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Immunology and Infection

Utilizando a estratégia Capsid-Incorporação Antigen para o desenvolvimento de abordagens adenovírus subtipo 5-Vectored de vacinas

Published: May 6, 2015 doi: 10.3791/52655
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 2Center for AIDS Research, University of Alabama at Birmingham

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar um bivalente adenovírus tipo 5 (Ad5) vector de prova de princípio Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6, utilizando a estratégia de antígeno do capsídeo-Incorporação. Este vector foi demonstrado que exibem aptidão qualitativa, a capacidade de escapar soros Ad5-positiva, in vitro, e a antigenicidade, bem como a imunogenicidade dos antigénios incorporados.

Abstract

O adenovírus serotipo 5 (Ad5) tem sido extensivamente modificado com métodos tradicionais de transgenes para o desenvolvimento de vacinas. As eficiências reduzidas destes vectores Ad5 tradicionalmente modificados em ensaios clínicos que se correlacionam principalmente com Ad5 imunidade pré-existente (PEI) entre a maioria da população. Para promover o desenvolvimento da vacina vetorizada-Ad5, resolvendo a preocupação de Ad5 PEI, tem sido utilizada a inovadora estratégia de antígeno do capsídeo-Incorporação. Por mérito desta estratégia, Ad5-vectored que primeiro construiu o shuttle hexon plasmídeo HVR1-Seus Kwas-HVR5-6 / pH5S por subclonagem da região hipervariável (HVR) 1 de hexon num plasmídeo de transporte previamente construído HVR5-His 6 / pH5S, que tinha Sua 6 tag incorporada no HVR5. Este fragmento de DNA contendo um epitopo HVR1 ELDKWAS HIV foi sintetizado. 6 / pH5S Seus HVR1-Kwas-HVR5-se então linearizado e co-transformada com o plasmídeo linearizado pAd5 backbone / ΔH5 (GL),para recombinação homóloga. Este plasmídeo recombinado pAd5 / H5-HVR1-Kwas HVR5-6-His foi transfectado em células para gerar o vector viral Ad5 / H5-HVR1-Kwas HVR5-6-His. Este vector foi validado para ter aptidão qualitativa indicado pelo título viral física (VP / ml), título infeccioso (IP / ml) e correspondente rácio / IP VP. Tanto o epitopo HIV e Sua 6 tag foram sobre a cápside de Ad5 expostos à superfície, e manteve-epítopo específico antigenicidade da sua própria. Um ensaio de neutralização indicada a capacidade deste vector para contornar divalente de neutralização pelo soro de Ad5-positiva, in vitro. A imunização de camundongos demonstraram a geração de robusta imunidade humoral específica para o epitopo HIV e Sua 6. Este estudo de prova de princípio sugerido que o protocolo associado com a estratégia de antigénio da cápside-Incorporação poderia ser viável utilizado para a geração de vacinas de Ad5-vectored diferentes, modificando as proteínas da cápside. Este protocolo poderia até ser futros modificado para a geração de rara do serotipo vacinas em vector-adenovírus.

Introduction

Adenovírus humano (Ad) é, um vírus de tamanho médio não encapsulado com uma nucleocápside icosaédrica que contém um genoma de ADN de cadeia dupla. Ad pertence à família Adenoviridae, com uma classificação em sete grupos (A a G). Cada grupo contém vírus de diferentes serótipos. Dos quais, adenovírus serotipo 5 (Ad5) do grupo C tem sido o mais extensamente estudado e o mais amplamente aplicado para abordagens vectored como terapia genética e vacinação.

A estratégia transgene tradicional tem sido desenvolvido e aplicado para modificações de Ad5, que se caracteriza por o deslocamento dos genes precoces do vírus com um gene de interesse, e a expressão do gene focado de interesse num hospedeiro. Exemplos são a construção de pENV9 / Ad5hrΔE3 por substituição do gene inicial 3 (E3) com o gene rev de Simian Vírus da Imunodeficiência 1, a construção de AdCMVGag através da substituição do gene precoce 1 (E1) com o gene gag de Imunodeficiência HumanaVirus (HIV) 2, e a construção de lac Z por Ad substituindo E1 com o gene lac Z 3. A ampla aplicação da estratégia tradicional transgene em Ad5 depende dos seguintes méritos: a ampla gama de hospedeiros para Ad5, a engenharia genética viável sobre o vírus e propagação de vírus, o grande alojamento de inserção de genes estranhos ea segurança de Ad5 4,5. No entanto, as eficiências reduzidas de terapias clínicas Ad5-vectored por utilização desta estratégia tem sido um importante ponto de estrangulamento, que tem sido mapeada para ser associado principalmente com Ad5 PEI, uma vez que o Ad5 é tão prevalente entre a maioria de crianças e adultos 4,6.

