Summary
ここでは、実証の原則二価のアデノウイルス5型（Ad5）ベクトルを生成するためのプロトコルを提示するAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5 -彼の6抗原キャプシド取り込み戦略を利用することによって。このベクターは、定性的フィットネス、Ad5の陽性in vitroでの血清、および抗原性ならびに組み込まれた抗原に対する免疫原性を脱出する能力を示すことが実証されました。
Abstract
アデノウイルス血清型5（Ad5の）が広くワクチン開発のための従来の方法を用いて導入遺伝子改変されています。臨床試験においてこれらの伝統的改変Ad5ベクターの減少効力は主として人口の大部分の間でのAd5既存の免疫（PEI）と相関させることができました。 Ad5のPEIの懸念を解決することによってのAd5-ベクターワクチンの開発を促進するために、革新的な抗原キャプシド取り込み戦略が採用されています。この戦略のメリットにより、Ad5のベクトル化は、まず以前に構築シャトルプラスミドHVR5-彼6 / pH5Sに超可変領域（HVR）ヘキソンの1をサブクローニングすることにより、ヘキソンシャトルプラスミドHVR1-KWAS-HVR5-彼6 / pH5Sを構築し、これHVR5に組み込む彼の6タグを持っていました。 HIVエピトープELDKWASを含むHVR1このDNA断片を合成しました。 HVR1-KWAS-HVR5-彼6 / pH5Sその後、線形化したと、線形化骨格プラスミドPAD5 /ΔH5（GL）で同時形質転換します相同組換えのため。この組み換えプラスミドPAD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5は、彼の6は、ウイルスベクターのAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-彼の6を生成するために、細胞にトランスフェクトしました。このベクターは、ウイルスの物理的力価（VP / mlで）によって示される定性的なフィットネス、感染力価（IP / ml）および対応するVP / IP比を有することが確認されました。 HIVエピトープおよびHis 6タグの両方がAd5のキャプシドの表面に露出していた、と彼ら自身のエピトープ特異的抗原性を保持していました。中和アッセイは、 インビトロでのAd5陽性血清による中和を回避するために、この二価のベクターの能力を示しました。マウスの免疫は、HIVエピトープおよびHis 6に特有の強固な体液性免疫の生成を実証しました。この証明の原理研究は、抗原キャプシド取り込み戦略に関連するプロトコルを実行可能に異なるキャプシドタンパク質を修飾することにより、ベクトル化のAd5ワクチンの生成のために利用され得ることを示唆しました。このプロトコルは、さらにfとすることができましたurtherまれな血清型のアデノウイルスベクター化ワクチンの生成のために修正されました。
Introduction
ヒトアデノウイルス（AD）は、二本鎖DNAゲノムを含む正二十面体ヌクレオカプシドと中型、非エンベロープウイルスです。広告は、7つのグループに分類（Gを介してA）と、アデノウイルスファミリーに属します。各グループは、異なる血清型のウイルスが含まれています。これは、グループCは最も広範に研究され、最も広く、遺伝子治療や予防接種などのベクトル化手法に適用されてきたから、アデノウイルス血清型5（Ad5の）の。
伝統的な導入遺伝子の戦略が開発され、目的遺伝子を有するウイルス初期遺伝子の変位することを特徴とするAd5の修正のために適用され、目的遺伝子の宿主中での集表現されています。例としては、サル免疫不全ウイルス1のrev遺伝子と初期遺伝子3（E3）を置き換えることによってpENV9 /Ad5hrΔE3の構築であり、ヒト免疫不全のgag遺伝子と初期遺伝子1（E1）を置き換えることによりAdCMVGagの建設ウイルス（HIV）2、およびlac Z遺伝子の 3でE1を置き換えることによって広告のlac Zの構築。 Ad5の上の伝統的な導入遺伝子戦略の広範なアプリケーションは、次のメリットに依存しますのAd5、ウイルスおよびウイルス増殖の実現可能な遺伝子工学、外来遺伝子挿入物の大規模な宿泊施設とのAd5 4,5の安全のためにホストの広い範囲。しかし、この戦略を使用してAd5のベクトル化臨床治療の有効性を減少させたがAd5のは、子供と大人4,6の大部分の間でとても普及しているので、主に、Ad5のPEIと関連していることがマッピングされている主要なボトルネック、となっています。
Ad5のの主要なボトルネックを克服するために、主な目的は、Ad5のPEIを回避代替戦略を開発することです。このような中和抗体（NABS）8-10およびCD8 + T細胞応答などの自然免疫7、適応免疫は、Ad5のに対して、10が共同することが示されていますAd5のNABSはAd5のPEI 10,11に貢献で支配的な役割を果たしているように見えると、Ad5のPEIにntribute。また、Ad5のは、主要なタンパク質、ヘキソン、ファイバーおよびペントンベースなどのキャプシドタンパク質に位置する標的エピトープを、NABS。このうち、ヘキソンはAd5のNABS 8,11-13の主要な標的です。これらの知見に基づいて、革新的な抗原キャプシド取り込み戦略が導入されています。この新規戦略はNABSかつ効率的なのAd5ベクター投与により減少した認識をもたらす、タンパク質の関心のAd5中和エピトープをシフトさせるか、マスクのAd5キャプシドタンパク質、上の交換または取り込みを強調しています。それはまた、ホストが強固な体液性免疫と直接免疫系4,14,15に抗原の関心を提示することによって、強力な細胞性免疫を誘発することができますので、この戦略は競争力があることは注目に値します。この戦略に基づき、分子クローニングおよび組換え広告ウイルスベクターのレスキューは、構造的に分割することができます4つの主要なステップには、（a）いずれかのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）または合成により目的遺伝子断片を調製します。 （b）は、アデノウイルス骨格に目的遺伝子断片との相同アームを含んでいるシャトルプラスミドへの遺伝子断片の連結を、 （C）線形化バックボーンプラスミドPAD5 /ΔH5（GL）16で目的遺伝子断片を含むシャトルプラスミドを同時形質転換することにより、相同組換え、 （d）の線状化組換えアデノウイルスプラスミドのトランスフェクションは、抗原の関心を組み込んだ組換えAdベクターを救出します。
