Summary
Biolistic transformação é um método usado para gerar a integração estável de ADN no genoma das oportunistas Cryptococcus neoformans patogénio através de recombinação homóloga. Iremos demonstrar transformação biolística de uma construção, o qual tem o gene que codifica a quinase de etilo fundido com o marcador fluorescente mCherry em C. neoformans.
Abstract
O basidiomycete Cryptococcus neoformans, um patógeno oportunista invasiva do sistema nervoso central, é a causa mais freqüente de meningite fúngica em todo o mundo, resultando em mais de 625 mil mortes por ano em todo o mundo. Embora electroporação foi desenvolvida para a transformação de plasmídeos em Cryptococcus, apenas entrega biolística fornece um meio eficaz para transformar o ADN linear que pode ser integrado no genoma por recombinação homóloga.
Acetato tem sido demonstrado ser um importante produto de fermentação durante a infecção criptocócica, mas o significado de tal ainda não é conhecida. Uma via bacteriana composto das enzimas xilulose-5-fosfato / frutose-6-fosfato phosphoketolase (Xfp) e cinase de etilo (ACK) é uma das três vias possíveis para a produção de etilo em C. neoformans. Aqui, demonstramos a transformação biolística de uma construção,que o gene que codifica Ack fundido com o marcador fluorescente mCherry, em C. neoformans. Nós, então, confirmar a integração da fusão ACK -mCherry no locus ACK.
Protocol
NOTA: O esquema geral deste protocolo é descrito na Figura 1.
1. C. neoformans Preparação
- Para cada reacção de transformação, um crescer 2-3 ml O / N cultura de C. neoformans em meio YPD a 30 ° C com agitação a 250 rpm.
- Centrifuga-se a cultura D / N durante 5 min a 900 xg a 10 ° C e desprezar o sobrenadante.
- Ressuspender cada pelete de células em 300 ul de levedura peptona dextrose (YPD) médio.
- Usando grânulos de vidro, espalhar suavemente a 300 ul da suspensão de células lavadas em agar YPD, contendo 1 M de sorbitol.
- Permitir placas a secar à temperatura ambiente durante 3-4 h.
2. Ouro microtransportador Preparação
- Ressuspender 0,25 g de 0,6 mm de contas de ouro de 1 ml de ddH2O, centrifugar durante 1 minuto a 900 xg para sedimentar as pérolas, e remover o sobrenadante.
- Ressuspender as contas de ouro em 1 ml de etanol a 100%. </ Li>
- Distribuir os grânulos em 4 tubos, 250 uL de cada, e adicionar 750 ul de etanol a 100%.
- Loja de ouro cordão alíquotas a 4 ° C.
3. Preparação DNA
- Prepare discos microtransportador biolísticos laranja, submergindo-os em 100% de etanol, usando uma pinça. Coloque os discos em uma grande placa de petri contendo drierite para secar (certifique-se a drierite não toca nos discos).
- Depois de seco, pressione os discos microtransportador nos suportes de disco de prata (previamente limpo com 100% de etanol).
- Vortex grânulos preparados de ouro (tal como no passo 2) e alíquotas de 12 ul num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, um tubo por transformação.
- Adicionar a cada tubo, a fim: 2 ^ g de ADN (preferencialmente 2 ul de 1 mg / mL de ADN), 10 ul de 2,5 M de CaCl2, e 2 mL de 1 M de base livre de espermidina.
- Configurar um controle negativo como no passo 3.4, mas sem DNA.
- Vortex cada tubo e incubar à temperatura ambiente durante5 min. Agite suavemente cada tubo, ocasionalmente, para voltar a suspender as contas liquidadas durante esta incubação.
- Tubos de centrifugação a 225 xg durante 30 seg para sedimentar as pérolas de ouro revestidas com DNA. Remova cuidadosamente o sobrenadante (por pipetagem ou aspiração) e descarte.
- Grânulos Ressuspender completamente em 600 mL de etanol a 100% por lentamente pipetagem cima e para baixo.