Para vencer o principal estrangulamento de Ad5, o objetivo principal é desenvolver uma estratégia alternativa contornar Ad5 PEI. A imunidade inata 7, a imunidade adaptativa, tais como anticorpos neutralizantes (NAbs) 8-10 e CD8 + T respostas de células 10 contra Ad5 têm sido mostrados para contribute ao Ad5 PEI, com Ad5 NAbs aparecendo para desempenhar o papel dominante nas contribuições para Ad5 PEI 10,11. Além disso, Ad5 NABS epítopos alvo situadas em proteínas do capsídeo, incluindo o principal hexon proteínas, fibras e base penton. Dos quais, hexon é o principal alvo de Ad5 NAbs 8,11-13. Com base nestes resultados, uma estratégia de incorporação de antigénio da cápside inovadora foi introduzida. Esta nova estratégia destaca a substituição ou incorporação de proteínas-de-juros sobre proteínas do capsídeo de Ad5, que desloca ou mascara os epítopos neutralizantes Ad5, levando à diminuição do reconhecimento pelo NAbs e eficientes administrações vetor Ad5. É de salientar que esta estratégia é competitivo, porque ele também pode ajudar anfitriões provocar imunidade humoral robusta e imunidade celular potente diretamente por apresentar antígenos de interesse para o sistema imunológico 4,14,15. Com base nesta estratégia, a clonagem molecular e salvamento recombinante Ad vetor viral pode ser estruturalmente divididaem quatro etapas principais: (a) a preparação de fragmento do gene de interesse por qualquer reação em cadeia da polimerase (PCR) ou síntese; (B) a ligação do fragmento do gene num plasmídeo de transporte que contém o fragmento do gene de interesse e os braços homólogas a uma espinha dorsal adenovírus; (C) a recombinação homóloga por co-transformação do plasmideo de transporte contendo o fragmento do gene de interesse com a espinha dorsal do plasmídeo linearizado pAd5 / ΔH5 (GL) 16; (D) a transfecção de plasmídeo linearizado adenovírus recombinante para resgatar o vector Ad recombinante incorporado com antigénios-de-interesse.

O nosso grupo e alguns outros já estendeu essa estratégia alternativa incorporação anúncio para Ad desenvolvimento da vacina vetorizada contra diferentes agentes infecciosos. Nós relataram a geração de um vector Ad recombinantes Ad-HVR1-LGS-His 6 -v3 por incorporação de um marcada com His de HIV-1 de antigénio para a região V3 de Ad5 HVR1 hexon (hexon5). Este vector gerado desencadeada strong resposta imunitária humoral específica para o epítopo V3 4. Também relatou o desenvolvimento de Ad5 / HVR2-MPER-L15ΔE1 através da incorporação de HIV-1 de membrana região ectodom�io proximal (MPER) na localidade de HVR2 hexon5 2. Além disso, o grupo do Dr. Zhou utilizou os benefícios desta estratégia de incorporação de anúncios para desenvolver serotipo ad 3 (Ad3) vacinas vetoriais, isto é., A geração do vector viral R1SP70A3 por incorporação de um epitopo neutralizante de SP70 Enterovírus 71 na HVR1 de Ad3 hexon (hexon3). R1SP70A3 gerado NAbs fortes e produção de IFN-γ específicos para o epitopo SP70, que levam à alta taxa de protecção contra o desafio 15 71 Enterovírus.

Para efeitos de referência técnica, nosso estudo se aproveitou da estratégia de antígeno do capsídeo-Incorporação qualitativa para se concentrar na geração de um bivalente Ad5 vetor Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6, incorporando um antígeno HIV-1 em HVR1 umda sua tag em HVR5 de hexon5. O vector viral gerada foi também avaliada imunologicamente. A estratégia de antigénio da cápside-A incorporação pode ser utilizada para o desenvolvimento de abordagens de vacinação contra o Ad5-vectored doenças infecciosas diferentes.

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Protocol

A Universidade de Alabama em Birmingham Institucional Uso de Animais e Cuidados Comissão aprovou o uso de ratos como aqui descrito sob o número de protocolo aprovado 101.109.272.

1. Genético Construção de um plasmídeo modificado pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 com a Estratégia Capsid-Incorporação Antigen