私たちのグループと他のいくつかは、別の感染性病原体に対する広告ベクターワクチン開発のためのこの代替広告の取り込み戦略を高めています。我々は、組換えAdベクターの生成を報告したAd-HVR1-LGS-彼のAd5ヘキソン（hexon5）のHVR1ロケールにHis標識HIV-1抗原V3を組み込むことにより、6 -V3。この生成されたベクターは、STRをトリガV3エピトープ4に固有オング液性免疫応答。また、hexon5 2のHVR2ロケールにHIV-1膜近位外部ドメイン領域（MPER）を組み込むことによって、Ad5の/ HVR2-MPER-L15ΔE1の開発を報告しました。また、博士周のグループは、Ad血清型3（のAd3）ベクトル化ワクチンを、 すなわち 。開発するために、この広告の取り込み戦略の利点を使用していた、のAd3のHVR1にエンテロウイルス71の中和エピトープSP70を組み込むことにより、ウイルスベクターR1SP70A3の生成ヘキソン（hexon3）。 R1SP70A3はエンテロウイルス71チャレンジ15に対する保護の高い率につながる強いNABSおよびエピトープSP70に特異的IFN-γ産生を、生成されました。
テクニカルリファレンスの目的のために、私たちの研究では、HVR1に、HIV-1抗原を組み込むことによって、二価のAd5ベクターのAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5 -彼の6の生成に焦点を当てる定性的な抗原キャプシド取り込み戦略を利用しましたANダhexon5のHVR5にHisタグ。生成されたウイルスベクターはまた、免疫学的に評価しました。抗原キャプシド取り込み戦略は異なる感染症に対するAd5のベクトル化ワクチン接種アプローチの開発に向けて利用することができます。
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Protocol
承認されたプロトコル番号101109272の下で本明細書に記載されるようバーミンガム動物実験を使用してケア委員会でのアラバマ大学は、マウスの使用を承認しました。
1.遺伝的構築改変プラスミドPAD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-彼の6抗原キャプシド取り込み戦略と
- シャトルプラスミドの構築HVR1-KWAS-HVR5-彼6 / pH5S
- hexon5遺伝子ののAccIに制限酵素サイトのAgeIとの間に合成されたDNA配列HVR1-KWASを含むプラスミドを注文。
- 37℃で3時間のための酵素のAgeI（6台）とのAccI（6台）で合成フラグメント（HVR1-KWAS）の6μgのダイジェスト。電気泳動による2％のアガロースゲル中で消化された断片を解決し、製造業者のプロトコールに従ってDNAゲル抽出キットを用いて断片を精製します。
- T4 DNAリガーゼおよびリガーゼBを使用し、1：インサートのモル比に基づいて、3でベクトルにufferはをAgeIとのAccIの部位を介して、2時間室温で10μlの体積で以前に構築シャトルプラスミドHVR5-彼6 / pH5S 17の100 ngのに断片（HVR1-KWAS）の12 ngのを連結します。
- （1800 Vで）エレクトロでエレクトロDH5α細胞を50μlにライゲーション産物を10μlのうち1μLを変換します。形質転換されたDH5α細胞にSOC培地950μlを添加して、300回転数で、37℃で1時間混合物をインキュベートします。カナマイシンを含むルリア - ベルターニ（LB）寒天上で1ミリリットルの混合物の100〜200μLを広げ、37℃でO / Nインキュベート。
- 〜断片HVR1-KWASをターゲットにPCRによって10個のコロニーをスクリーニングするために、フォワードプライマー（TATGTGTGTCATGTATGCGT）を混ぜて（製造業者のプロトコルに従って）PCRマスターミックス溶液にプライマー（GGAGGCCCACTTGTCCAGCTC）とシングルDH5αコロニーを逆転。 PCRマスターミックス溶液のマニュアルを参照して、サーモサイクラー上のサンプルを実行します。。
- セクション1.1.4.1でスクリーニングクローンでフラグメントHVR1-KWASを配列決定するために、フォワードプライマー（TATGTGTGTCATGTATGCGT）を使用します。
- プラスミドPAD5 /の建設H5-HVR1-KWAS-HVR5、彼の6
- ダイジェスト6μgのHVR1-KWAS-HVR5-彼の6/37°Cで3時間のための酵素のEcoRI（6台）とのPmeI（6台）でpH5S、および相同組換えアームとデュアル修正さhexon5遺伝子を含む断片を精製し、としてステップ1.1.2で述べました。 SwaIで骨格プラスミドPAD5 /ΔH5（GL）16を線形化します。
- シャトルプラスミドと（1800 Vで）エレクトロにおける相同組換えのためのエレクトロBJ5183細胞を50μlに直線化PAD5 /ΔH5（GL）バックボーンの100 ngのからターゲット断片100ngのを同時形質転換。形質転換細胞にSOC培地950μlを添加して、37℃、300rpmで1時間混合物をインキュベートします。 1ミリリットルの混合物200μlの - 100を広げます37℃でO / Nインキュベーションのためにカナマイシン（最終50μg/ ml）を含むLB寒天上。
- 3ミリリットルシェーカー（250rpmで、37℃）でO / Nインキュベーションのために、カナマイシン（最終50μg/ ml）を含む液体LBに〜10の小さなコロニーを選択してください。培養物からプラスミドを抽出します。ステップ1.1.4.1に示すように、断片HVR1-KWASを標的とすることによって、10個のコロニーをスクリーニングするためにPCR分析を使用してください。
