cells; the resistance should be 15 to 20Mohm with perforated patch clamp solution
glass Sutter BF120-69-10 in our recording conditions, this glass is ideal for recording pipets
recording chamber Warner Instruments RC-26G a chamber is needed to set the preparation under the microscope. To maintain the preparation in the center of the chamber, a net/anchor should be used.
stimulation
glass WPI TW100F-4 attached in groups of 7, these pipettes are used to prepare prepulled stimulating pipettes
multibarrel puller MDI PMP-107-Z by association of pull and twist, this puller allows us to prepare puffing electrodes with 7 barrels
precision pressure injector  Toohey Company P/N T25-1-900 Single Channel    this precision pressure injector  controls the pressure ejected in the multibarrel puller; it is controlled manually or by the amplifier by a 5V  TTLs
micromanipulator Narishige YOU-1 a coarse manipulator is enough to bring the puffing electrode close to the recording site
tubings N/A tygon tubing to bring the pressure from the puffer to the puffing pipette
solutions/perfusion/chemicals
vacuum pump gardner denver 300 series a vibrating membrane pump is more quiet and efficient than other types of pumps
perfusion system N/A N/A gravity perfusion system with polyethlylen tubing to bring in and out the external solution from the recording chamber
nystatin Sigma-Aldrich N3503 mandatory to perpare internal solution for perforated patch clamp
DIMETHYL SULFOXIDE Sigma-Aldrich D5879 used to disolve nystatin for internal solution for perforated patch 
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9625 extracellular solution
Potassium chloride Sigma-Aldrich P4504 intracellular/extracellular solution
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich C7902 extracellular solution
Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4) Sigma-Aldrich S9638 extracellular solution
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4 7H2O) Sigma-Aldrich 63140 extracellular solution
Glucose Sigma-Aldrich G8270 extracellular solution
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6297 extracellular solution
EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) Sigma-Aldrich E3889 internal solution
Potassium hydroxyde Sigma-Aldrich P1767 internal solution
Methyl Sulfoxide Sigma-Aldrich W387509 intracellular solution
Hepes-Na Sigma-Aldrich H7006 intracellular solution
Sucrose Sigma-Aldrich S0389 intracellular solution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lowe, G., Gold, G. H. Nonlinear amplification by calcium-dependent chloride channels in olfactory receptor cells. Nature. 366, (6452), 283-286 (1993).
  2. Ponissery Saidu, S., Dibattista, M., Matthews, H. R. Odorant-induced responses recorded from olfactory receptor neurons using the suction pipette technique. J Vis Exp. (62), e3862 (2012).
  3. Moss, R. L., et al. Electrophysiological and biochemical responses of mouse vomeronasal receptor cells to urine-derived compounds: possible mechanism of action. Chem Senses. 23, (4), 483-489 (1998).
  4. Kaur, A., Dey, S. Live cell calcium imaging of dissociated vomeronasal neurons. Methods Mol Biol. 1068, 189-200 (2013).
  5. Ma, M., Chen, W. R. Electrophysiological characterization of rat and mouse olfactory receptor neurons from an intact epithelial preparation. J Neurosci Methods. 92, (1-2), 31-40 (1999).
  6. Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65, (1), 175-187 (1991).
  7. Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C. Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system. J Neurosci. 22, (8), 3033-3043 (2002).
  8. Bozza, T., et al. Mapping of class I and class II odorant receptors to glomerular domains by two distinct types of olfactory sensory neurons in the mouse. Neuron. 61, (2), 220-233 (2009).
  9. Vassalli, A., Rothman, A., Feinstein, P., Zapotocky, M. Minigenes impart odorant receptor-specific axon guidance in the olfactory bulb. Neuron. 35, (4), 681-696 (2002).
  10. Feinstein, P., Bozza, T., Rodriguez, I., Vassalli, A. Axon guidance of mouse olfactory sensory neurons by odorant receptors and the beta2 adrenergic receptor. Cell. 117, (6), 833-846 (2004).