  1. Construção do plasmídeo de transporte 6 / pH5S Seus HVR1-Kwas-HVR5-
    1. Peça um plasmídeo contendo a sequência de ADN sintetizada HVR1-Kwas entre a locais de enzimas de restrição Agel para Accl do gene hexon5.
    2. Digerir 6 ug do fragmento sintetizado (HVR1-Kwas) com as enzimas de AgeI (6 unidades) e Accl (6 unidades) durante 3 horas a 37 ° C. Resolver o fragmento digerido em um 2% de gel de agarose por electroforese, e purifica-se o fragmento com um kit de extracção de gel de ADN de acordo com o protocolo do fabricante.
    3. Com base na razão molar de inserto para vector a 3: 1, utilizar ligase de ADN T4 e ligase de bpode ser prejudicado para ligar 12 ng do fragmento (HVR1-Kwas) em 100 ng de um plasmídeo de transporte previamente construído HVR5-His 6 / pH5S 17 num volume de 10 ul à temperatura ambiente durante 2 horas, através dos locais de AgeI e Accl.
    4. Transformar 1 ul dos 10 ul do produto de ligação em 50 ul de células DH5a electrocompetentes num electroporador (a 1800 V). Adicionar 950 ul de meio SOC para as células DH5a transformadas e incubar a mistura durante 1 hora a 37 ° C, com 300 rpm. Espalhe 100-200 ul da mistura de 1 mL de ágar Luria-Bertani (LB) contendo canamicina e incubar O / N a 37 ° C.
      1. À tela ~ 10 colônias por PCR visando o fragmento HVR1-Kwas, misturar o iniciador directo (TATGTGTGTCATGTATGCGT), primário (GGAGGCCCACTTGTCCAGCTC) e uma única colônia DH5ct reverter em uma solução de mistura principal PCR (de acordo com o protocolo do fabricante). Amostras em um termociclador executado por referindo-se ao manual fornecido com a solução de PCR mistura principal.
      2. Use o primer forward (TATGTGTGTCATGTATGCGT) para sequenciar o fragmento HVR1-Kwas nos clones selecionados na seção 1.1.4.1.
  2. Construção do plasmídeo pAd5 / H5-HVR1-Kwas HVR5-6-His
    1. Digest 6 ug de HVR1-Kwas HVR5-His-6 / pH5S com as enzimas EcoRI (6 unidades) e PmeI (6 unidades) durante 3 horas a 37 ° C, e purifica-se o fragmento contendo braços de recombinação homóloga e o gene modificado hexon5 dupla, tal como indicado no passo 1.1.2. Linearizar o plasmídeo backbone pAd5 / ΔH5 (GL) com 16 SwaI.
    2. A co-transformar a 100 ng do fragmento de alvo a partir do plasmídeo de transporte e 100 ng do esqueleto linearizado pAd5 / ΔH5 (GL) em 50 ul de células BJ5183 electrocompetentes para a recombinação homóloga num electroporador (a 1800 V). Adicionar 950 ul de meio SOC para as células transformadas e incubar a mistura durante 1 hora a 37 ° C, 300 rpm. Espalhe 100-200 uL da mistura de 1 mLno agar LB contendo canamicina (Final 50 ug / ml) de O / N incubação a 37 ° C.
      1. Escolha ~ 10 pequenas colónias em 3 ml de LB líquido contendo canamicina (final de 50 ug / ml) de O / N a incubação num agitador (250 rpm, 37 ° C). Extrair plasmídeos a partir da cultura. Use análise de PCR para rastrear as 10 colónias por alvo o fragmento HVR1-Kwas, como ilustrado no passo 1.1.4.1.
      2. Para rastrear os mesmos colónias por análise de PCR para o fragmento pIX do genoma espinha dorsal, misturar o iniciador directo (AGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTT), iniciador inverso (CCAAACAGAGTCTGGTTTTTTATTTAT) e uma única colónia BJ5183 em uma solução de mistura principal de PCR (de acordo com o protocolo do fabricante). Amostras executado em um termociclador, referindo-se o manual fornecido com a solução de mistura principal PCR.
      3. Designar as colônias de PCR duplo-positivas como pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6.
    3. Transformar 100 ng do plasmídeo pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 nopara células DH5a tal como ilustrado no passo 1.1.4.
      1. Use a análise PCR para rastrear ~ 10 colônias visando o fragmento HVR1-Kwas, conforme ilustrado na etapa 1.1.4.1.
      2. Use análise de PCR para rastrear os mesmos colónias por alvo o fragmento pIX do genoma de espinha dorsal, como ilustrado no passo 1.2.2.2.
      3. Use o primer forward (TATGTGTGTCATGTATGCGT) para sequenciar o fragmento HVR1-Kwas em pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6.

2. Preparação de modificação Ad5 Viral Vector Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6

  1. Constituem o meio completo por adição de FBS (final de 10%), 100X não-aminoácidos essenciais (final de 0,1 mM), 200 mM de L-glutamina (final 2 mM) e penicilina / estreptomicina solução (final de 1%) em DMEM com glucose elevada . Manter rim embrionário (HEK293) células humanas em meio completo numa incubadora de cultura (37 ° C e 5% de CO2 sob condições humidificadas a 85%).
  2. Resgate de viral vector Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6
    1. Semente de 3,0 x 10 6 de células HEK293 em um frasco T-25 contendo 5 ml de meio completo e a cultura O / N para obter uma monocamada com 80% de confluência.
    2. Linearizar 15 ug de pAd5 / H5-HVR1-Kwas HVR5-6-His num volume de 100 ul com a enzima de restrição PacI (15 unidades) a 37 ° C durante 3 horas.
      1. Extrair linearizado pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 por centrifugação a reacção duas vezes (10.000 x g durante 1 min) com um volume igual de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (rácio a 25: 24: 1) numa hotte , e por centrifugação sequencial (10.000 xg durante 10 min) com uma solução mista (300 ul de etanol a 100% e 10 ul de acetato de sódio) e 700 ul de etanol a 70%. Elimine o sobrenadante em cada etapa de centrifugação.
    3. Ressuspender o plasmídeo purificado em ~ 40 mL de água destilada ou de Tris-EDTA (TE) de tampão. Quantificar o ADN de plasmídeo por medição da óptica density (OD) a 260 nm.
    4. Transfectar 3 ug do plasmídeo linearizado com reagente de transfecção lipossómica comercial no frasco T-25, de acordo com o manual do fabricante. Alterar o meio de transfecção com meio completo a 6 horas após a transfecção e incubação subsequente na incubadora cultura. Manter as células transfectadas, substituindo meio completo a cada dois a três dias, até à formação de placas virais individuais.
    5. Ao desenvolver placas para efeito citopático total (ECP), raspar as células restantes fora do balão num hote estéril, e lisado celular colheita por centrifugação meio a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Suspende-se o sedimento celular em ~ 1 ml de meio contendo 2% de FBS, e romper as células por congelamento-descongelamento de quatro vezes. Recolhe-se o sobrenadante contendo vírus resgatados após centrifugação lisado a 10.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
  3. Propagação em larga escala do vetor viral Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6
    1. Propagar the vírus num frasco T-75 contendo células HEK293 na capa estéril através da infecção com 1/3 de lisado total do frasco T-25. Permitir CPE completo para desenvolver dentro de dois a três dias na incubadora cultura. Colher o sobrenadante ligado como indicado na etapa 2.2.5.
    2. Propagar o vírus em 1-3 frascos T-175 do capuz estéril através da infecção com 1/2 de lisado total do frasco T-75, de acordo com as condições de propagação do vírus. Permitir CPE completo para desenvolver dentro de dois a três dias na incubadora cultura. Colher o sobrenadante ligado como indicado na etapa 2.2.5.
    3. Propagar o vírus em uma dúzia ou mais frascos T-175 na capa estéril através da infecção com 1/2 de lisado total do frasco T-175 (s) anterior. Determinar a quantidade de utilização balão com base nas condições de propagação de vírus e a quantidade de vírus em necessidade. Colheita do sobrenadante lisado como indicado no passo 2.2.5 CPE completo quando ocorre dentro de dois a três dias no incubador de cultura.
  4. Purificação de Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 por cloreto de césio
    1. Prepare duas densidades de soluções de CsCl em HEPES 5 mM: 1,33 g / ml e 1,45 g / ml, evitando ao mesmo tempo o contacto com CsCl.
    2. Carga de 4 ml de CsCl (1,33 g / ml) em um tubo de ultracentrífuga estéril, e carregar suavemente 4 ml de CsCl (1,45 g / ml) contra o fundo do tubo. Carga de 4 ml de sobrenadante lisado lentamente na parte superior dos gradientes na hote estéril.
    3. Centrifuga-se o tubo a 110.000 xg durante 3 horas a 4 ° C para separar a banda de vírus maduro / inferior da banda de vírus defeituoso / superior. Recolha a banda inferior usando uma seringa de 3 ml munido com uma agulha G 33 e dilui-se a banda com HEPES a 5 mM a um volume de 4 ml na hote estéril.
    4. Carregar um outro tubo com duas densidades de soluções de CsCl e a banda de vírus diluído tal como descrito no passo 2.4.2. Centrifuga-se o tubo a 110.000 xg O / N a 4 ° C. Recolha a banda virai, tal como descrito no passo 2.4.3.
    5. Injectar a solução de vírus coletadas em um dialysé cassete por uma seringa de 3 ml armado com uma agulha G 33 no capô estéril.
    6. Coloque a gaveta em 700 ml de tampão de diálise 1x (1 L receita: 100 ml de 10x PBS, 100 ml de glicerol a 100% e 800 ml de água destilada; filtrar o tampão através de um filtro de 0,22 um) e substituir o tampão de diálise a cada 3 hrs por 4 vezes. Aspirar a solução de vírus dialisado usando uma seringa com agulha.