- バックボーンゲノムのpIXの断片を標的とするPCR分析によって、同じコロニーをスクリーニングするために、フォワードプライマー（AGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTT）を混合し、（製造業者のプロトコルに従って）PCRマスターミックス溶液にプライマー（CCAAACAGAGTCTGGTTTTTTATTTAT）とシングルBJ5183コロニーを逆転。 PCRマスターミックス溶液のマニュアルを参照することにより、サーマルサイクラーにサンプルを実行します。
- PAD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-Hisを6としてPCR二重陽性コロニーを指定します。
- プラスミドPAD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5 -彼の6の100 ngのトランスフォームDH5α細胞に、ステップ1.1.4に示します。
- ステップ1.1.4.1に示すように、断片HVR1-KWASを標的とすることによって〜10個のコロニーをスクリーニングするためにPCR分析を使用してください。
- ステップ1.2.2.2に示すように、主鎖ゲノムのpIXの断片を標的とすることによって、同じコロニーをスクリーニングするためにPCR分析を使用してください。
- PAD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-彼の6にフラグメントHVR1-KWASを配列決定するために、フォワードプライマー（TATGTGTGTCATGTATGCGT）を使用します。
変更されたAd5ウイルスベクターのAd5 /の調製H5-HVR1-KWAS-HVR5、彼の6
- 高グルコースDMEM中にFBS（最終10％）、100×非必須アミノ酸（最終0.1ミリモル）、200mMのL-グルタミン（最終2ミリモル）及びペニシリン/ストレプトマイシン溶液（最終1％）を添加して完全培地を構成します。 （85％の加湿条件下で、37℃、5％CO2）培養インキュベーター中で完全培地でヒト胚腎臓（HEK293）細胞を維持します。
- ウイルスのレスキューVEのCTORのAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5、彼の6
- 80％のコンフルエンスで単層を達成するための完全培地および培養O / Nを5 mlを含むつのT-25フラスコ中のHEK293細胞のシード3.0×10 6。
- 3時間37℃で制限酵素PacIで100μlの体積（15単位）でPAD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-彼の6の15μgのを線形化。
- 線形化PAD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5を-彼の抽出6等量のフェノールで二回（1分間万XG）反応を遠心分離することによって：クロロホルム：イソアミルアルコール（25時比：24：1）ヒュームフード中、及び混合溶液（100％エタノールを300μlと酢酸ナトリウムの10μl）を、70％エタノール700μlの逐次遠心分離（10分間10,000×gで）によって。各遠心分離工程において、上清を捨てます。
- 蒸留水〜40μlあるいはトリスEDTA（TE）緩衝液中の精製プラスミドを再懸濁します。光学ドを測定することにより、プラスミドDNAを定量260 nmでnsity（OD）。
- 製造元のマニュアルに従って、T-25フラスコ内の商業リポソームトランスフェクション試薬との線状化プラスミド3μgのをトランスフェクト。 6時間培養インキュベーター中でトランスフェクション後、その後のインキュベーションで完全培地でのトランスフェクション培地を変更します。個々のウイルスプラークが形成されるまで、2〜3日ごとに完全培地を交換することによりトランスフェクトされた細胞を維持します。
- プラークは、完全細胞変性効果（CPE）を開発する場合、4℃で10分間、300×gで培地を遠心分離することにより無菌フード、収穫細胞溶解物にフラスコから残りの細胞をこすり取ります。 2％のFBSを含む培地〜1ml中の細胞ペレットを中断し、凍結融解を4回によって、細胞を破壊。 4℃で10分間10,000×gで溶解物を遠心分離した後にレスキューされたウイルスを含む上清を収集します。
- ウイルスベクターのAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5 -彼の6の大規模な伝播
- 目を伝播T-25フラスコから完全溶解液に1/3に感染させることにより、無菌フード内のHEK293細胞を含むT-75フラスコ内の電子ウイルス。完全なCPEが培養インキュベーターで2〜3日以内に発症することができます。ステップ2.2.5で述べたように溶解物の上清を収穫。
- ウイルス増殖の条件に応じて、T-75フラスコから完全な溶解物を1/2に感染させることにより、無菌フード内の二時五十九T-175フラスコ中でウイルスを増殖。完全なCPEが培養インキュベーターで2〜3日以内に発症することができます。ステップ2.2.5で述べたように溶解物の上清を収穫。
- 以前のT-175フラスコ（複数可）からの完全溶解液に1/2に感染させることにより、無菌フード内の1ダース以上のT-175フラスコ中でウイルスを増殖。ウイルス増殖条件と必要としているウイルスの量に基づいて、フラスコの使用量を決定します。完全なCPEが培養インキュベーター中で2〜3日以内に発生した場合、ステップ2.2.5で述べたように溶解物の上清を収穫。
- Purif塩化セシウムによるのAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5 -彼の6のication
- 塩化セシウムとの接触を回避しながら、1.33グラム/ mlおよび1.45グラム/ mlの5 mMのHEPES中のCsCl溶液の2密度を準備します。