- Girar os tubos a 225 xg durante 30 seg para sedimentar as pérolas sem embalagem. Cuidadosamente remover e descartar o sobrenadante.
- Ressuspender as contas de ouro revestidas com ADN em 8 mL de etanol a 100% por lentamente pipetando para cima e para baixo.
- Pipetar as pérolas de ouro revestidas com DNA para o centro do disco biolística em 1 cm de diâmetro e deixe secar.
NOTA: Um círculo ouro seco visível no centro do disco biolística indica que uma concentração suficiente de esferas de ouro está presente.
NOTA: Os discos microtransportador carregados com esferas de ouro revestidas com DNA estão agora prontos para utilização com a pistola de genes.
4. OPERACIONAL o Gene Gun
- Ligue a bomba de vácuo.
- Ligue o gás hélio, girando o botão para a esquerda até uma pressão de aproximadamente 2.200 psi é atingido no manômetro.
- Ligue a arma gene lançando o botão vermelho do lado esquerdo.
- Certifique-se que as taxas de fluxo para o vácuo e a ventilação são ajustados de modo a vácuo atingirá 28 polegadas de Hg no prazo de 15 seg.
- Certifique-se a distância entre o disco de ruptura e microtransportador é de aproximadamente 3/8 de polegada.
- Limpe a câmara inteira limpando-se com etanol.
- Mergulhe os discos de ruptura em etanol 100%. Deixa-se secar sobre uma superfície estéril (por exemplo, uma placa de Petri).
- Use uma chave de torque para soltar o suporte do disco de ruptura. Insira um disco de ruptura limpa para o suporte. Parafuso do suporte do disco de ruptura de volta no lugar e aperte com chave de torque, girando-o uma vez para a direita.
NOTA: Discos de segurança será substituído após cada tiro. - Mergulhe the telas de malha em 100% de etanol. Deixa-se secar sobre uma superfície estéril (por exemplo, uma placa de Petri).
- Depois de seco, coloque uma tela de malha lavado na placa de montagem em plástico branco. Coloque o lado DNA suporte do disco microtransportador para dentro da câmara de disco. Parafuso na tampa de prata, e colocar a placa de montagem na ranhura mais alto.
NOTA: A tela de malha será substituído depois de cada tiro. - Colocar uma placa de agar YPD, contendo 1 M de sorbitol na placa de fundo.
- Feche a porta da câmara e encaixado.
- Empurre e segure o botão vermelho do meio até se envolver vácuo e permitir que o vácuo para chegar a 28 polegadas de Hg. Uma vez que o nível de vácuo adequado é alcançado, mover este interruptor para a posição para baixo. Quando estiver pronto, mantenha pressionado o botão vermelho à direita para disparar. Quando o disco de ruptura aparece, solte imediatamente o botão de fogo e empurre o botão vermelho do meio para a posição do meio para ventilar a câmara a 0 psi.
- Limpe os restos de disco de ruptura e desligar o gene gun. Em seguida, desligue o helium gás girando o botão no sentido horário, e, finalmente, desligar a bomba de vácuo.
5. As células transformadas Galvanização
- Permitir que as placas de transformação para sentar-se à TA durante 4 h, para permitir que as células se recuperar.
- Pipetar 700 l de meio YPD na placa. Use um raspador de células para raspar suavemente as células fora do líquido agar e pipeta em um estéril 1,5 ml microtubo. Repetir esta etapa para assegurar que todas as células foram recuperadas a partir da placa.
- Sedimentar as células a 225 xg durante 30 seg. Retire e elimine o sobrenadante.
- Ressuspender o sedimento em 500 ul de meio YPD.
- Pipete 100 pi da suspensão de células para o centro das placas com antibiótico + YPD e espalhado utilizando esferas de vidro.
- Deixar as placas invertidas a TA durante 3-4 dias. Como colônias aparecer, remendo em novo YPD + placas com antibiótico.
6. Isolamento de ADN genómico para PCR
NOTA: Esta é uma versão modificada usando o reagentes a partir de um kit de purificação de ADN (ver o quadro de Materiais).
