Burada, bir proof-of-prensibi iki değerlikli adenovirüs tip 5 (Ad5) vektörü oluşturmak için bir protokol mevcut Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 Antijen Kapsid-Ortaklık stratejisi kullanılarak. Bu vektör nitel uygunluk arzettiği gösterilmiştir, yetenek dahil antijenlere Ad5-pozitif in vitro sera'yı ve antijenikliği yanı sıra immünojenitesini kaçmak için.
Adenovirüs serotip 5 (Ad5) yoğun aşı gelişimi için geleneksel bir transgen yöntemleri ile modifiye edilmiştir. Klinik çalışmalarda bu geleneksel modifiye Ad5 vektörlerin azaltılmış etkililiğin öncelikle nüfusun çoğunluğu arasında Ad5 önceden varolan bağışıklık (PEI) ile ilişkili olabilir. Ad5 PEI endişe çözerek Ad5-vektörlü aşı gelişmesini teşvik etmek, yenilikçi Antijen Kapsid-Kuruluş strateji istihdam edilmiştir. Bu stratejinin liyakat, biz ilk hekson mekik inşa Ad5-vektörlü plazmid HVR1-Kwas-HVR5-His önceden yapılmış mekik plazmid HVR5-His 6 / pH5S içine aşırı değişken bölgesi (HVR) Hexon 1. altklonlanmasıyla 6 / pH5S, His 6 etiketi HVR5 dahil vardı. HIV epitopu ELDKWAS ihtiva eden bu HVR1 DNA fragmanı elde edilmiştir. HVR1-Kwas-HVR5-His 6 / pH5S sonra doğrusallaştırılmış ve doğrusallaştırılmış omurga plasmid pAd5 / ΔH5 (GL) ile birlikte transforme edilmiş olanHomolog rekombinasyon için. PAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 hücrelerine transfekte edilmiştir Bu rekombine plazmid, viral vektör Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 oluşturmak için. Bu vektör, viral bir fiziksel titre (VP / ml) ile belirtilen niteliksel uygunluğu, enfeksiyonlu titre (IP / ml) ve karşılık gelen VP / IP oranına sahip doğrulandı. Hem HIV epitopu ve O'nun 6 etiket yüzey maruz Ad5 kapsitinde vardı ve kendi epitop özel antijenisiteyi korudu. Bir nötralizasyon deneyi in vitro Ad5-pozitif serumlar ile nötralize aşmak için bu iki değerli vektörü yeteneğini gösterdi. Fare aşılama HIV epitopu ve 6 His için güçlü bir humoral bağışıklık spesifik oluştuğunu gösterdi. Bu proof-of-prensibi çalışma Antijen Kapsid-Ortaklık stratejisi ile ilişkili protokol fizibil farklı kapsid proteinleri değiştirerek Ad5-vektörlü aşıların üretimi için kullanılabilir öne sürdü. Bu protokol, hatta f olabilirurther nadir serotip adenovirüs vektörlü aşıların üretimi için de uyarlanabilir.
İnsan adenovirüs (Ad), bir çift sarmallı DNA genomunu ihtiva eden bir ikosahedral nükleokapsid sahip bir orta büyüklükte olmayan zarflı bir virüstür. Reklam Yedi gruba bir sınıflandırmaya (G ile A), Adenoviridae familyasına aittir. Her grup farklı serotiplerin virüs içeriyor. Grup C adenovirüs, hangi serotip 5 (Ad5) en yoğun çalışmalar yapılmış ve en yaygın gen tedavisi ve aşı gibi vectored yaklaşımlar uygulanmaktadır.