- 負荷滅菌超遠心管中で塩化セシウム（1.33グラム/ ml）の4mlを、ゆっくり管の底部に対して塩化セシウム（1.45グラム/ミリリットル）の4ミリリットルをロードします。無菌フード内のグラデーションの上にゆっくりと溶解液上清の負荷4ミリリットル。
- 欠陥/高いウイルス帯から成熟/下ウイルスバンドを分離するために4℃で3時間110,000×gでチューブを遠心。 33 G針で武装3ミリリットル注射器を使用して、下のバンドを収集し、無菌フード内の4ミリリットルボリュームに5 mMのHEPESでバンドを希釈。
- ステップ2.4.2で説明したように、2つのCsCl溶液の密度およびウイルスの希釈バンドと別のチューブをロードします。 4℃で11万XGのO / Nでチューブを遠心します。ステップ2.4.3で説明したように、ウイルスバンドを収集します。
- dialysで収集したウイルス液を注入し無菌フード内で33 G針で武装3ミリリットル注射器によりカセットです。
- 1×透析緩衝液700mlの中にカセットを置きます（1 Lレシピ：10×100mlのPBS、100％グリセロールを100mlの蒸留水800ミリリットル、0.22μmのフィルターを通してバッファをフィルタリングする）と、透析緩衝液を交換するごとに3 4回時間。針付き注射器を用いて透析ウイルス液を吸引除去します。
レスキューウイルスベクターの3検証
- ウイルスベクター滴定
- 小さなチューブにおけるウイルス溶解緩衝液（トリスEDTAで10％SDS）で20、および56℃で、すべてのチューブをインキュベート：10〜1：ウイルスの物理的力価は、1でウイルスと透析緩衝液（バックグラウンドコントロール）の両方を希釈10分。
- バイオフォトメーターの電源をオンにし、OD 260 nmでの吸光度のモードを設定します。 「ブランク」下部をクリックすることにより、バックグラウンド信号のバランスをとるために：希釈透析バッファー（10 1）を使用します。バイオフォトメーターSCRの「10 + 90」と入力しEEN、および希釈したウイルス（1：10）の信号を読み出します。
- ステップ3.1.2での方法に従うことにより、代わりにバイオフォトメーター画面に「5 + 95」を入力します。希釈したウイルス（20 1）の信号を読みます。 1.1×10 12で2ウイルス読み出し数を乗算し、2の希釈から2個々の力価に基づいて、VP / mlのような単位での平均力価を計算します。
- ウイルス感染力価（IP / ml）のために、10日後の感染にHEK293細胞に感染の深さを決定するために統計的なカーバーTCID 50法14を使用して（解像度）
- ウイルスベクターの抗原暴露表示の評価
- コートELISAプレートにおけるウイルスベクターとは、標準的なELISA法14の残りの手順に進みます。取り込まれた抗原14を対応の検出のためのヒト抗gp41の （2F5）モノクローナル抗体（mAb）およびマウス抗Hisタグモノクローナル抗体を使用してください。
- denatuにウイルスベクターを解決赤のタンパク質ゲル電気泳動（SDS-PAGE）および標準ウエスタンブロット法14の残りの手順に進みます。取り込まれた抗原14を対応の検出のためのヒト抗gp41の （2F5）モノクローナル抗体（mAb）およびマウス抗Hisタグモノクローナル抗体を使用してください。
- のAd5-positve血清をバイパスする能力にベクターのin vitro評価
- （85％の加湿条件下で、37℃、5％CO 2）培養インキュベーター中、完全培地中でHeLa細胞を維持します。最小必須培地イーグル（MEME）にFBS（最終10％）を添加して完全培地を構成し、200mMのL-グルタミン（最終2mMの）およびペニシリン/ストレプトマイシン溶液（最終1％）。
- 2時間、1×10 6細胞/ウェルでシード、6ウェルプレート中のHeLa細胞を、そして（85％加湿条件下で、37℃、5％CO 2）培養インキュベーター中でプレートをインキュベートします。 （ウイルスベクターの5 IP /セルとのAd5陽性血清（0.1μlあるいは0μl）をインキュベート細胞を含む6ウェルプレート上に混合物を添加する前に1時間培養インキュベーター中でのAd5またはのAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5 -彼の6）。
- 24時間での感染（HPI）を投稿し、溶解緩衝液0.5mlのPBSと溶解細胞で細胞を1回すすいでください。 5分間、15,000×gで遠心分離し、上清を収集します。ウイルスは、ルシフェラーゼ遺伝子が含まれているため、ルシフェラーゼ信号読み出しのためのルシフェラーゼ基質100μlを20μlの上清を混ぜます。
レスキューウイルスベクターの4免疫学的評価
- Ad5のとのAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-彼の6：2の免疫グループを準備します。
- 2週間の間隔で、相同「プライム-ブースト」の免疫レジメンにおいて、1×10 10 VP /マウスでウイルスを筋肉内マウス（n = 8 /群）を注入します。
- すべての注射後2週間目に、動物にランセット（5ミリメートルのチップ長）で出血頬によって麻酔なしでマウスを出血1.5ミリリットルチューブに血液を採取。
- 上下反転してによってチューブに血液を混和し、室温で30分間血液をインキュベートします。新しい1.5 mlチューブに4℃、転送血清（上層）で5分間万×gでチューブをスピン。
- 5 4℃で分と新たに-80℃で貯蔵1.5 mlチューブをマークする転送血清10,000×gで新しいチューブをスピン。
- 血清ベースのELISAによって抗原特異的体液性免疫の評価
- 彼のペプチド（1mmにストック）およびHIV-1ペプチド（1mmにストック）別途100で希釈します。
- mMの炭酸塩緩衝液（pH 9.5）、10μMのペプチドでコーティング濃度を達成します。ウェルあたり100μLを添加し、4℃でプレートO / Nをインキュベートすることによって、別々に希釈したペプチドでコーティングしたELISAプレートを。