3. Validação do vetor viral salvei

  1. Viral Vector titulações
    1. Para a titulação do vírus físico, diluir tanto vírus e tampão de diálise (controlo de fundo) a 1: 10 e 1: 20 em tampão de lise do vírus (10% SDS em Tris-EDTA) em pequenos tubos, e incubar todos os tubos a 56 ° C durante 10 min.
    2. Ligue um BioPhotometer e definir o modo de absorção a OD 260 nm. Utilize o tampão de diálise diluído (1: 10) para equilibrar o sinal de fundo, clicando no fundo "em branco". Tipo "10 + 90" na scr BioPhotometereen, e ler o sinal de vírus diluído (1: 10).
    3. Leia o sinal de vírus diluído (1: 20), seguindo o método na etapa 3.1.2, mas em vez digite "5 + 95" na tela de BioPhotometer. Multiplicar os dois números de leitura por vírus 1,1x10 12 e calcular o título médio com uma unidade como VP / ml, com base nas duas títulos individuais das duas diluições.
    4. Para a titulação infecciosa do vírus (IP / ml), utilizar o Karber TCID estatística 50 14 método para determinar a profundidade a infecção em células HEK293 que aos 10 dias pós infecção (dpi)
  2. Avaliação do ecrã de exposição antigénica em que o vector viral
    1. Revestir o vector viral, em uma placa de ELISA e prosseguir com o restante das etapas de um método ELISA convencional 14. Use anti-gp41 (2F5) anticorpo humano monoclonal (mAb) e de ratinho anti-His Tag mAb para a detecção de antigénios correspondentes incorporados 14.
    2. Resolver o vector viral num denatueletroforese em gel de proteína vermelha (SDS-PAGE) e prosseguir com o restante das etapas em um método western blot-padrão 14. Use anti-gp41 (2F5) anticorpo humano monoclonal (mAb) e de ratinho anti-His Tag mAb para a detecção de antigénios correspondentes incorporados 14.
  3. Avaliação in vitro do vetor sobre a capacidade de ignorar soros Ad5-positve
    1. Manter as células HeLa em meio completo na incubadora de cultura (37 ° C e 5% de CO 2 sob condições humidificadas a 85%). Constituem o meio completo por adição de FBS (final de 10%), 200 mM de L-glutamina (final de 2 mM) e solução de penicilina / estreptomicina (final de 1%) em Meio Essencial Mínimo de Eagle (MEME).
    2. Semente células HeLa em placas de 6 poços a 1x10 6 células / poço, e incubam-se as placas na incubadora de cultura (37 ° C e 5% de CO2 sob condições humidificadas 85%) durante 2 horas. Incubar soros Ad5-positivo (0,1 l ou 0 ul) com 5 IP / célula de vetor viral (Ad5 ou Ad5 / H5-HVR1-Kwas HVR5-6-His) na incubadora de cultura durante 1 h antes de se adicionar as misturas em placas de 6 poços contendo células.
    3. Ao fim de 24 horas após a infecção (hpi), lavar as células uma vez com PBS e as células lisam em 0,5 ml de tampão de lise. Centrifugar a 15.000 xg durante 5 minutos e recolher o sobrenadante. Misturar 20 uL do sobrenadante com 100 ul de substrato de luciferase para a leitura do sinal da luciferase, uma vez que os vírus contém o gene da luciferase.

