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Immunology and Infection

Adenovirus सीरोटाइप 5-vectored वैक्सीन दृष्टिकोण के विकास के लिए एंटीजन Capsid-निगमन रणनीति का उपयोग

Published: May 6, 2015 doi: 10.3791/52655
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 2Center for AIDS Research, University of Alabama at Birmingham

Summary

यहाँ, हम एक सबूत के सिद्धांत द्विसंयोजक एडिनोवायरस प्रकार 5 (AD5) वेक्टर उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत AD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-अपने 6 एंटीजन Capsid-निगमन रणनीति का उपयोग करके। इस सदिश गुणात्मक फिटनेस प्रदर्शन करने के लिए प्रदर्शन किया गया, क्षमता शामिल किया एंटीजन को AD5 पॉजिटिव इन विट्रो में सीरा, और प्रतिजनकता के साथ-साथ प्रतिरक्षाजनकता से बचने के लिए।

Abstract

Adenovirus सीरोटाइप 5 (AD5) बड़े पैमाने पर वैक्सीन के विकास के लिए पारंपरिक transgene के तरीकों के साथ संशोधित किया गया है। क्लिनिकल परीक्षण में इन पारंपरिक रूप से संशोधित AD5 वैक्टर कम efficacies मुख्य रूप से जनसंख्या के बहुमत के बीच AD5 पूर्व मौजूदा उन्मुक्ति (पी) के साथ जोड़ा जा सकता है। AD5 पी की चिंता को हल करके AD5-vectored टीका विकास को बढ़ावा देने के लिए, अभिनव एंटीजन Capsid-निगमन रणनीति नियोजित किया गया है। इस रणनीति की योग्यता के आधार पर, हम पहले hexon शटल निर्माण AD5-vectored प्लाज्मिड HVR1-KWAS-HVR5-उनका एक पहले का निर्माण शटल प्लाज्मिड HVR5-अपने 6 / pH5S में hypervariable क्षेत्र (HVR) hexon के 1 subcloning द्वारा 6 / pH5S, उसकी 6 टैग HVR5 में शामिल किया था जो। एक एचआईवी मिलान ELDKWAS युक्त इस HVR1 डीएनए टुकड़ा संश्लेषित किया गया था। HVR1-KWAS-HVR5-अपने 6 / pH5S, तो linearized और linearized रीढ़ प्लाज्मिड pAd5 / ΔH5 (जीएल) के साथ सह तब्दील हो गया थामुताबिक़ पुनर्संयोजन के लिए। PAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-अपने 6 कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था इस recombined प्लाज्मिड वायरल वेक्टर AD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-अपने 6 उत्पन्न करने के लिए। इस सदिश वायरल शारीरिक अनुमापांक (उपाध्यक्ष / एमएल) ने संकेत दिया गुणात्मक स्वास्थ्य, संक्रामक अनुमापांक (आईपी / एमएल) और इसी वी.पी. / आईपी अनुपात को मान्य किया गया था। दोनों एचआईवी मिलान और उसकी 6 टैग सतह उजागर AD5 कैप्सिड पर थे, और अपने स्वयं के मिलान विशिष्ट प्रतिजनकता बनाए रखा। एक निराकरण परख इन विट्रो में AD5 पॉजिटिव सीरा द्वारा निराकरण नाकाम करने के लिए इस द्विसंयोजक वेक्टर की क्षमता का संकेत दिया। चूहे प्रतिरक्षण एचआईवी मिलान और 6 उसके लिए मजबूत humoral रोगक्षमता विशिष्ट की पीढ़ी का प्रदर्शन किया। इस सबूत के सिद्धांत अध्ययन एंटीजन Capsid-निगमन रणनीति के साथ जुड़े प्रोटोकॉल feasibly अलग कैप्सिड प्रोटीन को संशोधित करके AD5-vectored टीकों के उत्पादन के लिए उपयोग किया जा सकता है कि सुझाव दिया। इस प्रोटोकॉल भी च जा सकता हैurther दुर्लभ सीरोटाइप एडिनोवायरस-vectored टीके की पीढ़ी के लिए संशोधित।

Introduction

मानव adenovirus (एडी) एक डबल असहाय डीएनए जीनोम युक्त icosahedral nucleocapsid के साथ एक मध्यम आकार, गैर छा वायरस है। विज्ञापन सात समूहों में एक वर्गीकरण (जी के माध्यम से एक) के साथ, Adenoviridae परिवार के अंतर्गत आता है। प्रत्येक समूह के विभिन्न सीरमप्रकारों के वायरस होते हैं। ग्रुप सी से adenovirus है, जो सीरोटाइप 5 (AD5) के सबसे बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है और सबसे व्यापक रूप से जीन थेरेपी और टीकाकरण जैसे vectored दृष्टिकोण के लिए आवेदन किया।

पारंपरिक transgene रणनीति विकसित की है और एक जीन के हित के साथ वायरस जल्दी जीनों के विस्थापन के द्वारा होती है जो AD5 संशोधनों के लिए आवेदन किया है, और जीन के हित एक मेजबान में केंद्रित अभिव्यक्ति की गई है। उदाहरण बंदर का इम्यूनो वायरस 1 की फिरना जीन के साथ जल्दी जीन 3 (E3) की जगह से pENV9 / Ad5hrΔE3 का निर्माण कर रहे हैं, ह्यूमन इम्यूनो का ढकोसला जीन के साथ जल्दी जीन 1 (ई 1) की जगह से AdCMVGag का निर्माणवायरस (एचआईवी) 2, और लैक जेड गुणसूत्र 3 के साथ ई 1 की जगह से विज्ञापन लैक जेड का निर्माण। AD5 पर पारंपरिक transgene रणनीति की व्यापक आवेदन निम्नलिखित योग्यता के आधार पर निर्भर करता है: AD5, वायरस और वायरस प्रचार पर संभव जीन इंजीनियरिंग, विदेशी जीन डालने की बड़ी आवास और AD5 4,5 की सुरक्षा के लिए मेजबान टीम की व्यापक रेंज। हालांकि, इस रणनीति के प्रयोग के द्वारा AD5-vectored नैदानिक ​​चिकित्सा के कम efficacies AD5 बच्चों और वयस्कों के 4,6 के बहुमत के बीच बहुत प्रचलित है, के बाद से मुख्य रूप से AD5 पी के साथ जुड़े होने के लिए मैप किया गया है, जो एक बड़ी अड़चन, कर दिया गया है।