- Crescer uma cultura de 5 ml de cada um dos C. neoformans transformantes em meio YPD líquido a 30 ° C com agitação a 250 rpm O / N.
- Agregar 3 ml de células a 900 xg, e ressuspender em 600 ul de solução de lise núcleos.
- Adicionar a suspensão para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml com 200 ul de ácido 0,5 milímetros pérolas de vidro lavadas.
- Homogeneizar durante 45 segundos num mini-beadbeater à temperatura ambiente, o tubo fresco em gelo, e repetir.
- Permitir amostra assente em gelo durante 2 min e transferir o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 ml. Adicionar 200 uL de solução de precipitação de proteína a cada tubo, (100 ul por cada 600 ul de sobrenadante recuperado) e agitar vigorosamente em vórtice durante 20 seg.
- Deixar as amostras em repouso sobre gel durante 5 minutos, e centrifugar a 11.000 xg durante 3 min.
- Transferir o sobrenadante para um tubo de 1,5 ml limpo contendo 300 mL de isopropanol temperatura ambiente. Misture suavemente por inversão.
- Centrifugar as amostras a 11.000 xg por 2 min, retire cuidadosamente o sobrenadante, e drenar os tubos para toalhas de papel.
- Adicionar 300 ul de etanol 70% de RT a cada tubo, e inverter suavemente para lavar o sedimento.
- Centrifugar as amostras a 11.000 xg durante 2 min, e cuidadosamente remover todo o etanol.
- Escorra o tubo sobre toalhas de papel limpo, e permitir que o pellet secar ao ar durante 10-15 min.
- Adicionar 50 ul de solução de re-hidratação de DNA e 1,5 ul de uma solução de ARNase a cada sedimento e vortex.
- Centrifugar as amostras durante 5 segundos para remover todo o líquido da tampa.
- Incubar as amostras a 37 ° C durante 15 min.
- Re-hidratar o ADN por incubação das amostras a 65 ° C durante 1 h.
- ADN quantificar espectrofotometricamente por medição da absorvância a 260 nm (A 260 uma leitura de 1,0 é equivalente a ~ 50 ug / ADN de cadeia dupla ml), e utilizar-se para 200 ng de cada reacção de PCR.
7. Isolamento de ARN paraTranscriptase reversa-PCR.
- Utilizando um kit de purificação de RNA (ver o quadro de Materiais), siga as instruções do fabricante para isolar o ARN a partir de células de levedura usando um minibeadbeater.
- Quantificar a concentração de ARN por medição da absorvância a 260 nm (260 A uma leitura de 1,0 é equivalente a ~ 40 ug / ml de ARN de cadeia simples).
- Utilizando um estojo de RT-PCR (ver o quadro de Materiais), siga as instruções do fabricante para criar reacções de RT-PCR com cerca de 1 ug de ARN. Para os resultados obtidos no presente estudo, utilizar os iniciadores listados na Tabela 1.
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Representative Results
A transformação bem sucedida de biolística C. neoformans pode ser obtida com a seguinte esquema de protocolo (Figura 1). Com a transformação biolística, um ensaio bem sucedida das contas de ouro revestidas é indicado por um anel de ouro visível na chapa após o ADN é tiro (Figura 2A). Colônias deve aparecer dentro de 4 a 5 dias, quando deixada à temperatura ambiente após o plaqueamento das células recuperadas das placas de sorbitol YPD + 1M em mídia seletiva. Transformando 2 ug de ADN deve resultar em 20 a 30 colónias (Figura 2B). Quando as colônias aparecem, eles devem ser semeados em meios seletivos para as colónias individuais.