4. Avaliação imunológica do vector viral salvados

  1. Prepare dois grupos de imunização: Ad5 e Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6.
    1. Injetar camundongos (n = 8 / grupo) por via intramuscular com vírus em 1x10 10 VP / rato, em um "prime-boost" regime de imunização homóloga, com um intervalo de 2 semanas.
    2. Em 2 semanas após cada injecção, os ratos sangrar sem anestesia pelo rosto sangrando com lancetas animais (5 mm de comprimento ponta) paracoleta de sangue em tubos de 1,5 ml.
  2. Misturar o sangue nos tubos por inversão cima e para baixo, e incuba-se o sangue à temperatura ambiente durante 30 min. Girar os tubos a 10.000 xg durante 5 min a 4 ° C e os soros de transferência (camada superior) para novos tubos de 1,5 ml.
    1. Girar os novos tubos a 10.000 xg durante 5 min a 4 ° C e transferência para recém-soros marcados tubos de 1,5 ml para armazenamento a -80 ° C.
  3. Avaliação de imunidade humoral especifica para o antigénio por ELISA à base de soro
    1. Diluir Sua peptídeo (estoque em 1 mM) e HIV-1 peptídeo (estoque em 1 mM) separadamente em 100.
    2. tampão carbonato mM (pH 9,5) para atingir a concentração de revestimento de péptido em 10 ^ M. Revestir as placas de ELISA com os péptidos diluídos em separado pela adição de 100 ul por cavidade e incubando as placas de O / N a 4 ° C.
    3. Lavar as placas com PBST, quatro vezes em 200 ul / poço e bloqueio durante 1 hora em 5% de BSA em PBST. Aplicar soros de murganhos das placas a diluição 1: 100 no bloqueio de buffer, 100 ul / poço. Incubar durante 2 horas de incubação à temperatura ambiente.
    4. Lavar as placas com PBST, quatro vezes. Bloquear as placas por incubação à temperatura ambiente durante 30 min em tampão de bloqueio a 100 ul / poço.
    5. Aplique de cabra anti-IgG de ratinho-HRP (1: 5000 no tampão de bloqueio), a 100 ul / poço de ambas as placas revestidas com o seu peptídeo de HIV-1 e de péptidos individualmente. Incubar durante 2 horas à temperatura ambiente. Lavar as placas com PBST.
    6. Ler as placas a DO450 nm após incubação com substrato de HRP durante 30 min.

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Representative Results

A estratégia de antigénio da cápside-Incorporação (Figura 1A), foi utilizada para gerar o vector viral Ad5 divalente Ad5 / H5-HVR1-Kwas HVR5-6-His. Em primeiro lugar, o ônibus plasmídeo HVR1-Kwas-HVR5-His 6 / pH5S foi construído por subclonagem HVR1-Kwas fragmento no plasmídeo anterior shuttle construído HVR5-His 6 / pH5S 17. Em segundo lugar, o plasmídeo pAd5 / H5-HVR1-Kwas HVR5-His-6 14 foi construído através da recombinação homóloga entre o fragmento de "EcoRI-HVR1-Kwas-HVR5-His6-PmeI" e SwaI linearizado pAd5 / ΔH5 (GL ) 16 (Figura 1B). A transfecção de PacI digerido pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 num balão de chumbo T-25 para o resgate do vetor viral Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 14. O vetor viral foi resgatado em seguida propaga-se em grande escala e purificado por dois ciclos de gradiente de CsCl ultracentrífuga.

A fim dedemonstrar a viabilidade / aptidão do vector viral resgatado Ad5 / H5-HVR1-Kwas HVR5-6-His, a título física foi determinada a 1,3 x 10 11 pv / ml medindo as cópias físicas do genoma viral, e o título infeccioso foi determinado em 1,4 x 10 9 IP / ml por titulação das partículas virais infecciosas reais. A razão VP / IP foi posteriormente calculada em 92 14. Normalmente, um anúncio com um rácio / IP VP abaixo de 1.000 indica uma adequação qualitativa deste vírus. A fim de demonstrar se o vírus resgatado exibe o antigénio HIV antigénica e His, respectivamente, sobre a superfície da cápside viral hexon5 principal proteína, a ELISA foi realizada com mAb 2F5 humana e de ratinho anti-His mAb, respectivamente. Os resultados indicaram que tanto o mAb 2F5 humana (Figura 2A) e 14 de ratinho anti-His de mAb (Figura 2B) 14 mostrou ligação a Ad5 / H5-HVR1-Kwas HVR5-His-6, ao passo que não houve ligação ao contro negativol vetor Ad5. Análise de Western-blot foi utilizada para confirmar os dados no ELISA, como tanto 2F5 humano de mAb (Figura 2C) e 14 de ratinho anti-His de mAb (Figura 2D) 14 detectou bandas específicas em torno de 117 kDa apenas no vírus Ad5 / H5- HVR1-Kwas HVR5-His-6, o que corresponde ao tamanho da proteína hexon5. A fim de avaliar o potencial de Ad5 / H5-HVR1-Kwas HVR5-6-His em contornar neutralização pelo soro de Ad5-positiva, análise ensaio de neutralização foi levada a cabo como indicado na secção de protocolo 3.3. Os resultados mostraram que a unidade luminescente relativa (RLU) do sinal a partir do vector viral Ad5 tratada com 0 ul de Ad5-positve soros é 12 vezes maior do que a partir do mesmo vector tratado com 0,1 ul de Ad5-positve soros (valor de p <0,001 ). Isto sugeriu a neutralização do vector Ad5 pelos soros de Ad5-positvive. Em contraste, houve pouca diferença a partir do vector viral Ad5 / H5-HVR1-Kwas HVR5-6-Histratou-se com 0 uL e 0,1 uL de soro de Ad5-positve (Figura 3). Desde hexon é o principal alvo de Ad NAbs, e específicos do hexon epitopos neutralizantes residem em todos os HVRs de hexon 12,18, os dados acima demonstram que Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 escapou neutralização pelo soro Ad5-positve in vitro e sugere o potencial de Ad5 / H5-HVR1-Kwas HVR5-6-His em contornar Ad5 PEI no hospedeiro.