- 200μL/ウェルで1時間ブロックPBST中の5％BSAで4回PBSTでプレートを洗浄します。ブロッキングbufに1：100希釈でプレートにマウス血清を適用しますFER、100μl/ウェル。室温で2時間インキュベーションインキュベートします。
- 4回PBSTでプレートを洗浄します。 100μl/ウェルでブロッキング緩衝液中で室温で30分間インキュベートすることによりプレートをブロックします。
- 100μL/ウェルで個々に彼のペプチドおよびHIV-1ペプチドでコーティングされたプレートの両方に：ヤギ抗マウスIgG-HRP（ブロッキング緩衝液中1：5000）を適用します。室温で2時間インキュベートします。 PBSTでプレートを洗浄します。
- 30分間HRP基質とインキュベートした後、OD450 nmでプレートを読みました。
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Representative Results
抗原キャプシド組み込み戦略（ 図1A）は 、二価のAd5ウイルスベクターのAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-Hisの6を生成するために利用されました。まず、シャトルプラスミドHVR1-KWAS-HVR5-彼6 / pH5Sは、以前の構築シャトルプラスミドHVR5-彼6 / pH5S 17にHVR1-KWAS断片をサブクローニングすることにより構築しました。第二に、プラスミドPAD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5 -彼の6 14」のEcoRI-HVR1-KWAS-HVR5-のHis6-のPmeI」の断片とのSwaIで線状PAD5 /ΔH5との間の相同組換えによって構築した（GL ）16（ 図1B）。のPacIのトランスフェクションは、消化PAD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-彼のウイルスベクターのAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5 -彼の6〜14の救出にT-25フラスコリード6が 。救出ウイルスベクターは、その後、大量に増殖させ、CsCl勾配超遠心分離の2サイクルにより精製しました。
のために救出ウイルスベクターのAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-彼の6の生存率/フィットネスを実証する、物理的な力価は1.3×10 11ウイルスゲノムの物理的なコピーを測定することによってミリリットルVP /、および感染力価であった測定されました実際の感染性ウイルス粒子を滴定することによって1.4×10 9 IP / mlで測定しました。 VP / IP比は、その後、92 14で算出した。通常、千以下VP / IP比の広告は、このウイルスの定性的な適合性を示しています。このレスキューされたウイルスは抗原性HIV抗原およびウイルスカプシド主要なタンパク質hexon5の表面にそれぞれHisタグを表示するかどうかを実証するために、ELISAは、それぞれ、ヒト2F5 mAbおよびマウス抗Hisタグモノクローナル抗体を用いて行きました。結果は負の制御への結合がなかったのに対し、ヒト2F5モノクローナル抗体（ 図2A）14とマウスの両方が抗Hisタグモノクローナル抗体（ 図2B）14 は 、Ad5の/ H5-HVR1-KWAS-HVR5-彼の6への結合を示したことが示されましたLベクトルのAd5。ヒト2F5モノクローナル抗体（ 図2C）14、マウス抗Hisタグモノクローナル抗体（ 図2D）14の両方が唯一のウイルスのAd5 / H5- 117 kDaの周りに特異的なバンドを検出したウエスタンブロット分析は、ELISAのデータを確認するために使用されましたHVR1-KWAS-HVR5 -彼の6、hexon5タンパク質のサイズに対応しています。の可能性を評価するために、Ad5の/プロトコルセクション3.3で述べたようにH5-HVR1-KWAS-HVR5 -彼の6のAd5陽性血清による中和を回避するには、中和アッセイ分析を行いました。結果は、Ad5の-positve血清0μLで処理ウイルスベクターのAd5からの相対発光単位（RLU）信号のAd5-positve血清（p値<0.001の0.1μLで処理し、同じベクターからの12倍以上であることを示し）。これは、Ad5の-positvive血清によってベクトルのAd5の中和を示唆しました。これとは対照的に、ウイルスベクターのAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-彼の6からほとんど差がありました0μLとのAd5-positve血清の0.1μL（ 図3）で処理しました。ヘキソンは、中和エピトープはヘキソン12,18の全てのHVR内に存在する主要な広告のNABの目標、およびヘキソン特異的であるため、データは、上記のAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-彼の6のAd5-positve血清による中和をエスケープしていることを実証しましたin vitroおよびホストでのAd5 PEIを回避する上でのAd5 /の潜在H5-HVR1-KWAS-HVR5-彼の6を示唆しました。
抗原キャプシド取り込み戦略に変更された二価のAd5ウイルスベクターが組み込まれた抗原の関心に固有の堅牢な体液性免疫を誘発することができるかどうかを調べるために、「プライム - ブースト」免疫化計画は、コントロールのウイルスベクターのAd5でマウスを免疫化するために適用し、二価のベクトルのAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-彼の6。 HIV-1ペプチドでコーティングされた血清ベースのELISAは、Ad5の/ H5-HVR1-KWAS-HVR5 -彼の6の予防接種群からの血清はsignificanを有することを示しました対照群（p値<0.001）（ 図4A）、14の血清と比較した場合、tは、40と640との間の希釈でHIV-1ペプチドに結合します。彼のペプチドでコーティングしたELISA血清ベースは、対照群の血清と比較した場合のAd5 /の予防接種群由来の血清H5-HVR1-KWAS-HVR5 -彼の6統計のp値として、彼のペプチドに対する有意な結合を有することが示されました< 320希釈（ 図4B）14時160の希釈およびp値で40と80の血清希釈で0.001、p値<0.01 <0.05。上記の結果は、二価のウイルスベクターに組み込まれた抗原に対する体液性免疫応答の発生を示しました。