As colónias individuais podem ser cultivadas em meio YPD, e tanto o ADN e ARN pode ser isolado a partir destas células e analisado por meio de PCR e de RT-PCR para confirmar a integração e expressão adequada. Se este protocolo é utilizado para a fusão do gene marcado, como neste exemplo, os iniciadores t precisao recozimento dentro da região codificadora do gene de interesse (iniciador 2) e dentro da região não codificante 3 'do gene de interesse (iniciador 4) (Figura 3A). Com esta construção, o DNA amplificado a partir da reacção de PCR foi sequenciado para uma confirmação de que a etiqueta de mCherry foi fundido em estrutura ao gene ACK. A confirmação positiva de PCR seria um produto maior de PCR a partir do ADN isolado a partir das células transformadas, em comparação com o ADN isolado das células de tipo selvagem. Uma outra reacção de PCR também teriam de ser conduzida utilizando o conjunto de iniciadores (iniciadores 2 e 5), onde um iniciador emparelha fora da construção e no interior do genoma circundante (iniciador 5) para confirmar a correcta recombinação no locus desejado (iniciador na Tabela 7 1) (Figura 3B). RT-PCR será usado para se certificar de que tanto o gene de interesse e o marcador está sendo ambos expressos (Figura 3C). A sequenciação do RT-PCR indi produto de fusãocates que a etiqueta está correctamente fundida com o gene ao nível do ARN.
Se este protocolo é utilizado para knock out um gene de interesse, conjuntos de iniciadores para PCR deve ser concebido de tal modo que um iniciador hibrida com uma sequência genómica de fora, onde o constructo deve recombinar no genoma, e o outro iniciador hibrida tanto na região de codificação do gene ou no marcador selectivo. A confirmação positiva de que o construto tem sucesso e correctamente recombinada no genoma seria a presença do produto de tamanho correcto para o conjunto de iniciadores que hibridiza dentro do marcador, mas não com o conjunto de iniciadores que emparelha com o gene de interesse. Outro conjunto de iniciadores deveria ser feita, que tem um iniciador que emparelha fora do construto desenhado, que é utilizado com a PCR para confirmar que o evento de recombinação ocorreu no locus correcto. No mesmo desenho, para criar um nocaute, o ARN é isolado a partir de ambas as células transformadas e as células do tipo selvagem (WT), e RT-PCR é realizada para confirmar que nenhuma expressão do gene de interesse é observado a partir das células transformadas.
Porque uma marcação fluorescente foi fundida com o gene de ACK, uma confirmação de que a recombinação foi um sucesso para o local desejado e que o RNA está a ser traduzida em proteínas é através de microscopia de fluorescência (Figura 4). Idealmente, as condições foram já estabelecidas, onde é conhecido que a proteína de interesse é expressa. No entanto, se o sinal fluorescente é demasiado baixo para observar, existe uma possibilidade de que a recombinação ocorreu ainda bem sucedido, mas as condições de crescimento necessita de ser alterada a possibilidade de que as condições óptimas não foram respeitadas para expressão suficiente, o que levaria a uma baixa fluorescente sinal. Isto teria de ser confirmado através de outros métodos, tais como um western blot.
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Figura 1. Esquema de protocolo.