Para investigar se a bivalente modificado Ad5 vetor viral com a estratégia Capsid-Incorporação Antigen poderia provocar robusta imunidade humoral específica para os antígenos-de-juros incorporados, o "prime-boost" regime de imunização foi aplicado para imunizar ratinhos com controle de vetor viral e Ad5 o vector divalente Ad5 / H5-HVR1-Kwas HVR5-6-His. ELISA baseado em soros revestidas com HIV-1 de péptidos mostraram que o soro do grupo de imunização de Ad5 / H5-HVR1-Kwas HVR5-His-6 teve significant para a ligação do HIV-1 a diluições de péptido entre 40 e 640, quando comparados com os soros a partir do grupo de controlo (p <0,001) (Figura 4A) 14. ELISA baseado em soros revestidos com Sua péptido mostrou que os soros a partir do grupo de imunização de Ad5 / H5-HVR1-Kwas HVR5-His-6 teve uma ligação significativa para o seu péptido quando comparado com o soro do grupo de controlo, como valor estatístico p < 0,001 nas diluições de soro de 40 e 80, valor de p <0,01 no diluição de 160 e o valor de p <0,05, a uma diluição de 320 (Figura 4B) 14. Os resultados acima indicaram a geração de resposta imunitária humoral contra os antigénios incorporadas no vector virai divalente.

Figura 1
Figura 1. Representação esquemática da construção genética do plasmídeo pAd5 / H5-HVR1-Kwas HVR5-His-6 com a estratégia de antigénio da cápside-Incorporação. (A) A estratégia de antigénio da cápside-Incorporação é caracterizada por exibir directamente o antigénio de interesse sobre as proteínas da cápside (hexão, penta-base, pIX e / ou de fibra de adenovírus). Esta figura foi adaptado a partir Nemerow et ai., 2009 Virology 384 (2009) 380-388, Elsevier de direitos de autor (B) fragmento. Gene (HVR1-Kwas) foi sintetizado e clonado num vector pUC por uma empresa. Este fragmento foi subclonado no plasmídeo de transporte previamente construído HVR5-His 6 / pH5S por as enzimas de restrição Accl e AgeI para gerar 6 / pH5S Seus HVR1-Kwas-HVR5-. O plasmídeo de transporte resultante foi digerido com as enzimas EcoRI e PmeI, e co-transformado com SwaI linearizado plasmídeo de esqueleto pAd5 / ΔH5 (GL) para a recombinação homóloga, o que resulta na geração do recombinado pAd5 estrutura do plasmideo / H5-HVR1-Kwas -HVR5-His 6. Nesta figura, R1 denota HVR1 e R5 denota HVR5, e GL indica a proteína verde fluorescente (GFP) e luciferase, separadamente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Avaliação da exposição antigénica de antigénios incorporados sobre a superfície da cápside do vector viral divalente Ad5 / H5-HVR1-Kwas HVR5-6-His vector viral inteira. ELISA foi realizado para determinar se os antigénios foram incorporados no vector exposta superfície, mantendo características antigênicas da sua própria. As placas de ELISA foram revestidas com o vector divalente, e incubadas com mAb 2F5 humana (A) ou de murganho anti-His mAb (B). Os dados indicaram a ligação significativa dos anticorpos para o vector divalente, mas não para o vector de controlo de Ad5. R1-Kwas R5-His-6 indica a Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6. Análise de Western-blot foi realizada para confirmar a ligação do mAb 2F5 humano (C) ou de murganho anti-His mAb (D) para os antigénios integrados no vector divalente antigénico. Em ambos (C) e (D), a pista 1 indica Ad5, e pista 2 indicam Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Avaliação da capacidade do vector viral divalente para escapar a neutralização por um ensaio de neutralização de Ad5-positve soro in vitro. Foi realizado para determinar se o vector bivalente poderia escapar da neutralização. Os resultados indicaram a neutralização de vírus pelo soro de Ad5, mas os escape de neutralização do vírus bivalente in vitro. Nesta figura, R1-Kwas-R5-His 6 indica Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6. Os asteriscos *** denota o valor de p <0,001.