AD5 की बड़ी अड़चन को दूर करने, प्राथमिक उद्देश्य AD5 पी circumventing एक वैकल्पिक रणनीति विकसित करने के लिए है। इस तरह निष्क्रिय करने एंटीबॉडी (nabs) 8-10 और CD8 + टी सेल प्रतिक्रिया के रूप में अंतर्जात प्रतिरक्षा 7, अनुकूली उन्मुक्ति AD5 के खिलाफ 10 सह करने के लिए दिखाया गया हैAD5 nabs AD5 पी 10,11 के योगदान में प्रमुख भूमिका निभाने के लिए प्रदर्शित होने के साथ, AD5 पी को ntribute। इसके अलावा, AD5 प्रमुख प्रोटीन hexon, फाइबर और Penton बेस सहित कैप्सिड प्रोटीन में स्थित लक्ष्य epitopes, nabs। जिसमें से hexon AD5 nabs 8,11-13 का प्रमुख लक्ष्य है। इन निष्कर्षों के आधार पर, एक अभिनव एंटीजन Capsid-निगमन रणनीति शुरू की गई है। इस उपन्यास रणनीति nabs और कुशल AD5 वेक्टर प्रशासन की कमी हुई मान्यता के लिए अग्रणी, प्रोटीन के हित AD5 को निष्क्रिय epitopes बदलाव या मास्क जो AD5 कैप्सिड प्रोटीन, पर के प्रतिस्थापन या समावेश पर प्रकाश डाला गया। यह भी मेजबान टीम सीधे प्रतिरक्षा प्रणाली को 4,14,15 को एंटीजन के हित पेश करके मजबूत humoral प्रतिरक्षा और शक्तिशाली सेलुलर उन्मुक्ति बटोर कर सकते हैं क्योंकि इस रणनीति प्रतिस्पर्धी है कि उल्लेखनीय है। इस रणनीति के आधार पर, आणविक क्लोनिंग और पुनः संयोजक विज्ञापन वायरल वेक्टर बचाव संरचनात्मक रूप से विभाजित किया जा सकता हैचार मुख्य चरण में: (क) या तो पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) या संश्लेषण से जीन के हित टुकड़ा तैयार करना; (ख) एक एडिनोवायरस रीढ़ की हड्डी से जीन के हित टुकड़ा और मुताबिक़ बाहों में शामिल है कि एक शटल प्लाज्मिड में जीन टुकड़ा बंधाव; (ग) द्वारा मुताबिक़ पुनर्संयोजन सह बदलने linearized रीढ़ प्लाज्मिड pAd5 / ΔH5 (जीएल) के साथ 16 जीन के हित टुकड़ा युक्त शटल प्लाज्मिड; (घ) linearized पुनः संयोजक adenoviral प्लाज्मिड के अभिकर्मक एंटीजन के हित के साथ शामिल पुनः संयोजक विज्ञापन वेक्टर बचाव करने के लिए।

हमारे समूह और कुछ अन्य विभिन्न संक्रामक रोगजनकों के खिलाफ विज्ञापन vectored वैक्सीन के विकास के लिए इस विकल्प के विज्ञापन समावेश रणनीति बढ़ा दिया है। हम एक पुनः संयोजक विज्ञापन वेक्टर की पीढ़ी की सूचना दी विज्ञापन HVR1-एलजीएस-उनकी AD5 hexon (hexon5) की HVR1 स्थान में एक उनकी टैग एचआईवी -1 प्रतिजन वी 3 शामिल द्वारा 6 -V3। यह उत्पन्न वेक्टर एसटीआर ट्रिगरवी 3 मिलान करने के लिए 4 विशिष्ट ओंग प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया। हम यह भी hexon5 2 की HVR2 वातावरण में एचआईवी -1 झिल्ली समीपस्थ ectodomain क्षेत्र (MPER) को शामिल करके AD5 / HVR2-MPER-L15ΔE1 के विकास की सूचना दी। इसके अलावा, डॉ झोउ समूह विज्ञापन सीरोटाइप 3 (AD3) vectored टीके, अर्थात। विकसित करने के लिए इस विज्ञापन समावेश रणनीति के लाभ के लिए इस्तेमाल किया गया है, AD3 की HVR1 में Enterovirus 71 के एक निष्क्रिय मिलान SP70 शामिल द्वारा वायरल वेक्टर R1SP70A3 की पीढ़ी hexon (hexon3)। R1SP70A3 Enterovirus 71 चुनौती 15 के खिलाफ संरक्षण की उच्च दर के लिए नेतृत्व जो मिलान SP70 के लिए विशिष्ट मजबूत nabs और IFN-γ उत्पादन, उत्पन्न।

तकनीकी संदर्भ के प्रयोजन के लिए, हमारे अध्ययन HVR1 में एक एचआईवी -1 प्रतिजन को शामिल करके एक द्विसंयोजक AD5 वेक्टर AD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-अपने 6 की पीढ़ी पर ध्यान केंद्रित करने के लिए गुणात्मक एंटीजन Capsid-निगमन रणनीति का फायदा उठाया एकदा hexon5 की HVR5 में उनकी टैग। उत्पन्न वायरल वेक्टर भी immunologically मूल्यांकन किया गया था। एंटीजन Capsid-निगमन रणनीति विभिन्न संक्रामक रोगों के खिलाफ AD5-vectored टीकाकरण दृष्टिकोण के विकास की दिशा में उपयोग किया जा सकता है।

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Protocol

अनुमोदित प्रोटोकॉल संख्या 101109272 के तहत इस के साथ साथ वर्णित के रूप में बर्मिंघम संस्थागत पशु इस्तेमाल और देखभाल समिति में अलबामा के विश्वविद्यालय चूहों के उपयोग को मंजूरी दी।

1. जेनेटिक निर्माण एक संशोधित प्लास्मिड pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-अपने 6 एंटीजन Capsid-निगमन रणनीति के साथ