Geleneksel transgen stratejisi geliştirildi ve gen-faiz ile virüs erken genlerin değiştirmesi ile karakterize Ad5 değişiklikler, uygulanan ve gen-faiz bir ev sahibi odaklı ifadesi olmuştur. Örnekler Simian İmmün Yetmezlik Virüsü 1 rev geni ile erken gen 3 (E3) değiştirerek pENV9 / Ad5hrΔE3 inşaat olan İnsan Bağışıklık Yetmezliği ve gag geni ile erken gen 1 (E1) değiştirerek AdCMVGag inşaatıVirüs (HIV) 2 ve lac Z geni 3 E1 değiştirerek Reklam lac Z yapımı. Ad5 geleneksel transgen stratejisinin geniş uygulama şu esasa bağlıdır: Ad5, virüs ve virüs yayılması üzerine uygulanabilir gen mühendisliği, yabancı gen ucun geniş konaklama ve Ad5 4,5 güvenliği için barındıran geniş. Ancak, bu stratejinin kullanımı ile Ad5-vektörlü klinik tedavilerin azalmış etkililiğin Ad5 çocuklar ve yetişkinler 4,6 çoğunluğu arasında çok yaygın olduğundan, öncelikle Ad5 PEI ile ilişkili olduğu eşlenmiş olan büyük bir darboğaz olmuştur.
Ad5 önemli darboğazı aşmak için, temel amacı Ad5 PEI engellemeyi alternatif bir strateji geliştirmektir. Bu tür nötralize edici antikorlar (yakalar) 8-10 ve CD8 + T hücresi tepkilerinin olarak doğuştan gelen bağışıklık 7, adaptif bağışıklık Ad5 karşı 10 birlikte gösterilmiştirAd5 yakalar Ad5 PEI 10,11 katkıları baskın rol oynamaya görünen ile Ad5 PEI ntribute. Dahası, Ad5 ana protein Hexon, lif ve penton tabanı dahil kapsid proteinleri bulunan hedef epitopları, yakalar. Hangi Of, hekson Ad5 yakalar 8,11-13 önemli hedefidir. Bu bulgulara dayanarak, yenilikçi Antijen Kapsid-Kuruluş strateji girmiştir. Bu yeni strateji, nötralizan antikorların ve verimli Ad5 vektör idareleri azalarak tanınması lider, proteinlerin-faiz Ad5 nötralize epitoplarını vardiya veya maskeleri Ad5 kapsid proteinleri üzerinde değiştirilmesini ya da birleştirilmesini vurgulamaktadır. Aynı zamanda ana doğrudan bağışıklık sistemine 4,14,15 kadar antijenler-faiz sunarak sağlam humoral bağışıklığı ve güçlü hücresel bağışıklığı ortaya çıkarmak yardımcı olabilir, çünkü bu strateji rekabetçi olması dikkat çekicidir. Bu strateji dayanarak, moleküler klonlama ve yeniden birleştirici Reklam viral vektör, bir kurtarma yapısal ayrılabilirdört ana adımlar (a) ya da polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ya da sentez ile gen-faiz fragmanının hazırlanması; (B) bir adenovirüs omurgasına gen bölgesinin çıkar fragmanını ve homolog kollar ihtiva eden bir mekik plazmidinin gen fragmanının ligasyonu; (C) homolog rekombinasyon ko-transforme doğrusallaştırılmış plasmid omurgası pAd5 / ΔH5 (GL) 16 gen-faiz fragmanını ihtiva eden plasmid Servisi; (D) doğrusallaştırılmıştır rekombinant adenoviral plazmid transfeksiyon antijenleri-faiz ile birleşmiş rekombinant Reklam vektör kurtarmak için.
Grubumuzun ve bazıları farklı bulaşıcı patojenlere karşı İlan vectored aşı geliştirilmesi için bu alternatif reklam birleşme stratejisi artırdık. Bir rekombinant Ad vektör üretilmesini bildirdi Ad-HVR1-LGS-His Ad5 hekson (hexon5) arasında HVR1 yereli bir His-etiketli, HIV-1 antijeni V3 içeren 6 -V3. Bu oluşturulan vektör str tetiklediV3 epitopa 4 özgü Ong humoral immün tepkisi. Ayrıca hexon5 2 HVR2 yereli olarak HIV-1 zara yakın ekto bölge (MPER) eklenerek Ad5 / HVR2-MPER-L15ΔE1 gelişimini bildirilmiştir. Buna ek olarak, Dr. Zhou'nun grup Reklam serotip 3 (Ad3) vectored aşılar, yani. Geliştirmek için bu Reklam kuruluş stratejisinin yararları kullandı, Reklam-3'te of HVR1 içine enterovirus 71 nötralize edici epitopu SP70 dahil ederek viral vektör R1SP70A3 nesil hekson (hexon3). R1SP70A3 Enterovirüs 71 meydan 15 karşı koruma yüksek oranda kurşun epitop SP70 özgü güçlü yakalar ve IFN-γ üretimini, üretilen.