Figura 4
Figura 4. Na geração in vivo de imunidade humoral por o vector viral divalente no modelo de ratos. ELISA baseado no soro foi utilizada para avaliar a imunidade humoral contra as proteínas incorporadas no vector Ad5 divalente / H5-HVR1-Kwas HVR5-6-His . O HIV-1 de péptido (A) e seu péptido (B) foram revestidos em placas de ELISA separadamente, seguido pela incubação com os soros de ratinhos a partir dos dois grupos de imunização (Ad5 e Ad5 / H5-HVR1-Kwas HVR5-6-His) . Os dados indicaram a geração significativa de respostas imunitárias humorais contra o antigénio HIV-1 em HVR1 (A) e o marcador de His no HVR5 (B). Cada ponto representa médias e SD de oito repetições. Os asteriscos *** denota o valor de p <0,001, ** denota o valor de p <0,01, e * indica o valor de p <0,05.

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Discussion

A aplicação da estratégia do transgene tradicional em Ad5 modificação para o desenvolvimento de vacinas tem sido diminuído, principalmente devido ao estrangulamento associada com o Ad5 de PEI 4,6. Este gargalo pode ser parcialmente diminuída pela aplicação da estratégia alternativa antígeno do capsídeo-Incorporation (Figura 1A), uma vez que esta estratégia pode fugir neutralização por Ad5 NAbs substituindo neutralizantes epítopos de Ad5 com antígenos-de-interesse, e facilitar a geração de imunidade robusto aos antigénios-de-interesse incorporadas. Neste estudo, a geração do vector viral divalente modificada Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 foi introduzida como um exemplo conceptual (Figura 1B). Correspondente à seção de protocolo 1.1.1, o fragmento sintetizado no plasmídeo ordenou contém um HIV-1 substituição gene gp41 curto na localidade HVR1 de hexon5. O gene gp41 parcial codifica um epitopo ELDKWAS, que substituiHVR1 parcial dos aminoácidos 139-144 da hexon5 14. ELDKWAS é um epitopo neutralizante potente em gp41 de HIV-1 19.

Durante a clonagem, havia dois passos críticos. Um passo foi a selecção de duas enzimas de restrição, quando a síntese do fragmento do gene de interesse na secção 1.1.1 protocolo. A selecção das duas enzimas condicionalmente depende da localização do Ad cápside de ser modificado, isto é., No presente estudo, um fragmento de gene contendo Kwas foi designado para incorporar em HVR1 de proteína hexon5. As enzimas de restrição Accl e AgeI existir separadamente em áreas do local HVR1 N-terminal e C-terminal de flanqueamento, e não existem no fragmento HVR1-Kwas, assim AgeI e Accl foram escolhidos para serem colocados, individualmente, em N-terminal e C- terminal do fragmento sintetizado HVR1-Kwas. Desde hexon é o alvo principal de Ad NAbs, e específicas do hexon de epitopos neutralizantes em todos residem HVRs de hexon de 12,18, é possível que the hex� modificado vetores Ad5 com a estratégia de antígeno do capsídeo-Incorporação poderia ganhar a capacidade de ignorar a neutralização pelo soro-positivos Ad5 in vitro, e até mesmo o Ad5 PEI em host. Neste estudo, ambas HVR1 e HVR5 em que o vector viral bivalente poderia contribuir para a fuga de neutralização pelo soro de Ad5-positiva. O outro passo crítico foi na seção de protocolo 1.2.2. Após o O / N a incubação da mistura de co-transformado em LB agar, as colónias crescidas BJ5183 precisa ser imediatamente cultivadas em LB líquido para S / N, e os plasmídeos necessitam de ser imediatamente extraído das células BJ5183 bem. Atrasar os procedimentos conduzirá provavelmente a recombinação e mutações potencial, uma vez que o plasmídeo recombinado nas células BJ5183 não é estável. O plasmídeo correcto da recombinação homóloga tem de ser transformado em DH5a, a fim de manter uma espécie genoma estáveis ​​e correcção.

Após a clonagem, havia dois passos mais críticos. Oprimeiro passo na secção de protocolo é de cerca de transfecção. É necessário transfectar a espinha dorsal do plasmídeo Ad recombinado em células que expressam Ad5 E1 (HEK293), se o plasmídeo de esqueleto é gene E1 suprimida. O outro passo na seção de protocolo 2.3 é de cerca de upscaling vírus. O procedimento básico para escalonamento vírus segue o princípio de escalonamento vírus padrão a partir de um frasco T-25 para frascos T-75 e T-175 frascos. No entanto, o número de frascos T-75 (e / ou T-175) para utilização depende da velocidade de crescimento do vírus, o desenvolvimento de CPE causada pela infecção pelo vírus, e a quantidade de vírus necessária.

A estratégia de antígeno do capsídeo-Incorporação permite ampla aplicação em modificações de anúncios. Com esta estratégia, é possível modificar ou incorporar antígenos heterólogos nas principais proteínas do capsídeo diferentes, tais como hexon 2,4,20, base penton 21 e 22 de fibra. O menor proteína do capsídeo pIX C terminal também se mostrou promissor para o heterologous antigénio / péptido incorporação 21,23. Além da modificação única, várias modificações no anúncio com esta estratégia também alcançou o sucesso. Exemplos disso são a geração de bivalente Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 neste estudo por incorporações em ambos HVR1 e HVR5 de hexon5, ea incorporação de dois epítopos neutralizantes de enterovirus tipo 71 em qualquer HVR1 e HVR2 ou HVR1 e HVR4, ou HVR1 e HVR5 de hexon3 24. Estes exemplos implica a viabilidade das modificações hexon em outros serotipos de Ad, com a finalidade quer de terapia genética ou vacinação abordagem. Nossos dados também demonstraram as incorporações de dois epítopos de Trypanosoma cruzi em hexon e pIX (dados não publicados). Esta estratégia também foi estendido para fazer vectores Ad quiméricos, quer para vacinação ou abordagens de terapia genética. Exemplos são a geração de Ad5H3 quimérico, alternando com hexon5 hexon3 16, a geração de Ad3H7 quimérico comutando hexon3 with hexon7 25, e a geração de Ad5F4 quimérica através da substituição da fibra de Ad5 com fibras 26 Ad4.