  1. शटल प्लाज्मिड का निर्माण HVR1-KWAS-HVR5-अपने 6 / pH5S
    1. Hexon5 जीन की AccI करने के लिए प्रतिबंध एंजाइम साइटों AgeI के बीच संश्लेषित डीएनए अनुक्रम HVR1-KWAS युक्त प्लाज्मिड आदेश।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए एंजाइमों AgeI (6 इकाइयों) और AccI (6 इकाइयों) के साथ संश्लेषित टुकड़ा (HVR1-KWAS) के 6 माइक्रोग्राम डाइजेस्ट। वैद्युतकणसंचलन द्वारा एक 2% agarose जेल में पच टुकड़ा हल करने, और निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार एक डीएनए जेल निकालना किट के साथ टुकड़ा शुद्ध।
    3. डालने की दाढ़ अनुपात के आधार पर 3 पर वेक्टर के लिए: 1, टी -4 डीएनए ligase और ligase B उपयोगuffer एक पहले का निर्माण शटल प्लाज्मिड के 100 एनजी में टुकड़ा (HVR1-KWAS) के 12 एनजी ligate को HVR5-अपने 6 / pH5S 2 घंटे के लिए आरटी पर एक 10 μl मात्रा में 17, AgeI और AccI की साइटों के माध्यम से।
    4. (1800 वी पर) एक electroporator में electrocompetent DH5α कोशिकाओं के 50 μl में बंधाव उत्पाद के 10 μl के बाहर 1 μl रूपांतरण। तब्दील DH5α कोशिकाओं को समाज माध्यम के 950 μl जोड़ें और 300 आरपीएम के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए मिश्रण सेते हैं। केनामाइसिन युक्त Luria-Bertani (पौंड) अगर पर 1 मिलीलीटर मिश्रण के 100-200 μl बिखरा हुआ है और 37 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन सेते हैं।
      1. ~ टुकड़ा HVR1-KWAS को लक्षित पीसीआर द्वारा 10 कालोनियों स्क्रीन करने के लिए, आगे प्राइमर (TATGTGTGTCATGTATGCGT) मिश्रण (निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार) एक पीसीआर मास्टर मिश्रण समाधान में प्राइमर (GGAGGCCCACTTGTCCAGCTC) और एक एकल DH5α कॉलोनी रिवर्स। पीसीआर मास्टर मिश्रण समाधान के साथ प्रदान की पुस्तिका का हवाला देते हुए एक thermocycler पर नमूने को चलाने।
      2. खंड 1.1.4.1 में जांच क्लोन में टुकड़ा HVR1-KWAS दृश्य के लिए आगे प्राइमर (TATGTGTGTCATGTATGCGT) का प्रयोग करें।
  2. प्लाज्मिड pAd5 / के निर्माण H5-HVR1-KWAS-HVR5-अपने 6
    1. डाइजेस्ट 6 की माइक्रोग्राम HVR1-KWAS-HVR5-अपने 6/37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए एंजाइमों EcoRI (6 इकाइयों) और PmeI (6 इकाइयों) के साथ pH5S, और मुताबिक़ पुनर्संयोजन हथियारों और दोहरे संशोधित hexon5 जीन युक्त टुकड़ा शुद्ध, के रूप में कदम 1.1.2 में कहा गया है। रीढ़ की हड्डी प्लाज्मिड स्वाई साथ pAd5 / ΔH5 (जीएल) 16 linearize।
    2. शटल प्लाज्मिड से लक्ष्य टुकड़ा के 100 एनजी और (1800 वी पर) एक electroporator में मुताबिक़ पुनर्संयोजन के लिए electrocompetent BJ5183 कोशिकाओं के 50 μl में linearized pAd5 / ΔH5 (जीएल) रीढ़ की हड्डी के 100 एनजी सह बदलना। बदल कोशिकाओं को समाज माध्यम के 950 μl जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस, 300 rpm पर 1 घंटे के लिए मिश्रण सेते हैं। 1 मिलीलीटर मिश्रण के 200 μl - 100 बिखरा37 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन ऊष्मायन के लिए केनामाइसिन (अंतिम 50 माइक्रोग्राम / एमएल) युक्त लेग अगर पर।
      1. उठाओ ~ 3 मिलीलीटर में 10 छोटे कालोनियों एक प्रकार के बरतन (250 आरपीएम, 37 डिग्री सेल्सियस) में हे / एन ऊष्मायन के लिए केनामाइसिन (अंतिम 50 माइक्रोग्राम / एमएल) युक्त तरल पौंड। संस्कृति से प्लास्मिड निकालें। कदम 1.1.4.1 में सचित्र के रूप में, टुकड़ा HVR1-KWAS को लक्षित करके 10 कालोनियों स्क्रीन करने के लिए पीसीआर विश्लेषण का प्रयोग करें।
      2. रीढ़ की हड्डी के जीनोम की PIX टुकड़ा को लक्षित पीसीआर विश्लेषण द्वारा एक ही कालोनियों स्क्रीन करने के लिए आगे प्राइमर (AGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTT) मिश्रण, (निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार) एक पीसीआर मास्टर मिश्रण समाधान में प्राइमर (CCAAACAGAGTCTGGTTTTTTATTTAT) और एक एकल BJ5183 कॉलोनी रिवर्स। पीसीआर मास्टर मिश्रण समाधान के साथ प्रदान की पुस्तिका का हवाला देते हुए एक thermocycler पर नमूने चलाएँ।
      3. PAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-अपने 6 के रूप में पीसीआर डबल सकारात्मक कालोनियों निर्दिष्ट।
    3. में प्लाज्मिड pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-अपने 6 में से 100 एनजी रूपांतरणकदम 1.1.4 में सचित्र के रूप में कोशिकाओं DH5α करने के लिए।
      1. कदम 1.1.4.1 में सचित्र के रूप में, टुकड़ा HVR1-KWAS को लक्षित करके ~ 10 कालोनियों स्क्रीन करने के लिए पीसीआर विश्लेषण का प्रयोग करें।
      2. कदम 1.2.2.2 में सचित्र के रूप में, रीढ़ की हड्डी के जीनोम की PIX टुकड़ा लक्षित करके एक ही कालोनियों स्क्रीन करने के लिए पीसीआर विश्लेषण का प्रयोग करें।
      3. PAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-अपने 6 में टुकड़ा HVR1-KWAS दृश्य के लिए आगे प्राइमर (TATGTGTGTCATGTATGCGT) का प्रयोग करें।