抗原キャプシド取り込み戦略とプラスミドPAD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5 -彼の6の遺伝的構造の図1模式図。 （A）抗原キャプシド取り込み戦略を直接アデノウイルスのキャプシドタンパク質（ヘキソン、ペンタベースのpIX及び/又は繊維）上の抗原の関心を表示することを特徴とします。この図は、Nemerowのから適合したら 、2009年ウイルス学384（2009）380から388は、著作権エルゼビア。（B）遺伝子断片（HVR1-KWAS）を合成し、会社によってpUCベクターにクローニングしました。この断片をHVR5、彼の制限により6 / pH5SはのAgeIおよびAccIでは、HVR1-KWAS-HVR5-彼6 / pH5Sを生成する酵素以前に構築シャトルプラスミドにサブクローニングしました。得られたシャトルプラスミドを再結合バックボーンプラスミドPAD5 / H5-HVR1-KWASの生成をもたらす、相同組換えのために（GL）を酵素EcoRIおよびPmeIで消化し、SwaIで線状化プラスミドバックボーンPAD5 /ΔH5で同時形質転換しました-HVR5-彼の6。この図では、R1は、HVR1を表し、R5は、HVR5であり、GLは、緑色蛍光タンパク質（GFP）とlucifeを表しRASE、別に。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
二価のウイルスベクターのキャプシド表面に組み込まれた抗原の抗原暴露の図2。評価のAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-彼組み込ま抗原は、ベクターにさらされた場合のELISAを決定するために実施された6。全体のウイルスベクター表面は独自の抗原性特性を維持します。 ELISAプレートは、二価のベクターで被覆された、およびヒトモノクローナル抗体2F5（A）またはマウス抗Hisモノクローナル抗体（B）とインキュベートしました。データは、二価のベクトルにではなく、制御ベクトルのAd5に対する抗体の有意な結合を示しました。 R1-KWAS-R5-彼の6は、Ad5の/ H5を示し、-HVR1-KWAS-HVR5-彼の6。ウェスタンブロット分析は、二価のベクターに組み込まれた抗原に対するヒトモノクローナル抗体2F5（C）またはマウス抗Hisモノクローナル抗体（D）の結合、抗原性を確認しました。両方の（C）及び（D）において、レーン1は、Ad5のを示し、レーン2は示しているのAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-彼の6。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
in vitroでのAd5-positve血清による中和を逃れるために、二価のウイルスベクターの能力を図3。評価。中和アッセイは、二価のベクターは中和を逃れることができるかどうかを決定するために実施しました。結果は、血清によるのAd5ウイルスの中和を示したが、ESin vitroでの二価のウイルスの中和の岬。この図では、R1-KWAS-R5-彼の6は、Ad5の/ H5-HVR1-KWAS-HVR5-彼の6を示しています。アスタリスク*** p値<0.001を示します。
マウスモデルにおいて、二価のウイルスベクターによる体液性免疫の生体内生成に図4。血清ベースのELISAは、二価のベクトルのAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-Hisを6に組み込まれたタンパク質に対する体液性免疫を評価するために使用しました。 HIV-1ペプチド（A）およびHisペプチド（B）は、二つの免疫群のマウス血清とのインキュベーションに続いて、個別にELISAプレートに被覆した（Ad5のとのAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-Hisを6） 。データは、H中のHIV-1抗原に対する体液性免疫応答の重要な生成を示しましたVR1（A）とHVR5におけるHisタグ（B）。各データポイントは、8つの反復からの手段とSDを表します。アスタリスク** *** p値<0.01を示し、* p値<0.05を示し、p値<0.001を示します。
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Discussion
ワクチンの開発のためのAd5変更の伝統的な導入遺伝子戦略の適用は主に、Ad5のPEI 4,6に関連するボトルネックに減少されました。この戦略は、抗原の関心とのAd5の中和エピトープを交換したAd5のNABによる中和を回避し、強固な免疫の発生を促進することができるので、このボトルネックは、部分的に、代替的な抗原キャプシド組み込み戦略（ 図1A）を適用することによって低減することができます取り込まれた抗原の興味に。本研究では、修正された二価のウイルスベクターの生成のAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5 -彼の6概念例（ 図1B）として導入されました。プロトコルセクション1.1.1に対応して、順序付けられたプラスミド中の合成断片はhexon5のHVR1ロケールでのHIV-1 gp41の短い遺伝子置換が含まれています。部分のgp41遺伝子を置換するエピトープELDKWASをコードしますhexon5 14の144個 のアミノ酸139から部分HVR1。 ELDKWASは、HIV-1 gp41の19で強力な中和エピトープです。