Figura 2A. Grânulos de ouro revestidas com DNA tiro com sucesso sobre uma placa de YPD + sorbitol 1M. Um remendo visto no centro da placa de YPD + sorbitol 1M é devida às pérolas de ouro revestidas com DNA, indicando preparação de ouro adequado, bem como um ensaio bem sucedido . Figura 2B. Transformar 2 mg de resultados de DNA em 20-30 colônias por placa. Se as células foram diluídas conforme mencionado no protocolo, aproximadamente 20-30 colônias são esperados antes de plaqueamento em meio seletivo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3A. Esquemático do ACK: mCherry:.. Construto Neo e desenho de primers Figura 3B PCR utilizado para confirmar a recombinação homóloga bem sucedida. As pistas 1 e 2: Os produtos de PCR obtidos utilizando os iniciadores 2 e 5 (Tabela 1) com ADN genómico de tipo selvagem C. neoformans H99 (pista 1) e o ACK: mCherry estirpe transformada, (pista 2). Tamanhos esperados são 1511 e 5622 pb, respectivamente. As pistas 3 e 4 são os produtos de ADN da C. neoformans H99 (tamanho esperado 1443 pb) e o ACK: mCherry (tamanho esperado 5552 pb) estirpes, respectivamente, utilizando os iniciadores 2 e 4 na Tabela 1. As pistas 5 e 6 são os produtos de ADN da C. neoformans H99 (não deve emparelhar) e ACK: mCherry (esperados tamanho 3016 pb) estirpes, respectivamente, utilizando primers 1 e 3. Figura 3C RT-PCR confirmação da expressão da tag mCherry.. As pistas superiores são os produtos de ADNc do produto ACKmCherry fusão (tamanho esperado 683 pb) amplificados a partir do C. neoformansH99 e o ACK:. MCherry estirpes utilizando os iniciadores 2 e 3 na Tabela 1 O gene da actina foi incluída como um controlo e foi amplificado sob as mesmas condições como ACKmCherry (tamanho esperado de 567 pb), utilizando os iniciadores 6 e 7 na Tabela 1. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. A fluorescência do mCherry tag Ack. A análise microscópica de linhagens produtoras Ack fundido a um tag mCherry com um óptimo excitação a 587 nm e uma óptima emissão a 610 nm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| 1 | KI003 | 5 '- GTA GCG AGG TCT GGA AGC CAC - 3' |
| 2 | ACKmChRT-F | 5'- AAC GCT TTG GCC GGT ACT ACC -3 |
| 3 | ACKmChRT-R | 5'- GAC AGC TTC AAG TAG TCG GGG -3 ' |
| 4 | KI004 | 5 '- GAC TTG GGG AAG AGG AAT TC - 3' |
| 5 | KI0032 | 5 '- CGG GGT ACC ATC AAT AAA AGC TTT CTT CAC TCC - 3' |
| 6 | Actina 1 | 5'- CGC TAT CCT CCG TAT CGA TCT TGC -3 ' |
| 7 | Actina 2 | 5'- CAG CTG GAA GGT AGA AGA CAA GGC -3 ' |
Tabela 1. PCR e RT-PCR primers.
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Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por prêmios da Fundação Nacional de Ciência (Award # 0920274) e da Carolina do Sul Experiment Station Projeto SC-1700340. Este papel isTechnical Contribuição No. 6283 da Estação Experimental da Universidade Clemson. Os autores agradecem ao Dr. Lukasz Kozubowski por seu conselho útil no desenvolvimento deste protocolo final e Dr. Cheryl Ingram-Smith, Katie Glenn, e Grace Kisirkoi por sua leitura crítica do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.6 μm gold beads | Bio-Rad | 165-2262 | http://www.bio-rad.com |
| Spermadine-free base | Sigma- Aldrich | S0266 | https://www.sigmaaldrich.com |
| G418 - Sulfate (Neomycin) | Gold Biotechnology | G-418-10 | www.goldbio.com |
| Hygromycin | Gold Biotechnology | H-270-1 | www.goldbio.com |
| 1350 psi Rupture Discs | Bio-Rad | 165-2330 | http://www.bio-rad.com |
| Stopping Screens | Bio-Rad | 165-2336 | http://www.bio-rad.com |
| Macrocarriers discs | Bio-Rad | 165-2335 | http://www.bio-rad.com |
| YPD Broth | Becton Dickinson & Co. | 242820 | www.bd.com |
| Agar | Becton Dickinson & Co. | 214530 | www.bd.com |
| Sorbitol | Fisher Scientific | BP439 | http://www.fishersci.com |
| PDS-1000/He System | Bio-Rad | 165-2257 | http://www.bio-rad.com |
| Microscope | Zeiss | Axio | http://www.zeiss.com/microscopy |
| KOD One Step PCR Kit | EMD Millipore | 71086-4 | http://www.emdmillipore.com |
| One Step RT-PCR Kit | Qiagen | 210212 | www.qiagen.com |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | www.promega.com |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | www.qiagen.com |
| Mini Beadbeater - 1 | BioSpecs | 3110BX | http://www.biospec.com |
| Microfuge 18 Centrifuge | Beckman Coulter | F241.5P | www.beckmancoulter.com |
| Microplate Spectrophotometer | BioTek | EPOCH | www.biotek.com |
References
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