Neste estudo, o divalente Ad5 / H5-HVR1-Kwas HVR5-6-His demonstrou a elicitação de respostas imunitárias humorais específicas para os antigénios-de-interesse incorporadas. O nosso projecto actual demonstra que a resposta de células T CD8 específicas ASP2-T é significativamente preparado por imunização com um vector Ad5-pIX-ASP2, o qual foi gerado pela incorporação de ASP2 péptido na proteína IX (pIX) de Ad5, com a estratégia de antigénio da cápside-Incorporação (dados não apresentados). ASP2, também chamado de proteína de superfície amastigote 2, é um antígeno imunodominante do digenético protozoário parasita intracelular Trypanosoma cruzi (T. cruzi) 27. Esta nova descoberta experimental estende nosso conhecimento de que a aplicação da estratégia de antigénio da cápside-incorporação em vacinas em vector Ad pode provocar não apenas a respostas imunitárias humorais, mas também a Immun celulare respostas específicas aos antigénios-de-interesse.

Embora comparativamente vantajoso para o transgene estratégia tradicional, a estratégia de antígeno do capsídeo-Incorporação também tem três desvantagens. Em primeiro lugar, não pode permitir a incorporação do gene de interesse, enquanto estratégia tradicional faz. Tem sido relatado que a estratégia de antigénio da cápside-Incorporação em hexon5 permite a inserção de um máximo de 80 ácidos aminados (aa) na HVR1, 77 aa em HVR5 e 57 aa na HVR2 2. Dos quais, HVR1 é a localidade mais permissiva para a incorporação. No entanto, a menor proteína da cápside pIX podem acomodar uma inserção de 1000 aminoácidos 28. Em segundo lugar, alguns antígenos-de-interesse na natureza falhar em incorporar as proteínas do capsídeo de anúncios, devido aos fatores tais como encargos e forças de aminoácidos, que parecem perturbar o arranjo estrutural do vírus Ad. Neste caso, a introdução de espaçadores apropriados ligados ao antigénios de interesse pode ajudar the incorporação bem sucedida 4. Em terceiro lugar, incorporações em algumas localidades HVR, ie., HVR6 ou HVR7 poderia levar à geração falhou de vetores virais viáveis ​​12. Tendo em conta as vantagens e desvantagens de ambas as estratégias, uma selecção sensata de as duas estratégias ou uma combinação de ambas as estratégias dependerá das condições / necessidades específicas. Um exemplo de pentear ambas as estratégias é a geração de Ad5 / HVR2-MPER-L15 (GAG), através do qual a região externa da membrana proximal (MPER) do HIV-1 gp41was incorporados HVR2 de hexon5 com a estratégia de antigénio da cápside-Incorporação, e o HIV-1 gene gag foi inserido para substituir a região do gene E1 de Ad5 com a estratégia do transgene tradicional 2.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado em parte pelo National Institutes of Health concede 5T32AI7493-20 e 5R01AI089337-03. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x DPBS Thermo Scientific SH30256.01 for cell spliting 
10x DPBS Thermo Scientific SH30378.02 for dialysis buffer preparation
glycerol SIGMA G5516-1L for dialysis buffer preparation
SDS BIO-RAD 161-0301 for virus lysis buffer preparation
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Scientific SH30910.03 component of culture medium
100x Non-Essential Amino Acids  Thermo Scientific SH30238.01 component of culture medium
200 mM L-glutamine Cellgro 25-005-CI component of culture medium
penicillin/streptomycin solution  Cellgro 30-002-CI component of culture medium
DMEM with high glucose Thermo Scientific SH30081.01 for HEK293 cell culture
Minimum Essential Medium Eagle SIGMA M5650 for HeLa cell culture
phenol:chloroform:isoamyl alcohol  SIGMA P3803-100ML for large size of DNA purification
cesium chloride  Research Products International Corp. C68050 for virus purificiation
HEPES Cellgro 25-060-CI for CsCl solution preparation
HEK293 ATCC 51-0036 for virus rescue and upscale
HeLa ATCC CCL-2 for neutralization assay
T-25 flask Thermo Scientific 156367 for cell culture 
T-75 flask CORNING 430641 for cell culture 
T-175 flask Thermo Scientific 159910 for cell culture 
Ultracentrifuge BECKMAN NA for virus purification
Ultracentrifuge tube BECKMAN 344059 for virus purification
dialysis cassette  Thermo Scientific 66380 for virus dialysis
ELISA plate Thermo Scientific 442404 for ELISA
human anti-gp41 (2F5) mAb NIH AIDS Reagent Program 1475 for immunological assays
mouse anti-His tag mAb GenScript A00186 for immunological assays
SOC medium CORNING 46-003-CR for transformation
PCR master mix solution QIAGEN 201445 for PCR
Animal lancet (point length at 5 mm) MEDIpoint for mice bleeding 
Biophotometer Eppendorf for virus physical titer titration

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References

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