संशोधित AD5 वायरल वेक्टर AD5 / 2. तैयारी H5-HVR1-KWAS-HVR5-अपने 6

  1. उच्च ग्लूकोज के साथ DMEM में एफ बी एस (अंतिम 10%), 100X गैर आवश्यक अमीनो एसिड (अंतिम 0.1 मिमी), 200 मिमी एल glutamine (अंतिम 2 मिमी) और पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान (अंतिम 1%) जोड़कर पूरा मध्यम गठन । (85% humidified शर्तों के तहत 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2) एक संस्कृति इनक्यूबेटर में पूरा मध्यम में मानव भ्रूण गुर्दे (HEK293) कोशिकाओं को बनाए रखने।
  2. वायरल ve का बचावctor AD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-अपने 6
    1. पूरा मध्यम और संस्कृति ओ / एन के 5 मिलीग्राम से युक्त एक टी 25 फ्लास्क में बीज HEK293 कोशिकाओं के 3.0 एक्स 10 6 80% संगम के साथ एक monolayer प्राप्त करने के लिए।
    2. के 15 माइक्रोग्राम linearize pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-अपने 6 3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिबंध एंजाइम Paci (15 इकाइयों) के साथ एक 100 μl मात्रा में।
      1. निकालें linearized pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-अपने 6 फिनोल के एक बराबर मात्रा के साथ (1 मिनट के लिए 10,000 XG) दो बार प्रतिक्रिया centrifuging द्वारा: क्लोरोफॉर्म: में एक धूआं हुड isoamyl शराब (: 24 1 25 में अनुपात) और एक मिश्रित समाधान (100% इथेनॉल के 300 μl और सोडियम एसीटेट के 10 μl) और 70% इथेनॉल के 700 μl के साथ अनुक्रमिक centrifugation के (10 मिनट के लिए 10,000 XG) द्वारा। प्रत्येक centrifugation कदम पर सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    3. में शुद्ध प्लाज्मिड ~ आसुत जल या Tris EDTA (ते) बफर के 40 μl Resuspend। ऑप्टिकल डे को मापने के द्वारा प्लास्मिड डीएनए quantitatensity 260 एनएम (ओवर ड्राफ्ट)।
    4. निर्माता की पुस्तिका के अनुसार, टी 25 फ्लास्क में वाणिज्यिक liposomal अभिकर्मक अभिकर्मक के साथ linearized प्लाज्मिड के 3 माइक्रोग्राम transfect। 6 बजे संस्कृति इनक्यूबेटर में बाद अभिकर्मक और बाद में ऊष्मायन पर पूरा मध्यम के साथ अभिकर्मक मध्यम बदलें। व्यक्ति वायरल सजीले टुकड़े फार्म तक, हर दो से तीन दिन पूरा मध्यम जगह से ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को बनाए रखने।
    5. सजीले टुकड़े पूर्ण कोशिकाविकृति संबंधी प्रभाव (सीपीई) को विकसित करते हैं, तो एक बाँझ हुड में कुप्पी बंद शेष कोशिकाओं परिमार्जन, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर मध्यम centrifuging द्वारा फसल सेल lysate। 2% FBS युक्त मध्यम की ~ 1 मिलीलीटर में सेल गोली निलंबित, और फ्रीज विगलन चार गुना की कोशिकाओं को तोड़ने। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 10,000 XG पर lysate centrifuging के बाद बचाया वायरस युक्त सतह पर तैरनेवाला लीजिए।
  3. वायरल वेक्टर AD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-अपने 6 के बड़े पैमाने पर प्रचार
    1. वें प्रचारटी 25 कुप्पी से भरा lysate के लिए 1/3 के साथ संक्रमण से बाँझ हुड में HEK293 कोशिकाओं से युक्त एक टी -75 फ्लास्क में ई वायरस। पूर्ण सीपीई संस्कृति इनक्यूबेटर में दो से तीन दिन के भीतर विकसित करने के लिए अनुमति दें। कदम 2.2.5 में कहा गया है lysate सतह पर तैरनेवाला हार्वेस्ट।
    2. वायरस प्रचार की स्थिति पर निर्भर करता है, टी -75 कुप्पी से भरा lysate के लिए 1/2 के साथ संक्रमण से बाँझ हुड में तीन टी-175 बोतल में वायरस प्रचार। पूर्ण सीपीई संस्कृति इनक्यूबेटर में दो से तीन दिन के भीतर विकसित करने के लिए अनुमति दें। कदम 2.2.5 में कहा गया है lysate सतह पर तैरनेवाला हार्वेस्ट।
    3. पिछले टी-175 कुप्पी (एस) से पूर्ण lysate के लिए 1/2 के साथ संक्रमण से बाँझ हुड में एक दर्जन या अधिक टी-175 बोतल में वायरस प्रचार। वायरस प्रचार की स्थिति और जरूरत में वायरस की मात्रा के आधार पर कुप्पी के उपयोग की मात्रा का निर्धारण करते हैं। पूर्ण सीपीई संस्कृति इनक्यूबेटर में दो से तीन दिन के भीतर होता है जब कदम 2.2.5 में कहा गया है lysate सतह पर तैरनेवाला हार्वेस्ट।
  4. Purifसीज़ियम क्लोराइड द्वारा AD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-अपने 6 की ication
    1. 5 मिमी HEPES में CSCL के समाधान के दो घनत्व तैयार: 1.33 मिलीग्राम / छ और 1.45 ग्राम / मिलीलीटर, CSCL के साथ संपर्क से परहेज।
    2. CSCL का लोड 4 मिलीलीटर एक बाँझ ultracentrifuge ट्यूब में (1.33 ग्राम / एमएल), और धीरे ट्यूब के नीचे के खिलाफ CSCL के 4 मिलीलीटर (छ / एमएल 1.45) लोड। लोड धीरे धीरे बाँझ हुड में ढ़ाल के शीर्ष पर lysate सतह पर तैरनेवाला के 4 मिलीलीटर।
    3. दोषपूर्ण / उच्च वायरस बैंड से परिपक्व / कम वायरस बैंड अलग करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए 110,000 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र। एक 33 जी सुई के साथ हथियारों से लैस एक 3 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कम बैंड लीजिए और बाँझ हुड में एक 4 मिलीलीटर मात्रा करने के लिए 5 मिमी HEPES के साथ बैंड पतला।
    4. कदम 2.4.2 में वर्णित के रूप में दो CSCL समाधान के घनत्व और वायरस का पतला बैंड के साथ एक और ट्यूब लोड करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 110,000 XG हे / एन पर ट्यूब अपकेंद्रित्र। कदम 2.4.3 में वर्णित के रूप में वायरल बैंड लीजिए।
    5. एक dialys में एकत्र वायरस समाधान इंजेक्षनबाँझ हुड में एक 33 जी सुई के साथ हथियारों से लैस एक 3 मिलीलीटर सिरिंज से कैसेट है।
    6. 1x डायलिसिस बफर के 700 मिलीलीटर में कैसेट प्लेस (1 एल नुस्खा: 10x पीबीएस के 100 मिलीलीटर, 100% ग्लिसरॉल के 100 मिलीलीटर और आसुत पानी की 800 मिलीलीटर, 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से बफर फिल्टर) और डायलिसिस बफर की जगह हर 3 4 बार के लिए बजे। Needled सिरिंज का उपयोग कर dialyzed वायरस समाधान बाहर aspirate।

बचाया वायरल वेक्टर 3. मान्यकरण

  1. वायरल वेक्टर अनुमापन
    1. 10 और 1: वायरस शारीरिक अनुमापांक के लिए, वायरस और 1 पर डायलिसिस बफर (पृष्ठभूमि नियंत्रण) दोनों को कमजोर वायरस lysis बफर में 20 (10% एसडीएस में Tris-EDTA) छोटे ट्यूबों में, और के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर सभी ट्यूबों सेते दस मिनट।
    2. एक biophotometer पर मुड़ें और आयुध डिपो 260 एनएम पर absorbance के मोड सेट। "रिक्त" नीचे क्लिक करके पृष्ठभूमि संकेत संतुलन के लिए: पतला डायलिसिस बफर (10 1) का प्रयोग करें। Biophotometer SCR में टाइप करें "10 90"een है, और पतला वायरस का संकेत (: 10 1) पढ़ा।
    3. कदम 3.1.2 में विधि का पालन करते हुए, लेकिन इसके बजाय biophotometer स्क्रीन में "5 + 95" टाइप करें: पतला वायरस का संकेत (20 1) पढ़ें। 1.1x10 12 से दो वायरस readout के संख्याओं का गुणा और दो ​​dilutions से दो अलग-अलग titers के आधार पर वी.पी. / मिलीलीटर के रूप में एक इकाई है, के साथ औसत अनुमापांक गणना।
    4. वायरस संक्रामक अनुमापांक (आईपी / एमएल) के लिए, 10 दिनों के बाद संक्रमण पर HEK293 कोशिकाओं पर संक्रमण गहराई निर्धारित करने के लिए KARBER सांख्यिकीय TCID 50 विधि 14 का उपयोग करें (डीपीआई)
  2. वायरल वेक्टर पर प्रतिजनी लोगों तक पहुंचाने के प्रदर्शन का मूल्यांकन
    1. कोट एक एलिसा थाली में वायरल वेक्टर और एक मानक एलिसा विधि 14 में दिए चरणों के बाकी के साथ आगे बढ़ें। निगमित एंटीजन 14 इसी का पता लगाने के लिए मानव विरोधी gp41 (2F5) मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी) और माउस विरोधी उनकी टैग mAb का प्रयोग करें।
    2. एक denatu में वायरल वेक्टर का समाधान करेंलाल प्रोटीन जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस पृष्ठ) और एक मानक पश्चिमी धब्बा विधि 14 में दिए चरणों के बाकी के साथ आगे बढ़ें। निगमित एंटीजन 14 इसी का पता लगाने के लिए मानव विरोधी gp41 (2F5) मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी) और माउस विरोधी उनकी टैग mAb का प्रयोग करें।
  3. AD5-positve सीरा को बायपास करने की क्षमता पर वेक्टर के लिए इन विट्रो मूल्यांकन में
    1. संस्कृति इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 85 के तहत% humidified शर्तों) में पूरा मध्यम में HELA कोशिकाओं को बनाए रखें। एफ बी एस (अंतिम 10%), 200 मिमी एल glutamine (अंतिम 2 मिमी) और न्यूनतम आवश्यक मध्यम ईगल (MEME) में पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान (अंतिम 1%) जोड़कर पूरा मध्यम गठन।
    2. 1x10 6 कोशिकाओं में 6 अच्छी तरह प्लेटें में बीज HELA कोशिकाओं / अच्छी तरह से, और 2 घंटे के लिए संस्कृति इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 85 के तहत% humidified शर्तों) में प्लेटें सेते हैं। (वायरल वेक्टर के 5 आईपी / सेल के साथ AD5 पॉजिटिव सीरा (0.1 μl या 0 μl) सेतेAD5 या AD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-उनका 1 घंटे के लिए संस्कृति इनक्यूबेटर में 6) युक्त कोशिकाओं 6 अच्छी तरह से प्लेटों पर मिश्रण जोड़ने से पहले।
    3. 24 बजे (HPI) संक्रमण पद पर, lysis बफर के 0.5 मिलीलीटर में एक बार पीबीएस और lyse कोशिकाओं के साथ कोशिकाओं कुल्ला। 5 मिनट के लिए 15,000 XG पर अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा। वायरस luciferase जीन होते हैं, luciferase संकेत पढ़ने के लिए luciferase सब्सट्रेट के 100 μl के साथ सतह पर तैरनेवाला के 20 μl मिलाएं।

बचाया वायरल वेक्टर 4. रोग प्रतिरक्षण मूल्यांकन

  1. AD5 और AD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-अपने 6: दो प्रतिरक्षण समूहों तैयार करें।
    1. 2 सप्ताह के अंतराल के साथ, एक मुताबिक़ "प्रधानमंत्री को बढ़ावा देने के" प्रतिरक्षण आहार में, 1x10 10 वी.पी. / माउस पर वायरस के साथ intramuscularly (एन = 8 / समूह) चूहों इंजेक्षन।
    2. 2 सप्ताह के हर इंजेक्शन पद पर, पशु lancets (5 मिमी टिप लंबाई) के साथ खून बह रहा गाल द्वारा संज्ञाहरण के बिना चूहों खून बहाना1.5 मिलीलीटर ट्यूब में रक्त इकट्ठा।
  2. ऊपर और नीचे inverting और द्वारा नलियों में रक्त मिश्रण है, और 30 मिनट के लिए आरटी पर खून सेते हैं। 5 4 डिग्री सेल्सियस न्यूनतम और नया 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों के लिए स्थानांतरण सीरा (ऊपर परत) के लिए 10,000 XG पर ट्यूब स्पिन।
    1. 5 4 डिग्री सेल्सियस न्यूनतम और स्थानांतरण सीरा के लिए 10,000 XG पर नए ट्यूबों स्पिन नव -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के लिए 1.5 मिलीलीटर ट्यूब के रूप में चिह्नित करने के लिए।
  3. सीरा-आधारित एलिसा द्वारा विशिष्ट प्रतिजन humoral उन्मुक्ति का मूल्यांकन
    1. उनका पेप्टाइड (1 मिमी पर शेयर) और एचआईवी -1 पेप्टाइड (1 मिमी पर शेयर) को अलग-अलग 100 में पतला।
    2. मिमी कार्बोनेट बफर (पीएच 9.5) 10 माइक्रोन से कम पेप्टाइड कोटिंग एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए। कोट अलग से 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों हे / एन अच्छी तरह से प्रति 100 μl जोड़ने और incubating द्वारा पतला पेप्टाइड्स के साथ एलिसा प्लेटें।
    3. PBST में 5% BSA में 1 घंटे के लिए 200 / अच्छी तरह से μl और ब्लॉक से कम चार बार के लिए PBST के साथ प्लेटें धो लें। 1 पर प्लेटों के लिए चूहों सीरा लागू करें: 100 कमजोर पड़ने अवरुद्ध buf मेंfer, 100 μl / अच्छी तरह से। आरटी पर 2 घंटे ऊष्मायन के लिए सेते हैं।
    4. चार बार के लिए PBST के साथ प्लेटें धो लें। / अच्छी तरह से 100 μl पर अवरुद्ध बफर में 30 मिनट के लिए आरटी पर incubating द्वारा प्लेटों अवरुद्ध करें।
    5. 100 μl में / अच्छी तरह से व्यक्तिगत रूप से उनका पेप्टाइड और एचआईवी -1 पेप्टाइड के साथ लेपित प्लेट दोनों के लिए: (अवरुद्ध बफर में 5000 1) बकरी विरोधी माउस आईजीजी एचआरपी लागू करें। आरटी पर 2 घंटे के लिए सेते हैं। PBST के साथ प्लेटें धो लें।
    6. 30 मिनट के लिए एचआरपी सब्सट्रेट के साथ incubating के बाद OD450 एनएम पर प्लेटें पढ़ें।

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Representative Results

एंटीजन Capsid-निगमन रणनीति (चित्रा 1 ए) द्विसंयोजक AD5 वायरल वेक्टर AD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-अपने 6 उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया गया था। सबसे पहले, शटल प्लाज्मिड HVR1-KWAS-HVR5-अपने 6 / pH5S पिछले निर्माण शटल प्लाज्मिड HVR5-अपने 6 / pH5S 17 में HVR1-KWAS टुकड़ा subcloning द्वारा निर्माण किया गया था। दूसरे, प्लाज्मिड pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-अपने 6 14 "EcoRI-HVR1-KWAS-HVR5-His6-PmeI" का टुकड़ा और स्वाई-linearized pAd5 / ΔH5 के बीच एक मुताबिक़ पुनर्संयोजन द्वारा निर्माण किया गया (जीएल ) 16 (चित्रा 1 बी)। PACI के अभिकर्मक पच pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-उनकी वायरल वेक्टर AD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-अपने 6 से 14 के बचाव के लिए एक टी 25 फ्लास्क नेतृत्व में 6। बचाया वायरल वेक्टर तो एक बड़े पैमाने में प्रचारित और CSCL ढाल ultracentrifuge के दो चक्रों से शुद्ध किया गया था।

के लिएAD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-अपने 6, शारीरिक अनुमापांक वायरल जीनोम के भौतिक प्रतियों को मापने के द्वारा / एमएल 1.3 एक्स 10 11 वीपी पर निर्धारित किया गया था बचाया वायरल वेक्टर की व्यवहार्यता / फिटनेस का प्रदर्शन, और संक्रामक अनुमापांक था वास्तविक संक्रामक वायरल कणों titrating से 1.4 एक्स 10 9 आईपी / मिलीलीटर पर निर्धारित की। वी.पी. / आईपी अनुपात बाद में 92 14। आम तौर पर गणना की गई, 1000 के नीचे एक वी.पी. / आईपी अनुपात के साथ एक विज्ञापन इस वायरस का एक गुणात्मक फिटनेस इंगित करता है। इस बचाया वायरस प्रतिजनी एचआईवी प्रतिजन और वायरल कैप्सिड प्रमुख प्रोटीन hexon5 की सतह पर क्रमशः उनकी टैग प्रदर्शित करता है कि क्या प्रदर्शित करने के लिए आदेश में, एलिसा क्रमशः मानव 2F5 mAb और माउस विरोधी उनकी टैग mAb, के साथ शुरू किया गया था। परिणाम नहीं था, जबकि दोनों मानव 2F5 mAb (2A चित्रा) 14 और माउस विरोधी उनकी टैग mAb (चित्रा 2 बी) 14, AD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-अपने 6 के लिए बाध्य करने से पता चला कि संकेत दिया कोई नकारात्मक विवाद के लिए बाध्यएल वेक्टर AD5। पश्चिमी धब्बा विश्लेषण केवल वायरस AD5 में दोनों मानव 2F5 mAb (चित्रा -2) 14 और माउस विरोधी उनकी टैग mAb (चित्रा 2 डी) 14 का पता चला है, के रूप में एलिसा में डेटा पुष्टि करने के लिए 117 केडीए के आसपास विशिष्ट बैंड इस्तेमाल किया गया था / H5- HVR1-KWAS-HVR5-अपने 6, hexon5 प्रोटीन के आकार से मेल खाती है। की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए आदेश में AD5 / प्रोटोकॉल खंड 3.3 में कहा गया है H5-HVR1-KWAS-HVR5-अपने 6 AD5 पॉजिटिव सीरा द्वारा निराकरण circumventing में, निराकरण परख विश्लेषण किया गया। परिणामों के सापेक्ष luminescent इकाई AD5-positve सीरा के 0 μl के साथ इलाज किया वायरल वेक्टर AD5 से (RLU) संकेत AD5-positve सीरा के 0.1 μl (पी मूल्य <0.001 के साथ इलाज एक ही वेक्टर से अपेक्षा है कि 12 गुना अधिक है पता चला है कि )। इस AD5-positvive सीरा द्वारा वेक्टर AD5 के निराकरण का सुझाव दिया। इसके विपरीत, वायरल वेक्टर AD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-अपने 6 से थोड़ा अंतर था0 μl और AD5-positve सीरा के 0.1 μl (चित्रा 3) के साथ इलाज किया। Hexon को निष्क्रिय epitopes hexon 12,18 के सभी HVRs में रहते प्रमुख विज्ञापन nabs का लक्ष्य है, और hexon-विशिष्ट है के बाद से, डेटा से ऊपर AD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-अपने 6 AD5-positve सीरा द्वारा निराकरण भाग निकले प्रदर्शन किया है कि की क्षमता इन विट्रो में और सुझाव दिया AD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-अपने 6 की मेजबानी में AD5 पी circumventing पर।

एंटीजन Capsid-निगमन रणनीति के साथ संशोधित द्विसंयोजक AD5 वायरल वेक्टर शामिल किया एंटीजन के हित के लिए विशिष्ट मजबूत humoral रोगक्षमता बटोर सकता है कि क्या जांच करने के लिए, "प्रधानमंत्री को बढ़ावा देने के" प्रतिरक्षण आहार नियंत्रण वायरल वेक्टर AD5 और चूहों के साथ पोलियो के लिए लागू किया गया था द्विसंयोजक वेक्टर AD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-अपने 6। एचआईवी -1 पेप्टाइड के साथ लेपित सीरा-आधारित एलिसा AD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-अपने 6 के टीकाकरण समूह से सीरा significan पता चला था किनियंत्रण समूह (पी मूल्य <0.001) (चित्रा -4 ए) 14 से सीरा की तुलना में जब टी, 40 और 640 के बीच dilutions में एचआईवी -1 पेप्टाइड के लिए बाध्य। उनका पेप्टाइड के साथ लेपित एलिसा सीरा आधारित नियंत्रण समूह से सीरा की तुलना में जब AD5 / के टीकाकरण समूह से सीरा H5-HVR1-KWAS-HVR5-अपने 6 सांख्यिकीय पी मूल्य के रूप में, उनकी पेप्टाइड के लिए बाध्य महत्वपूर्ण पता चला था कि < एक 320 कमजोर पड़ने (चित्रा 4 बी) 14 में 160 और पी मूल्य 0.05 <के कमजोर पड़ने पर 40 और 80, पी मूल्य 0.01 <की सीरा dilutions पर 0,001। ऊपर दिए गए परिणामों द्विसंयोजक वायरल वेक्टर पर शामिल एंटीजन के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की पीढ़ी का संकेत दिया।

चित्र 1
एंटीजन Capsid-निगमन रणनीति के साथ प्लाज्मिड pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-अपने 6 की आनुवंशिक निर्माण की चित्रा 1. योजनाबद्ध चित्र। (ए) एंटीजन Capsid-निगमन रणनीति सीधे प्रतिजन के हित adenovirus के कैप्सिड प्रोटीन (hexon, PENTA बेस के साथ, PIX और / या फाइबर) पर प्रदर्शित की विशेषता है। यह आंकड़ा Nemerow से अनुकूलित किया गया था एट अल।, 2009 विषाणु विज्ञान 384 (2009) 380-388, कॉपीराइट एल्सेविअर। (बी) के जीन टुकड़ा (HVR1-KWAS) संश्लेषित और एक कंपनी द्वारा एक पीयूसी वेक्टर में क्लोन किया गया था। यह टुकड़ा HVR5-उनका प्रतिबंध से 6 / pH5S AgeI और AccI HVR1-KWAS-HVR5-अपने 6 / pH5S उत्पन्न एंजाइमों को पहले से निर्माण शटल प्लाज्मिड में subcloned किया गया था। जिसके परिणामस्वरूप शटल प्लाज्मिड recombined रीढ़ प्लाज्मिड pAd5 / H5-HVR1-KWAS की पीढ़ी में जिसके परिणामस्वरूप, एंजाइम EcoRI और PmeI, और सह तब्दील स्वाई-linearized रीढ़ प्लाज्मिड pAd5 / ΔH5 (जीएल) के साथ मुताबिक़ पुनर्संयोजन के लिए के साथ पचा किया गया था -HVR5-अपने 6। इस चित्र में, आर 1 HVR1 अर्थ और आर 5 HVR5 अर्थ है, और जीएल हरी प्रतिदीप्ति प्रोटीन (GFP) और lucife अर्थचुनना, अलग से। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
द्विसंयोजक वायरल वेक्टर के कैप्सिड सतह पर शामिल एंटीजन की प्रतिजनी जोखिम के चित्रा 2. मूल्यांकन AD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-अपने निगमित एंटीजन वेक्टर पर अवगत कराया गया कि अगर एलिसा निर्धारित करने के लिए किया गया था 6। साबुत वायरल वेक्टर सतह के लिए अपने स्वयं के प्रतिजनी विशेषताओं को बनाए रखने। एलिसा प्लेटें द्विसंयोजक वेक्टर के साथ लेपित, और मानव 2F5 mAb (ए) या ​​माउस विरोधी उनकी mAb (बी) के साथ incubated रहे थे। डाटा नहीं बल्कि नियंत्रण वेक्टर AD5 करने के लिए, द्विसंयोजक वेक्टर के लिए एंटीबॉडी के महत्वपूर्ण बंधन का संकेत दिया। आर 1-KWAS-आर 5-अपने 6 AD5 / H5 के अर्थ-HVR1-KWAS-HVR5-अपने 6। पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्विसंयोजक वेक्टर पर शामिल एंटीजन को मानव 2F5 mAb (सी) या माउस विरोधी उनकी mAb (डी) के बंधन प्रतिजनी पुष्टि करने के लिए प्रदर्शन किया था। दोनों (सी) और (डी) में, लेन 1 AD5 इंगित करता है, और 2 लेन का संकेत AD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-अपने 6। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
AD5-positve सीरा में इन विट्रो। निराकरण परख द्वारा निराकरण बचने के लिए द्विसंयोजक वायरल वेक्टर की क्षमता का चित्रा 3. मूल्यांकन द्विसंयोजक वेक्टर निराकरण बच सकता है, तो यह निर्धारित करने के लिए किया गया था। परिणाम सीरा द्वारा AD5 वायरस का निराकरण संकेत दिया है, लेकिन तोंइन विट्रो में द्विसंयोजक वायरस के निराकरण के केप। इस चित्र में, आर 1-KWAS-आर 5-अपने 6 AD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-अपने 6 अर्थ। तारक *** पी मूल्य 0.001 <अर्थ।