Teknik başvuru amacıyla, bizim çalışmamız HVR1 içine HIV-1 antijeni içeren bir iki değerli Ad5 vektörü Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 nesil odaklanmak niteliksel Antijen Kapsid-Kuruluş stratejisi yararlandı birda hexon5 ve HVR5 içine His etiketi. oluşturulan viral vektör, ayrıca immünolojik değerlendirilmiştir. Antijen Kapsid-Ortaklık stratejisi farklı bulaşıcı hastalıklara karşı Ad5-vektörlü aşılama yaklaşımlarının geliştirilmesi yönünde yararlanılabilir.
aşıların geliştirilmesi için Ad5 değişiklik geleneksel transgen stratejisinin uygulama öncelikle Ad5 PEI 4,6 ile bağlantılı darboğaz için azalmıştır. Bu darboğaz kısmen bu strateji Ad5 nötralizan antikorların tarafından nötralize kaçmasına beri antijenlerin-faiz ile Ad5 ve nötralize epitoplarını değiştirerek, alternatif Antijen Kapsid-Ortaklık stratejisi (Şekil 1A) uygulamasıyla azaldı ve sağlam dokunulmazlık nesil kolaylaştırmak olabilir dahil antijenleri…
The authors have nothing to disclose.
Sağlık 5T32AI7493-20 ve 5R01AI089337-03 hibe Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından kısmen desteklenmiştir. fon çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı, ya da yazının hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.
1x DPBS | Thermo Scientific | SH30256.01 | for cell spliting |
10x DPBS | Thermo Scientific | SH30378.02 | for dialysis buffer preparation |
glycerol | SIGMA | G5516-1L | for dialysis buffer preparation |
SDS | BIO-RAD | 161-0301 | for virus lysis buffer preparation |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | SH30910.03 | component of culture medium |
100X Non-Essential Amino Acids | Thermo Scientific | SH30238.01 | component of culture medium |
200mM/L L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | component of culture medium |
penicillin/streptomycin solution | Cellgro | 30-002-CI | component of culture medium |
DMEM with high glucose | Thermo Scientific | SH30081.01 | for HEK293 cell culture |
Minimum Essential Medium Eagle | SIGMA | M5650 | for HeLa cell culture |
phenol:chloroform:isoamyl alcohol | SIGMA | P3803-100ML | for large size of DNA purification |
cesium chloride | Research Products International Corp. | C68050 | for virus purificiation |
HEPES | Cellgro | 25-060-CI | for CsCl solution preparation |
HEK293 | ATCC | 51-0036 | for virus rescue and upscale |
HeLa | ATCC | CCL-2 | for neutralization assay |
T-25 flask | Thermo Scientific | 156367 | for cell culture |
T-75 flask | CORNING | 430641 | for cell culture |
T-175 flask | Thermo Scientific | 159910 | for cell culture |
Ultracentrifuge | BECKMAN | NA | for virus purification |
Ultracentrifuge tube | BECKMAN | 344059 | for virus purification |
dialysis cassette | Thermo Scientific | 66380 | for virus dialysis |
ELISA plate | Thermo Scientific | 442404 | for ELISA |
human anti-gp41 (2F5) mAb | NIH AIDS Reagent Program | 1475 | for immunological assays |
mouse anti-His tag mAb | GenScript | A00186 | for immunological assays |
SOC medium | CORNING | 46-003-CR | for transformation |
PCR master mix solution | QIAGEN | 201445 | for PCR |
Animal lancet (point length at 5mm) | MEDIpoint | for mice bleeding | |
Biophotometer | Eppendorf | for virus physical titer titration |