Здесь мы приводим протокол для создания типа двухвалентный аденовирус 5 (Ad5) вектор доказательство из-принцип Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 с использованием стратегии антиген капсида-регистрации. Этот вектор был продемонстрирован демонстрируют качественное пригодность, возможность избежать Ad5-положительные сыворотки в пробирке, и антигенность, а также иммуногенность к объединенной антигенов.
Аденовируса серотипа 5 (Ad5) была значительно изменена с традиционными методами трансгенных по разработке вакцин. Сокращение полезного действия этих традиционно модифицированных векторов Ad5 в клинических испытаниях может быть, прежде всего, коррелирует с Ad5 уже существующей иммунитета (PEI) среди большинства населения. Способствовать развитию вакцины Ad5-векторная по решению обеспокоенность Ad5 PEI, была использована инновационная стратегия антиген капсида-Включение. По заслугам этой стратегии, Ad5-векторная мы сначала построили трансфер Hexon плазмиды HVR1-Kwas-HVR5-6 / Его pH5S субклонированием гипервариабельный область (HVR) 1 из Hexon в построенной ранее трансфер плазмиды HVR5-6 / Его pH5S, который имел Его 6 тега включены в HVR5. Этот фрагмент ДНК, содержащий HVR1 ВИЧ эпитоп ELDKWAS был синтезирован. HVR1-Kwas-HVR5-6 / Его pH5S тогда линеаризуется и котрансформируют с линеаризованной плазмиды основой pAd5 / ΔH5 (GL),для гомологичной рекомбинации. Это рекомбинации плазмиды pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 трансфицировали в клетки, чтобы генерировать вирусный вектор Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-6 Его. Этот вектор был проверен, чтобы иметь качественный пригодность указанную вирусной физическое титра (VP / мл), инфекционный титр (IP / мл) и соответствующее отношение / IP VP. Оба эпитоп ВИЧ и его 6 тега были экспонированы на поверхности капсида на Ad5, и сохранил эпитоп конкретного антигенность самостоятельно. Нейтрализация анализ показал способность этого вектора двухвалентного обойти нейтрализации Ad5-положительные сыворотки в пробирке. Иммунизация мышей показали поколение надежной гуморальный иммунитет, специфичные для эпитопа ВИЧ и его 6. Это доказательство правильности принципа исследование показало, что протокол, связанный со стратегией антиген капсида-Регистрации может быть реально использованы для генерации Ad5-векторной вакцины, изменяя различные белки капсида. Этот протокол может быть даже Further модифицированы для генерации редких серотипа аденовирусов векторная вакцин.
Аденовируса человека (БА) является среднего размера, не охватило вирусов с икосаэдрического нуклеокапсиде содержащей двухцепочечной ДНК генома. Объявление принадлежит к семейству Adenoviridae, с классификацией в семи группах (A через G). Каждая группа содержит вирус различных серотипов. Из которых, аденовирус серотипа 5 (Ad5) из группы С был наиболее широко изучены и наиболее широко применяется для векторной подходов, таких как генной терапии и вакцинации.
Традиционная стратегия трансген были разработаны и применены для Ad5 модификаций, которая характеризуется смещением вирусных ранних генов с генами из интересов и целенаправленной экспрессии гена-из-интерес у хозяина. Примерами являются строительство pENV9 / Ad5hrΔE3 путем замены раннего гена 3 (E3) с геном оборотов в Simian вируса иммунодефицита 1, строительство AdCMVGag путем замены раннего гена 1 (Е1) с геном затычки иммунодефицита человекаВирус (ВИЧ) 2, и строительство ас объявление Z путем замены E1 с ас Z гена 3. Широкое применение в традиционной стратегии трансгенной на Ad5 зависит от следующих достоинств: широкий диапазон хозяев для Ad5, реализуемого генной инженерии на вирус и распространения вируса, большой размещения внешней гена вставки и безопасности Ad5 4,5. Тем не менее, снижение полезного действия Ad5-векторной клинической терапии с использованием этой стратегии была основным узким местом, которое было отображаются на в первую очередь связано с Ad5 PEI, так Ad5 настолько распространено среди большинства детей и взрослых 4,6.
Чтобы преодолеть основную узкое Ad5, основная цель заключается в разработке альтернативной стратегии в обход Ad5 PEI. Врожденный иммунитет 7, адаптивного иммунитета, такие как нейтрализующие антитела (NABS) 8-10 и CD8 + Т-клеточных ответов против 10 Ad5 как было показано, совместноntribute к Ad5 PEI, с Ad5 NABS появляться играть доминирующую роль в взносов Ad5 PEI 10,11. Кроме того, Ad5 NABS целевые эпитопы, локализованные в белков капсида, в том числе основной Hexon белка, волокна и Пентон базы. Из которых, Hexon является главной мишенью Ad5 NABS 8,11-13. Основываясь на этих выводах, инновационная стратегия антиген капсида-Включение была введена. Это новая стратегия подчеркивает замену или включение белков интересов, на Ad5 белков капсида, которые посменно маскирует Ad5 нейтрализующие эпитопы, приводит к пониженной признания в NABS и эффективных администраций векторных Ad5. Стоит отметить, что эта стратегия является конкурентоспособной, потому что она также может помочь выявить хозяева надежную гуморальный иммунитет и клеточный иммунитет мощный непосредственно представляя антигены интересов, для иммунной системы 4,14,15. Основываясь на этой стратегии, молекулярное клонирование и рекомбинантный вирусный вектор объявления спасение может быть структурно разделенна четыре основных этапа: (а) подготовка гена интересов, либо фрагментом полимеразной цепной реакции (ПЦР) или синтеза; (Б) перевязка фрагмента гена в челночный плазмиды, содержащей ген интересов, фрагмент и гомологичные руки к аденовирусной позвоночника; (С) гомологичной рекомбинации путем совместного преобразования трансфер плазмиду, содержащую ген, представляющей интерес фрагмент с линеаризованной плазмидой магистральной pAd5 / ΔH5 (GL) 16; (D) трансфекции линеаризованной рекомбинантной аденовирусной плазмидой, чтобы спасти рекомбинантный вектор объявление объединена с антигенами-на-интерес.