クローン作成時に、2つの重要なステップがありました。プロトコルセクション1.1.1における遺伝子断片の関心を合成する際に1つのステップは、2つの制限酵素の選択でした。 2つの酵素の選択は、条件付きで、すなわち 、変更する広告キャプシドの位置に依存する。本研究では、KWASを含む遺伝子断片をhexon5タンパク質のHVR1に組み込むように指定されました。制限はをAgeIおよびAccIでは、N末端で別々に存在し、HVR1ロケールのC末端フランキング領域、したがってをAgeIおよびAccIでは、個別にN末端およびC末端に置かれるように選択した、フラグメントHVR1-KWASに存在しない酵素合成された断片HVR1-KWASの末端。ヘキソンは広告のNABの主要な標的であり、ヘキソン特異的中和エピトープはヘキソン12,18の全てのHVR内に存在するので、それは番目のことが可能です抗原キャプシド取り込み戦略と電子ヘキソン修正されたAd5ベクターは、in vitroでのAd5陽性血清による中和を回避する能力を獲得し、ホストであってもAd5のPEIができました。本研究では、二価のウイルスベクターの両方HVR1とHVR5はAd5の陽性血清による中和の脱出に貢献する可能性があります。他の重要なステップは、プロトコルセクション1.2.2にありました。 LB寒天上で同時形質転換混合物のO / Nインキュベートした後、成長したBJ5183コロニーは、O / Nのための液体LB中ですぐに培養する必要があり、プラスミドは、すぐにも同様にBJ5183細胞から抽出される必要があります。 BJ5183細胞内で組み換えプラスミドが安定しないため、手順を遅らせることは可能性が、潜在的な組換えおよび変異につながります。相同組換えの正しいプラスミドを安定かつ正確なゲノムの種を維持するために、DH5αに形質転換される必要があります。
クローニングの後、さらに2つの重要な段階がありました。ザプロトコルセクションの最初のステップは、トランスフェクションについてです。これは、骨格プラスミドはE1遺伝子が削除された場合、Ad5のE1（HEK293）を発現する細胞に組換え広告主鎖プラスミドをトランスフェクトすることが必要です。プロトコルセクション2.3の他のステップは、ウイルスアップスケーリングについてです。ウイルスアップスケーリングのための基本的な手順は、T-75フラスコにとT-175フラスコにT-25フラスコからの標準的なウイルスのアップスケーリングの原則に従っています。しかし、使用するためのフラスコ（T-75および/またはT-175）の数は、ウイルス、ウイルス感染によって引き起こされるCPEの開発、および必要ウイルス量の成長速度に依存します。
抗原キャプシド取り込み戦略は、広告の変更に広く適用することができます。この戦略では、そのようなヘキソン2,4,20、ペントンベース21とファイバ22などの異なるカプシドの主要なタンパク質、上の異種抗原を変更したり、組み込むことが可能です。カプシド微量タンパク質のpIXのC末端もheterolための約束を示しましたogous抗原/ペプチドの取り込み21,23。単一の変更のほかに、この戦略と広告の複数の修飾はまた、成功を達成しました。例としては、二価のAd5 /の生成H5-HVR1-KWAS-HVR5-彼hexon5のHVR1とHVR5の両方での取り込みによって、この研究では6、HVR1及びHVR2またはHVR1のいずれかへのエンテロウイルス型71の2中和エピトープを組み込むことであり、 HVR4、またはhexon3 24のHVR1とHVR5。これらの例は、遺伝子治療またはワクチン接種アプローチのいずれかのために、広告の他の血清型でのヘキソン改変の可能性を暗示します。我々のデータはまた、ヘキソンおよびPIX（未発表データ）に2 クルーズトリパノソーマエピトープのの取り込みを示しました。この戦略はまた、ワクチン接種または遺伝子治療アプローチのいずれかのために、キメラAdベクターを作製するために拡張されています。例としては、hexon3ウィスコンシンを切り替えることによりhexon3 16、キメラAd3H7の発生とhexon5切り替えることによりキメラAd5H3の発生しています第hexon7 25、およびAD4繊維26でAd5ファイバーを交換することにより、キメラAd5F4の生成。
本研究では、二価のAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5は、彼の6は、取り込まれた抗原の興味に特異的体液性免疫応答の誘発を示しました。私たちの現在のプロジェクトは、抗原キャプシド取り込み戦略に、ASP2特異的CD8 T細胞応答が著しくのAd5のベクトルのAd5-PIX-ASP2タンパク質IX（PIX）にASP2ペプチドを組み込むことによって生成された、との免疫によりプライミングされることを示しています（データ示さず）。 ASP2が、また無鞭毛表面タンパク質2という名前の、世代交代型の細胞内寄生原虫クルーズトリパノソーマ（T.クルージ ）27の免疫抗原です。この新しい実験的な知見は、Adベクター化ワクチンの抗原キャプシド取り込み戦略のアプリケーションは、体液性免疫応答だけでなく、携帯IMMUNないだけを誘発することができることを我々の知識を拡張します抗原の興味に特定の電子応答。
伝統的な導入遺伝子戦略に比較的有利なものの、抗原キャプシド取り込み戦略はまた、3つの欠点があります。まず、それは限り、伝統的な戦略がするように目的遺伝子の組み込みを可能にすることはできません。それはhexon5上の抗原キャプシド取り込み戦略はHVR1で最大80個のアミノ酸（AA）、HVR5 77 AA及びHVR2 2で57 AAの挿入を可能にすることが報告されています。このうち、HVR1は、組み込みのための最も許容ロケールです。しかし、マイナーカプシドタンパク質PIXは千個のアミノ酸28の挿入に対応することができます。第二に、いくつかの抗原の関心自然の中では、そのような広告のウイルスの構造配置を破壊するようで、アミノ酸の電荷と力、などの要因に、広告のカプシドタンパク質に組み込むことに失敗します。この場合には、適切なスペーサーの導入が目を助けることができる抗原の関心にリンクされています電子成功組み込み4。