चित्रा 4
चूहों मॉडल में द्विसंयोजक वायरल वेक्टर द्वारा humoral रोगक्षमता की विवो पीढ़ी में 4 चित्र। एलिसा सीरा-आधारित द्विसंयोजक वेक्टर AD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-अपने 6 पर शामिल प्रोटीन के खिलाफ humoral उन्मुक्ति का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । एचआईवी -1 पेप्टाइड (ए) और उसकी पेप्टाइड (बी) के दो प्रतिरक्षण समूहों से चूहों सीरा के साथ ऊष्मायन द्वारा पीछा किया, अलग से एलिसा प्लेटों में लेपित रहे थे (AD5 और AD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-अपने 6) । डाटा एच में एचआईवी -1 प्रतिजन के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के महत्वपूर्ण पीढ़ी संकेत दियाVR1 (ए) और HVR5 में उनकी टैग (बी)। प्रत्येक डेटा बिंदु का मतलब है और आठ प्रतिकृति से एसडी प्रतिनिधित्व करता है। तारक *** पी ** मूल्य 0.01 <अर्थ है, और * पी मूल्य 0.05 <अर्थ, पी मूल्य 0.001 <अर्थ।

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Discussion

टीके के विकास के लिए AD5 संशोधन पर पारंपरिक transgene रणनीति के आवेदन के कारण मुख्य रूप से AD5 पी 4,6 के साथ जुड़े टोंटी को कम किया गया है। इस टोंटी आंशिक रूप से इस रणनीति AD5 nabs द्वारा निराकरण बचने कर सकते हैं के बाद से एंटीजन के हित के साथ AD5 के निष्क्रिय करने epitopes की जगह से, वैकल्पिक एंटीजन Capsid-निगमन रणनीति (चित्रा 1 ए) के आवेदन के द्वारा कम हो गई है, और मजबूत प्रतिरक्षा की पीढ़ी की सुविधा किया जा सकता है निगमित एंटीजन के हित के लिए। इस अध्ययन में, संशोधित द्विसंयोजक वायरल वेक्टर की पीढ़ी AD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-अपने 6 एक वैचारिक उदाहरण (चित्रा 1 बी) के रूप में पेश किया गया था। प्रोटोकॉल खंड 1.1.1 के अनुरूप, आदेश दिया प्लाज्मिड में संश्लेषित टुकड़ा hexon5 की HVR1 स्थान में एक एचआईवी -1 gp41 कम जीन प्रतिस्थापन शामिल हैं। आंशिक gp41 जीन विकल्प है, जो एक मिलान ELDKWAS, encodesअमीनो एसिड hexon5 14 की 139-144 से आंशिक HVR1। ELDKWAS एचआईवी -1 gp41 19 में एक शक्तिशाली निष्क्रिय मिलान है।

क्लोनिंग के दौरान दो महत्वपूर्ण कदम उठाए थे। प्रोटोकॉल खंड 1.1.1 में जीन टुकड़ा ब्याज synthesizing जब एक कदम दो प्रतिबंध एंजाइमों का चयन किया गया। दो एंजाइमों का चयन सशर्त संशोधित किया जा करने के लिए विज्ञापन कैप्सिड के स्थान, अर्थात् पर निर्भर करता है। इस अध्ययन में, KWAS युक्त जीन टुकड़ा hexon5 प्रोटीन की HVR1 में शामिल करने के लिए नामित किया गया था। प्रतिबंध AgeI और AccI एन टर्मिनल और सी टर्मिनल HVR1 स्थान के क्षेत्रों flanking पर अलग से मौजूद हैं, और, इस प्रकार AgeI और AccI व्यक्तिगत रूप से एन टर्मिनस और सी में रखा जाना करने के लिए चुना गया टुकड़ा HVR1-KWAS में मौजूद नहीं है एंजाइमों संश्लेषित टुकड़ा HVR1-KWAS की टर्मिनस। Hexon को निष्क्रिय epitopes hexon 12,18 के सभी HVRs में रहते प्रमुख विज्ञापन nabs का लक्ष्य है, और hexon-विशिष्ट है के बाद से, यह संभव है कि वेंएंटीजन Capsid-निगमन रणनीति के साथ ई hexon संशोधित AD5 वैक्टर इन विट्रो में AD5 पॉजिटिव सीरा द्वारा निराकरण बायपास करने की क्षमता हासिल है, और मेजबान में भी AD5 पी सकता है। इस अध्ययन में, द्विसंयोजक वायरल वेक्टर पर दोनों HVR1 और HVR5 AD5 पॉजिटिव सीरा द्वारा निराकरण के भागने के लिए योगदान कर सकता है। अन्य महत्वपूर्ण कदम प्रोटोकॉल खंड 1.2.2 में था। लेग अगर पर सह तब्दील मिश्रण के हे / एन ऊष्मायन के बाद, बड़े हो BJ5183 कालोनियों हे / N के लिए तरल लेग में तुरंत सुसंस्कृत होने की जरूरत है, और प्लास्मिड तुरंत रूप में अच्छी तरह BJ5183 कोशिकाओं से निकाले जाने की जरूरत है। BJ5183 कोशिकाओं में recombined प्लाज्मिड स्थिर नहीं है, क्योंकि प्रक्रियाओं में देरी होने की संभावना है, संभावित पुनर्संयोजन और परिवर्तन को बढ़ावा मिलेगा। मुताबिक़ पुनर्संयोजन से सही प्लाज्मिड एक स्थिर और सही जीनोम प्रजातियों को बनाए रखने के क्रम में DH5α में तब्दील किया जाना चाहिए।

क्लोनिंग के बाद, दो और महत्वपूर्ण कदम उठाए थे।प्रोटोकॉल अनुभाग में पहला कदम अभिकर्मक के बारे में है। यह रीढ़ की हड्डी प्लाज्मिड E1 के जीन को नष्ट कर दिया है, तो AD5 ई 1 (HEK293) व्यक्त कि कोशिकाओं में recombined विज्ञापन रीढ़ प्लाज्मिड transfect करने के लिए आवश्यक है। प्रोटोकॉल खंड 2.3 में अन्य कदम वायरस बढ़ाने के बारे में है। वायरस बढ़ाने के लिए बुनियादी प्रक्रिया टी -75 बोतल के लिए और टी-175 बोतल के लिए एक टी 25 कुप्पी से मानक वायरस बढ़ाने के सिद्धांत को मानता है। हालांकि उपयोग के लिए बोतल (टी -75 और / या टी-175) की संख्या वायरस, वायरस के संक्रमण की वजह से सीपीई विकास, और जरूरत के वायरस की राशि के विकास की गति पर निर्भर करता है।

एंटीजन Capsid-निगमन रणनीति विज्ञापन संशोधनों पर व्यापक आवेदन के लिए अनुमति देता है। इस रणनीति के साथ, इसे संशोधित करने या ऐसे hexon 2,4,20, Penton आधार 21 और फाइबर के रूप में 22 अलग कैप्सिड प्रमुख प्रोटीन, पर heterologous एंटीजन शामिल करने के लिए संभव है। कैप्सिड नाबालिग प्रोटीन PIX सी टर्मिनस भी heterol के लिए वादा दिखायाogous प्रतिजन / पेप्टाइड समावेश 21,23। एकल संशोधन के अलावा, इस रणनीति के साथ विज्ञापन पर कई संशोधनों को भी सफलता हासिल की। उदाहरण द्विसंयोजक की पीढ़ी के हैं AD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-अपने 6 HVR1 और hexon5 की HVR5, और HVR1 और HVR2 या HVR1 और किसी में Enterovirus प्रकार 71 में से दो को निष्क्रिय epitopes का समावेश दोनों में incorporations के द्वारा इस अध्ययन में HVR4, या HVR1 और hexon3 24 की HVR5। ये उदाहरण जीन थेरेपी या टीकाकरण दृष्टिकोण या तो के उद्देश्य के लिए विज्ञापन की अन्य सीरमप्रकारों में hexon संशोधनों की व्यवहार्यता, मतलब। हमारे डेटा भी hexon और PIX (अप्रकाशित डेटा) में दो ट्रिपैनोसोमा cruzi epitopes के incorporations का प्रदर्शन किया। यह रणनीति भी टीकाकरण या जीन थेरेपी दृष्टिकोण के लिए या तो काइमेरिक विज्ञापन वैक्टर बनाने के लिए बढ़ा दिया गया है। उदाहरण hexon3 16 के साथ hexon5 स्विचन द्वारा काइमेरिक Ad5H3 की पीढ़ी के हैं, काइमेरिक Ad3H7 की पीढ़ी hexon3 वाई स्विचन द्वारावें 25 hexon7, और Ad4 फाइबर 26 के साथ AD5 फाइबर की जगह से काइमेरिक Ad5F4 की पीढ़ी।

इस अध्ययन में, द्विसंयोजक AD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-अपने 6 निगमित एंटीजन के हित के लिए विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के जानने का प्रदर्शन किया। हमारे वर्तमान परियोजना ASP2-विशिष्ट CD8 टी सेल प्रतिक्रिया काफी एंटीजन Capsid-निगमन रणनीति के साथ, प्रोटीन नौवीं AD5 की (PIX) में ASP2 पेप्टाइड शामिल द्वारा उत्पन्न किया गया था, जो एक वेक्टर AD5-PIX-ASP2, साथ प्रतिरक्षण द्वारा primed है कि यह दर्शाता है (डाटा नहीं दिखाया गया)। ASP2, भी amastigote सतह प्रोटीन 2 नाम दिया है, digenetic इंट्रासेल्युलर प्रोटोजोआ परजीवी ट्रिपैनोसोमा cruzi (टी cruzi) 27 के एक immunodominant प्रतिजन है। यह नया प्रयोगात्मक खोज विज्ञापन vectored टीके पर एंटीजन Capsid-निगमन रणनीति के आवेदन सेलुलर Immun भी न केवल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया बटोर सकते हैं, लेकिन लगता है कि हमारे ज्ञान का विस्तारएंटीजन के हित के लिए विशिष्ट ई के हिमायती हैं।

पारंपरिक transgene रणनीति के लिए तुलनात्मक रूप से लाभप्रद है, एंटीजन Capsid-निगमन रणनीति भी तीन नुकसान है। सबसे पहले, यह लंबे समय के रूप में पारंपरिक रणनीति के रूप में करता जीन के हित के समावेश की अनुमति नहीं कर सकते हैं। यह hexon5 पर एंटीजन Capsid-निगमन रणनीति एक अधिकतम 80 अमीनो एसिड HVR1 में (एए), HVR5 में 77 एए और HVR2 2 में 57 एए के सम्मिलन के लिए अनुमति देता है कि सूचना दी गई है। जिसमें से HVR1 शामिल करने के लिए सबसे अनुमोदक स्थान है। हालांकि, नाबालिग कैप्सिड प्रोटीन PIX 1,000 अमीनो एसिड 28 की एक प्रविष्टि को समायोजित कर सकते हैं। दूसरा, कुछ एंटीजन के हित प्रकृति में होने वाले विज्ञापन वायरस की संरचनात्मक व्यवस्था को बाधित करने लगते हैं जो इस तरह के आरोपों और अमीनो एसिड होता है, की ताकतों के रूप में कारकों करने के लिए विज्ञापन कैप्सिड प्रोटीन में शामिल करने में असफल। इस मामले में, उचित spacers के परिचय वें मदद मिल सकती है एंटीजन के हित से जुड़ा हुआई सफल समावेश 4। तीसरा, कुछ HVR स्थलों में incorporations, अर्थात।, HVR6 या HVR7 व्यवहार्य वायरल वैक्टर 12 की असफल पीढ़ी के लिए ले जा सकता है। फायदे और दोनों रणनीतियों के नुकसान को देखते हुए दोनों रणनीतियों में से दो रणनीतियों से एक बुद्धिमान चयन या एक संयोजन विशिष्ट परिस्थितियों / जरूरतों पर निर्भर करेगा। रणनीतियों दोनों तलाशी का एक उदाहरण है, AD5 / HVR2-MPER-l15 (चुप) की पीढ़ी है जिससे झिल्ली-समीपस्थ बाहरी क्षेत्र एंटीजन Capsid-निगमन रणनीति के साथ hexon5 की HVR2 में शामिल एचआईवी -1 gp41was की (MPER), और एचआईवी -1 चुप जीन पारंपरिक transgene रणनीति 2 के साथ AD5 की ई 1 जीन स्थान को बदलने के लिए डाला गया था।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

स्वास्थ्य 5T32AI7493-20 और 5R01AI089337-03 अनुदान का यह काम राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया था। funders के अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x DPBS Thermo Scientific SH30256.01 for cell spliting 
10x DPBS Thermo Scientific SH30378.02 for dialysis buffer preparation
glycerol SIGMA G5516-1L for dialysis buffer preparation
SDS BIO-RAD 161-0301 for virus lysis buffer preparation
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Scientific SH30910.03 component of culture medium
100x Non-Essential Amino Acids  Thermo Scientific SH30238.01 component of culture medium
200 mM L-glutamine Cellgro 25-005-CI component of culture medium
penicillin/streptomycin solution  Cellgro 30-002-CI component of culture medium
DMEM with high glucose Thermo Scientific SH30081.01 for HEK293 cell culture
Minimum Essential Medium Eagle SIGMA M5650 for HeLa cell culture
phenol:chloroform:isoamyl alcohol  SIGMA P3803-100ML for large size of DNA purification
cesium chloride  Research Products International Corp. C68050 for virus purificiation
HEPES Cellgro 25-060-CI for CsCl solution preparation
HEK293 ATCC 51-0036 for virus rescue and upscale
HeLa ATCC CCL-2 for neutralization assay
T-25 flask Thermo Scientific 156367 for cell culture 
T-75 flask CORNING 430641 for cell culture 
T-175 flask Thermo Scientific 159910 for cell culture 
Ultracentrifuge BECKMAN NA for virus purification
Ultracentrifuge tube BECKMAN 344059 for virus purification
dialysis cassette  Thermo Scientific 66380 for virus dialysis
ELISA plate Thermo Scientific 442404 for ELISA
human anti-gp41 (2F5) mAb NIH AIDS Reagent Program 1475 for immunological assays
mouse anti-His tag mAb GenScript A00186 for immunological assays
SOC medium CORNING 46-003-CR for transformation
PCR master mix solution QIAGEN 201445 for PCR
Animal lancet (point length at 5 mm) MEDIpoint for mice bleeding 
Biophotometer Eppendorf for virus physical titer titration

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 99 एंटीजन Capsid-निगमन रणनीति transgene विधि adenovirus (एडी) टीका कैप्सिड प्रोटीन दोहरी संशोधन पूर्व मौजूदा उन्मुक्ति (पी)
Adenovirus सीरोटाइप 5-vectored वैक्सीन दृष्टिकोण के विकास के लिए एंटीजन Capsid-निगमन रणनीति का उपयोग
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Gu, L., Farrow, A. L., Krendelchtchikov, A., Matthews, Q. L. Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches. J. Vis. Exp. (99), e52655, doi:10.3791/52655 (2015).

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