Наша группа и некоторые другие расширили эту альтернативную стратегию инкорпорации объявление для развития векторная вакцина против Ad различных инфекционных возбудителей. Мы сообщили поколение рекомбинантного вектора Ad Ad-HVR1-LGS-His 6 -v3 путем включения His-меченый ВИЧ-1 антиген V3 в HVR1 локали Ad5 Hexon (hexon5). Это вызвало вектор срабатывает улOng гуморальный иммунный ответ на конкретный эпитоп V3 4. Мы также сообщили о разработке Ad5 / HVR2-MPER-L15ΔE1 путем включения ВИЧ-1 мембранного проксимального эктодомена область (MPER) в HVR2 локали hexon5 2. Кроме того, группа доктора Чжоу использовал преимущества этой стратегии инкорпорации объявления развивать серотип объявление 3 (Ad3), переносимые вакцины, то есть., Поколение вирусный вектор R1SP70A3 путем включения нейтрализующий эпитоп SP70 энтеровирусной 71 в HVR1 из Ad3 Hexon (hexon3). R1SP70A3 генерируется сильные NABS и производство IFN-γ, характерные для эпитопной SP70, которые приводят к высокой скорости защиты от энтеровирусов 71 вызов 15.
Для технического руководства, наше исследование воспользовался качественной стратегии антиген капсида-Регистрации, чтобы сосредоточиться на генерации двухвалентного Ad5 вектор Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 путем включения ВИЧ-1 антигена в HVR1да Его тег в HVR5 из hexon5. Генерируется вирусный вектор был также иммунологически оценены. Стратегия антиген капсида-Включение могут быть использованы на развитие Ad5-векторной подходов вакцинации против различных инфекционных заболеваний.
Применение традиционной стратегии трансгенной о внесении изменений Ad5 для разработки вакцин была ослаблена в первую очередь из-за узкого связанного с Ad5 PEI 4,6. Это узкое может быть частично уменьшена путем применения альтернативных антиген капсида-Включение стратегии (рис 1А)…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была частично поддержана Национальным институтом здравоохранения предоставляет 5T32AI7493-20 и 5R01AI089337-03. Доноры не было никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи.
1x DPBS | Thermo Scientific | SH30256.01 | for cell spliting |
10x DPBS | Thermo Scientific | SH30378.02 | for dialysis buffer preparation |
glycerol | SIGMA | G5516-1L | for dialysis buffer preparation |
SDS | BIO-RAD | 161-0301 | for virus lysis buffer preparation |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | SH30910.03 | component of culture medium |
100X Non-Essential Amino Acids | Thermo Scientific | SH30238.01 | component of culture medium |
200mM/L L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | component of culture medium |
penicillin/streptomycin solution | Cellgro | 30-002-CI | component of culture medium |
DMEM with high glucose | Thermo Scientific | SH30081.01 | for HEK293 cell culture |
Minimum Essential Medium Eagle | SIGMA | M5650 | for HeLa cell culture |
phenol:chloroform:isoamyl alcohol | SIGMA | P3803-100ML | for large size of DNA purification |
cesium chloride | Research Products International Corp. | C68050 | for virus purificiation |
HEPES | Cellgro | 25-060-CI | for CsCl solution preparation |
HEK293 | ATCC | 51-0036 | for virus rescue and upscale |
HeLa | ATCC | CCL-2 | for neutralization assay |
T-25 flask | Thermo Scientific | 156367 | for cell culture |
T-75 flask | CORNING | 430641 | for cell culture |
T-175 flask | Thermo Scientific | 159910 | for cell culture |
Ultracentrifuge | BECKMAN | NA | for virus purification |
Ultracentrifuge tube | BECKMAN | 344059 | for virus purification |
dialysis cassette | Thermo Scientific | 66380 | for virus dialysis |
ELISA plate | Thermo Scientific | 442404 | for ELISA |
human anti-gp41 (2F5) mAb | NIH AIDS Reagent Program | 1475 | for immunological assays |
mouse anti-His tag mAb | GenScript | A00186 | for immunological assays |
SOC medium | CORNING | 46-003-CR | for transformation |
PCR master mix solution | QIAGEN | 201445 | for PCR |
Animal lancet (point length at 5mm) | MEDIpoint | for mice bleeding | |
Biophotometer | Eppendorf | for virus physical titer titration |