第三に、いくつかのHVRのロケールでの取り込みは、 すなわち 、HVR6またはHVR7は、生存ウイルスベクター12の障害が発生した発生につながる可能性があります。両方の戦略の利点と欠点を考慮すると、2つの戦略または両方の戦略の組み合わせから賢明な選択は、特定の条件/ニーズに依存します。戦略の両方をコーミングの例は、抗原キャプシド取り込み戦略hexon5のHVR2に組み込まれたHIV-1 gp41wasののAd5 / HVR2-MPER-L15（GAG）の発生、それによって膜近位外部領域（MPER）でありますおよびHIV-1 gag遺伝子は、従来のトランスジーン戦略2とのAd5のE1遺伝子のロケールを交換するために挿入しました。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この作品は、国立衛生研究所5T32AI7493-20と5R01AI089337-03を付与することによって部分的にサポートされていました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、公開することを決定、または原稿の準備で何の役割も持っていません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x DPBS | Thermo Scientific | SH30256.01 | for cell spliting |
| 10x DPBS | Thermo Scientific | SH30378.02 | for dialysis buffer preparation |
| glycerol | SIGMA | G5516-1L | for dialysis buffer preparation |
| SDS | BIO-RAD | 161-0301 | for virus lysis buffer preparation |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | SH30910.03 | component of culture medium |
| 100x Non-Essential Amino Acids | Thermo Scientific | SH30238.01 | component of culture medium |
| 200 mM L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | component of culture medium |
| penicillin/streptomycin solution | Cellgro | 30-002-CI | component of culture medium |
| DMEM with high glucose | Thermo Scientific | SH30081.01 | for HEK293 cell culture |
| Minimum Essential Medium Eagle | SIGMA | M5650 | for HeLa cell culture |
| phenol:chloroform:isoamyl alcohol | SIGMA | P3803-100ML | for large size of DNA purification |
| cesium chloride | Research Products International Corp. | C68050 | for virus purificiation |
| HEPES | Cellgro | 25-060-CI | for CsCl solution preparation |
| HEK293 | ATCC | 51-0036 | for virus rescue and upscale |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | for neutralization assay |
| T-25 flask | Thermo Scientific | 156367 | for cell culture |
| T-75 flask | CORNING | 430641 | for cell culture |
| T-175 flask | Thermo Scientific | 159910 | for cell culture |
| Ultracentrifuge | BECKMAN | NA | for virus purification |
| Ultracentrifuge tube | BECKMAN | 344059 | for virus purification |
| dialysis cassette | Thermo Scientific | 66380 | for virus dialysis |
| ELISA plate | Thermo Scientific | 442404 | for ELISA |
| human anti-gp41 (2F5) mAb | NIH AIDS Reagent Program | 1475 | for immunological assays |
| mouse anti-His tag mAb | GenScript | A00186 | for immunological assays |
| SOC medium | CORNING | 46-003-CR | for transformation |
| PCR master mix solution | QIAGEN | 201445 | for PCR |
| Animal lancet (point length at 5 mm) | MEDIpoint | for mice bleeding | |
| Biophotometer | Eppendorf | for virus physical titer titration |
References
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