  11. Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat Rev Neurosci. 5, (4), 263-278 (2004).
  12. Grosmaitre, X., et al. SR1, a mouse odorant receptor with an unusually broad response profile. J Neurosci. 29, (46), 14545-14552 (2009).
  13. Grosmaitre, X., Vassalli, A., Mombaerts, P., Shepherd, G. M. Odorant responses of olfactory sensory neurons expressing the odorant receptor MOR23: a patch clamp analysis in gene-targeted mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, (6), 1970-1975 (2006).
  14. Lam, R. S. Odorant responsiveness of embryonic mouse olfactory sensory neurons expressing the odorant receptors S1 or MOR23. Eur J Neurosci. 38, (2), 2210-2217 (2013).
  15. Zhang, J., Huang, G., Dewan, A., Feinstein, P. Uncoupling stimulus specificity and glomerular position in the mouse olfactory system. Mol Cell Neurosci. 51, (3-4), 79-88 (2012).
  16. Zhang, J., Pacifico, R., Cawley, D., Feinstein, P. Ultrasensitive detection of amines by a trace amine-associated receptor. J Neurosci. 33, (7), 3228-3239 (2013).
  17. Lee, A. C., Tian, H., Grosmaitre, X. Expression patterns of odorant receptors and response properties of olfactory sensory neurons in aged mice. Chem Senses. 34, (8), 695-703 (2009).
  18. Cadiou, H., et al. Postnatal odorant exposure induces peripheral olfactory plasticity at the cellular level. J Neurosci. 34, (14), 4857-4870 (2014).
  19. Mombaerts, P. Axonal wiring in the mouse olfactory system. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 713-737 (2006).
  20. Grosmaitre, X., Santarelli, L. C., Tan, J., Luo, M. Dual functions of mammalian olfactory sensory neurons as odor detectors and mechanical sensors. Nat Neurosci. 10, (3), 348-354 (2007).
  21. Duchamp-Viret, P., Chaput, M. A. Odor response properties of rat olfactory receptor neurons. Science. 284, (5423), 2171-2174 (1999).
  22. Heydel, J. M., et al. Odorant-binding proteins and xenobiotic metabolizing enzymes: implications in olfactory perireceptor events. Anat Rec (Hoboken). 296, (9), 1333-1345 (2013).
  23. Pelosi, P. Perireceptor events in olfaction). J Neurobiol. 30, (1), 3-19 (1996).
  24. Spehr, M., Wetzel, C. H., Hatt, H. 3-phosphoinositides modulate cyclic nucleotide signaling in olfactory receptor neurons. Neuron. 33, 731-739 (2002).
  25. Chen, S., Lane, A. P., Bock, R., Leinders-Zufall, T. Blocking adenylyl cyclase inhibits olfactory generator currents induced by 'IP(3)-odors. J Neurophysiol. 84, (1), 575-580 (2000).
  26. Savigner, A., et al. Modulation of spontaneous and odorant-evoked activity of rat olfactory sensory neurons by two anorectic peptides, insulin and leptin. J Neurophysiol. 101, (6), 2898-2906 (2009).
  27. Ukhanov, K., Brunert, D., Corey, E. A. Phosphoinositide 3-kinase-dependent antagonism in mammalian olfactory receptor neurons. J Neurosci. 31, (1), 273-280 (2011).
Bozulmamış neuroepithelium Fare Koku Duyu Nöronlar Delikli Patch-kelepçe Kayıt: Bir Belirlenen Odorant Reseptör ifade Nöronlar Fonksiyonel Analiz
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jarriault, D., Grosmaitre, X. Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor. J. Vis. Exp. (101), e52652, doi:10.3791/52652 (2015).More

Jarriault, D., Grosmaitre, X. Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor. J. Vis. Exp. (101), e52652, doi:10.3791/52652 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter